淫羊藿總黃酮聯合骨營養劑抗骨質疏松作用探討

張冬雪 曲帥 王明月 蘇麗麗 徐晨 闞鴻* 董凱*

1.吉林農業大學中藥材學院,吉林 長春 130118 2.吉林省生物研究所藥用真菌研究室,吉林 長春 130012

骨質疏松癥是一種代謝性骨骼疾病,其特征是骨密度降低和微觀結構破壞導致骨折風險增加[1]。常見的骨質疏松癥類型包括原發性、繼發性和老年性[2]。原發性骨質疏松癥又稱絕經后骨質疏松癥,可能由雌激素缺乏引起破骨細胞活性增強,同時骨形成與骨吸收之間不平衡導致骨質流失[3]。激素療法一直用于預防和治療絕經后骨質疏松癥[4]。然而,長期服用激素會增加心血管疾病和靜脈血栓栓塞的風險[5]。因此,從天然植物中挖掘安全高效的功能性組分改善骨質疏松已成為當前重要的研究方向。

骨營養劑氨基葡萄糖和硫酸軟骨素具有軟骨保護作用,可以預防和改善關節損傷,但兩者聯用治療骨質疏松時,存在起效較慢、用藥劑量大、服用周期長等問題[6]。淫羊藿總黃酮能夠刺激成骨細胞骨形成和減少破骨細胞骨吸收,激活骨重建,是預防或治療與雌激素缺乏相關的骨質疏松癥的有效藥物[7-9],氨基葡萄糖-硫酸軟骨素組合與淫羊藿總黃酮在治療骨質疏松方面是否存在協同增效作用,尚未見報道。

研究發現,骨質疏松的發生發展受多種通路影響,其中PI3K/AKT信號通路是參與炎癥反應、細胞增殖、分化、凋亡及調控骨代謝過程的關鍵通路[10-11]。Toll樣受體4(TLR4)是PI3K/AKT信號通路的上游因子,能夠介導骨髓細胞產生炎癥因子作用于骨代謝[12]。本研究通過建立骨質疏松大鼠模型探討骨營養劑氨基葡萄糖-硫酸軟骨素與淫羊藿總黃酮是否可以通過激活TLR4/PI3K/AKT信號通路發揮協同治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料

40只雌性SD大鼠,質量180～220 g,購自長春億斯實驗動物有限公司,動物許可證號:SCXK(吉)-2020-0001,符合吉林農業大學實驗動物倫理委員會規定;淫羊藿原藥材購于長白山淫羊藿種植基地;氨基葡萄糖(M-AT-1904020),浙江金殼藥業有限公司;硫酸軟骨素(HS1904270),嘉興恒杰生物制藥有限公司;注射用青霉素鈉(F9027101),華北制藥股份有限公司;戊酸雌二醇片(469A);三溴乙醇(LAT20220815),北京萊艾特科技發展有限公司;血清Ca測試盒(N802280G)、血清P測試盒(N802280P),上海酶聯生物科技有限公司;堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨保護素(osteoprotegerin,OPG)、骨鈣素(osteocalcin,BGP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素10(IL-10)檢測試劑盒(11/2022),上海紀寧實業有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1淫羊藿總黃酮提取物的制備:參照文獻[13]中的提取工藝,取淫羊藿葉50 g,加入15倍量的60%乙醇,預浸30 min,70℃回流提取2次,合并濾液,使用大孔樹脂D100對提取液進行純化,調整上樣液濃度為1 mg/mL,6倍柱體積(BV)水除去糖類,5 BV 25%乙醇除去非黃酮類雜質,4 BV 60%乙醇洗脫黃酮類化合物,流速為3 BV/h。洗脫液凍干后得淫羊藿總黃酮提取物干粉,經紫外分光光度法在270 nm波長處測定吸光度值,測得淫羊藿總黃酮含量為80%。

1.2.2造模、給藥及處理:實驗大鼠Sham組僅切除腹腔少量脂肪,其余各組大鼠切除雙側卵巢。術后腹腔注射青霉素預防感染。藥物溶解在0.5%羧甲基纖維素鈉中配成混懸液。Sham組和OVX組灌胃生理鹽水;T組給藥500 mg/kg[14],EV組給藥0.1 mg/kg[15],TG組給藥硫酸軟骨素125 mg/kg,氨基葡萄糖150 mg/kg,淫羊藿總黃酮250 mg/kg(給藥量按人體推薦劑量的10倍折算);灌胃體積10 mL/(kg·d)。每周稱量體重并按體重調整灌胃量,連續給藥8周。實驗結束后,麻醉后頸脫位對所有大鼠進行安樂死,收集股骨和血液樣本。

1.2.3血清生化指標:采用ELISA試劑盒檢測血清ALP、TRAP、OPG、BGP、TNF-α和IL-10水平,微量法測定血清Ca和血清P濃度。

1.2.4骨密度測定:采用Micro-CT儀器對大鼠左側股骨進行掃描,并定量分析骨小梁指標參數。主要測量參數指標包括骨小梁分離度(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(Tb.N)、骨表面積密度(BV/TV)和骨質疏松指數(SMI)。

1.2.5骨生物力學測定:采用萬能材料力學試驗機檢測左脛骨,記錄受試骨組織斷裂前的最大彎曲力及最大彎曲變形,計算彎曲剛度,彈性模量及彎曲應力參數。

1.2.6骨組織病理學檢查:對大鼠右股骨進行蘇木精-伊紅染色(HE)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,觀察股骨的病理學變化和破骨細胞生成情況。

1.2.7免疫組織化學分析:取右股骨進行TLR4、PI3K及AKT免疫組化染色觀察。圖像結果采集后使用Image-J軟件對陽性染色的細胞進行定量,用光密度(AOD)表示。

1.2.8實時熒光定量PCR技術(qRT-PCR)檢測蛋白mRNA相對表達水平:取100 mg股骨組織,首先使用Trizol法提取總RNA,逆轉錄獲得c DNA,并以c DNA為模板進行PCR擴增。反應體系(共20 μL):SYBR熒光染料10μL,上、下游引物各2μL,c DNA模板4μL,無核酸酶水2μL。反應條件:93℃預變性5 min,95℃變性2 min,75℃退火40 s,60℃延伸60 s,循環45次,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參,采用2-△△Ct法計算各目標基因mRNA相對表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information

1.3 統計學分析

實驗結果以平均值±標準差表示,用 Graphpad prism 8.0統計分析軟件進行數據處理,通過單因素方差分析評估各組間的平均差異,P<0.05代表差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠體重和子宮濕重分析

卵巢摘除能夠導致體內的雌激素水平下降。與Sham組相比,手術摘除卵巢的各組大鼠血清中雌二醇水平明顯降低(P<0.05),見圖1A。與Sham組相比,所有處理組的大鼠體重均明顯升高,這是因為卵巢摘除導致大鼠腹部形成脂肪堆積,引起體重增長,而EV組、T組和TG組大鼠體重均小于OVX組,見圖1B。此外,與 Sham 組相比,各實驗組大鼠子宮明顯變小,重量減輕4倍以上(P<0.05);與OVX組相比,給藥后大鼠子宮有所改善,子宮濕重明顯增加(P<0.05);與T組相比,TG組子宮濕重增加顯著(P<0.05),見圖1C。

圖1 各組大鼠血清雌二醇(A)、體重(B)、子宮濕重(C)變化Fig.1 Changes of serum estradiol (A), Weight changes (B), Changes of wet weight of the uterus (C) in rats in each group注:與Sham組相比,***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05;與OVX組相比,##P<0.01,#P<0.05;與T組相比,▲P<0.05。

2.2 血清生化指標

2.2.1大鼠血清礦物質水平比較:由圖2可知,與Sham組相比,OVX組血清P濃度顯著升高(P<0.001),血清Ca濃度顯著降低(P<0.001);與OVX組相比,EV組、T組和TG組血清P濃度明顯降低(P<0.05),Ca濃度明顯升高(P<0.05);與T組相比,TG組血清Ca和P濃度呈顯著性變化(P<0.05)。

圖2 各組大鼠血清礦物質P (A)、Ca(B)水平變化(n=7)Fig.2 Changes of serum mineral P (A) and Ca (B) levels in rats of each group (n=7)注:與Sham組相比,***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05;與OVX組相比,##P<0.01,#P<0.05;與T組相比,▲P<0.05。

2.2.2大鼠骨代謝指標水平比較:由圖3可知,與Sham 組相比,OVX 組大鼠血清中BGP和OPG含量顯著下降(P<0.01),ALP和TRAP含量顯著升高(P<0.01)。經過8周藥物治療可以緩解各項指標因骨質疏松導致的異常變化,與OVX 組相比,EV組、T組和TG組血清中OPG和BGP含量均有明顯升高(P<0.05),血清ALP和TRAP含量顯著降低(P<0.05)。與T組相比,TG組血清BGP含量明顯升高(P<0.05)。OPG呈上升趨勢,但差異不顯著(P>0.05),ALP和TRAP含量均明顯降低(P<0.05)。

圖3 各組大鼠骨代謝指標BGP(A)、OPG(B)、ALP(C)、TRAP(D)變化(n=7)Fig.3 Changes of bone metabolism indexes BGP (A), OPG (B), ALP (C), and TRAP (D) in rats in each group (n=7)注:與Sham組相比,**P<0.01,*P<0.05;與OVX組相比,#P<0.05;與T組相比,▲P<0.05。

2.2.3大鼠炎癥因子水平比較:由圖4可知,與 Sham 組相比,OVX組IL-10的含量明顯下降(P<0.05),而TNF-α的含量升高2倍以上(P<0.001)。與 OVX 組相比,各給藥組血清IL-10含量明顯升高(P<0.05),TNF-α含量明顯降低(P<0.05)。與T組相比,TG組對炎癥的改善效果更顯著(P<0.05)。

圖4 各組大鼠血清炎癥因子IL-10(A)、TNF-α(B)水平變化(n=7)Fig.4 Changes of serum inflammatory factors IL-10(A) and TNF-α(B) in rats of each group (n=7)注:與Sham組相比,***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05;與OVX組相比,##P<0.01,#P<0.05;與T組相比,▲P<0.05。

2.3 骨密度分析

如圖5所示,切除卵巢后,大鼠小梁骨的微結構顯著惡化,骨量有明顯減少,經藥物治療后骨量及骨小梁密度有所增加,其中TG組的效果最顯著。骨微結構參數顯示(圖6),與Sham組相比,OVX組的Tb.N、BV/TV和Tb.Th均明顯降低(P<0.05),SMI和Tb.Sp明顯升高(P<0.05)。與OVX組相比,各給藥組中Tb.N、BV/TV、Tb.Th均明顯升高(P<0.05),SMI和Tb.Sp均明顯降低(P<0.05)。

圖5 各組大鼠股骨干骺端骨小梁微結構CT圖(n=7)注:A:Sham組;B:OVX組;C:EV組;D:T組;E:TG組。Fig.5 CT images of trabecular microstructure in the metaphyseal bone of rats in each group (n=7)A: Sham group; B: OVX group; C: EV group; D: T group; E: TG group.

圖6 各組大鼠骨微結構參數變化(n=7)Fig.6 Changes in bone microstructural parameters in various groups of rats (n=7)注:與Sham組相比,**P<0.01,*P<0.05;與OVX組相比,##P<0.01,#P<0.05。

2.4 骨生物力學指標分析

如圖7所示,OVX組、EV組、T組和TG組脛骨極限負荷、剛度和彈性模量參數較Sham組顯著降低(P<0.05)。與OVX組相比,藥物處理組骨力學參數水平明顯升高(P<0.05)。與T組相比,TG組生物力學指標改善更顯著(P<0.05)。

圖7 各組大鼠生物力學指標最大荷載(A)、剛度(B)、彈性模量(C)水平比較(n=7)Fig.7 Comparison of biomechanical indexes of rats in each group: maximum load (A), stiffness (B) and elastic modulus (C) (n=7)注:與Sham組相比,***P<0.01,**P<0.01,*P<0.05;與OVX組相比,##P<0.01,#P<0.05;與T組相比,▲P<0.05。

2.5 骨組織病理學評價

2.5.1HE染色:如圖8所示,Sham組大鼠骨小梁致密,連續性好,排列整齊;OVX組大鼠骨小梁稀疏,結構紊亂,骨髓孔洞增大,有較多空隙;與OVX組相比,EV組、T組、TG組的股骨骨小梁變粗變密,連接有所增加,骨組織形態呈現好轉。

圖8 各組大鼠骨組織形態學觀察(HE染色×100,n=3)Fig.8 Morphological observation of bone tissue of rats in each group (HE staining×100, n=3)

2.5.2TRAP染色:與Sham組相比,OVX組、EV組、T組和TG組破骨細胞(箭頭)數量顯著升高(P<0.05);與OVX組比,給藥組均可不同程度抑制陽性破骨細胞的形成(P<0.05);與T組相比,TG組破骨細胞數量明顯減少(P<0.05)(圖9)。

圖9 各組TRAP染色,箭頭表示TRAP陽性多核細胞的區域(A),TRAP陽性細胞的定量 (B)(TRAP染色×400,n=3)Fig.9 TRAP staining in each group. The black arrow shows the region of TRAP-positive multinucleated cells (A). Quantification of TRAP-positive cells (B) (TRAP staining×400, n=3)注:與Sham組相比,***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05;與OVX組相比,##P<0.01,#P<0.05;與T組相比,▲P<0.05。

2.6 免疫組化分析

如圖10所示,與Sham組相比,OVX組TLR4陽性表達顯著升高(P<0.01),PI3K和AKT陽性表達顯著降低(P<0.01)。與OVX組相比較,EV組和TG組TLR4陽性表達明顯降低(P<0.05),PI3K和AKT陽性表達明顯升高(P<0.05),而T組中各基因表達不顯著(P>0.05)。

2.7 qRT-PCR 檢測股骨中TLR4/PI3K/AKT信號通路mRNA的表達

與Sham組比較,OVX組的PI3K、AKT mRNA相對表達量均明顯降低(P<0.05),TLR4 mRNA相對表達量顯著升高(P<0.01);與OVX組比較,各給藥組的PI3K、AKT mRNA相對表達量均顯著升高(P<0.05),TLR4 mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05);與T組比較,TG組TLR4 mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05),PI3K mRNA相對表達量顯著升高(P<0.05),AKT mRNA表達水平也有所升高但不顯著(圖11)。

圖11 相關基因TLR4(A)、PI3K(B)、AKT(C) mRNA表達(n=3)Fig.11 mRNA expressions of related genes TLR4 (A), PI3K (B), AKT (C) (n=3)注:與Sham組相比,***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05;與OVX組相比,###P<0.001,##P<0.01,#P<0.05;與T組相比,▲P<0.05。

3 討論

絕經后雌激素水平低,會致使骨量下降和骨組織結構退化[16]。在骨代謝指標中,骨形成標志物BGP和OPG均參與骨吸收的調節;ALP與骨基質礦化相關,抑制ALP活性有利于骨形成;TRAP由成熟的破骨細胞在骨吸收過程中分泌,反映骨吸收速率;骨基質中鈣磷代謝也參與調控骨質疏松,血清Ca和血清P濃度呈負相關,當低磷高鈣穩態被打破時,會導致骨重建紊亂[17]。相關研究還發現,TNF-α可作用于骨代謝,誘發破骨細胞前體細胞的分化、成熟,IL-10則具有抑制破骨細胞的重聚和活化,激活免疫調節作用,可以改善大鼠關節炎癥,防治骨破壞[18-19]。大量研究表明,PI3K/AKT信號通路參與調節骨形成,進而控制骨密度平衡[20-21]。TLR4是一種先天免疫應答的模式識別受體,可以干擾骨細胞的正常功能,是加重骨質疏松癥的上調因素[22]。雌激素缺失會激活上游TLR4信號通路,造成免疫級聯效應,過度的激活可誘發破骨細胞大量增殖,而下游PI3K/AKT信號通路的活化可改善骨丟失,TLR4與PI3K/AKT通路呈現負相關[23-24]。

硫酸軟骨素是關節軟骨細胞外基質的主要成分,具有改善軟骨基質的合成與分解平衡作用[25]。氨基葡萄糖可刺激糖胺聚糖合成,具有增加成骨細胞的活性和促進新骨形成的作用[26]。二者被廣泛用于恢復軟骨功能,縮小關節間隙和緩解癥狀[27]。淫羊藿總黃酮能夠顯著降低骨小梁的分離度、增加骨密度和改善骨微結構[28-29]。本研究結果顯示,OVX組大鼠骨密度低于Sham組,表明大鼠去卵巢后雌激素缺乏進而導致骨量丟失,而給藥處理后大鼠骨密度增加。與Sham組相比,OVX組大鼠血清P、ALP、TRAP和TNF-α水平明顯升高,血清Ca、BGP、OPG和IL-10水平明顯降低,表明去勢大鼠會增加破骨細胞活性,影響成骨細胞生成,而給藥治療后骨形成與骨吸收之間的平衡得到改善,聯合給藥效果更佳。此外,淫羊藿總黃酮聯用骨營養劑可以減弱TLR4 mRNA的表達,并減弱相應基因的表達,增強PI3K和AKT mRNA的表達,進而改善骨代謝。

綜上,淫羊藿總黃酮與骨營養劑氨基葡萄糖-硫酸軟骨素聯合使用可以提高去卵巢骨質疏松大鼠骨密度,改善骨代謝,并通過激活TLR4/PI3K/AKT信號通路發揮協同治療骨質疏松的作用。