結直腸癌組織中MMR蛋白表達、MSI、RAS和BRAF基因突變與臨床病理特征的關系*

向林果,譚憬一,姚 遠,孫雪琴,張陽麗

重慶醫科大學附屬第一醫院臨床分子醫學檢測中心,重慶 400016

結直腸癌(CRC)是我國常見的惡性腫瘤之一,其發病率和病死率分別位于惡性腫瘤的第2位和第5位,且呈逐漸上升趨勢[1]。CRC的發生、發展涉及多個基因和多條細胞信號傳導通路,是由一系列復雜的遺傳和表觀遺傳事件逐步累積所致[2-3]。相關分子標志物的檢測不僅可作為CRC篩查的有效補充,還在用藥方案選擇、預后判斷及療效預測等方面起到關鍵作用。

錯配修復(MMR)蛋白、微衛星不穩定性(MSI)、大鼠肉瘤(RAS)基因和致癌同源體B1(BRAF)基因突變已被公認是影響CRC患者個體化治療策略的主要標志物[4]。此前雖有研究報道了關于MMR蛋白、MSI、RAS和BRAF基因在CRC患者中的表達情況,但由于病例納入標準的差異,標志物組合不同和臨床資料的覆蓋度不同以及樣本量的限制,研究結果不盡相同[5-6]。因此,本研究分析了352例CRC患者的病理標本和詳細的臨床資料,旨在更完整地探討MMR蛋白表達、MSI、RAS(含KRAS和NRAS)基因和BRAF基因突變與各臨床病理特征的關系,以及RAS和BRAF基因分別與MMR蛋白表達和MSI的關系,為CRC患者的個體化治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集本院2022年1-12月352例病理診斷明確、臨床病歷資料完整患者(CRC組)的CRC組織和血液標本,以及42例非CRC的其他實體瘤患者(非CRC組)癌組織和血液標本。非CRC的其他實體瘤包括膽管癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌等共計42例。所有患者未接受放化療、靶向或免疫治療,未合并其他腫瘤。患者和家屬對本次研究均知情同意,并簽署知情同意書。本研究通過本院醫學倫理委員會的審核批準(倫理審批號:K2023-566號)。CRC組和非CRC組研究對象之間性別、年齡、病理特征等比較,差異均無統計學意義(P>0.05),具有可比性。見表1。

表1 兩組患者的臨床及病理特征比較[n(%)]

1.2儀器與試劑 儀器:全自動免疫組化染色儀(Dakocytomation)、基因測序儀(ABI 3500Dx)、熒光定量PCR儀(SLAN 96S)、移液器(Eppendorf)、紫外分光光度計(NanoDrop One)、全自動核酸提取儀(奧盛Auto-Pure 32A)、渦旋混勻器(其林貝爾 QB-328)、微型高速離心機(Mini-15K)、恒溫金屬浴(奧盛 MiniT-H2C)。試劑:友芝友人類KRAS基因7種突變檢測試劑盒、人類NRAS基因突變檢測試劑盒、人類BRAF基因V600E突變檢測試劑盒、新百基FFPE核酸提取或純化試劑盒、桐樹MSI檢測試劑盒、福州邁新抗體。

1.3方法

1.3.1MMR蛋白表達檢測 使用全自動免疫組化染色儀檢測394例癌組織標本MMR蛋白(含MSH2、MSH6、MLH1、PMS2)表達。MSH2、MSH6、MLH1和PMS2四者均表達為(+)判斷為錯配修復功能完整(pMMR),任意一種表達為(-)則判為錯配功能修復缺陷(dMMR)。

1.3.2KRAS、NRAS和BRAF基因突變檢測 每個癌組織標本制備3張8 μm厚的石蠟切片用于核酸提取,1張4 μm白片用于HE染色。HE染色后由兩位病理醫師鏡下閱片標識出腫瘤細胞比例>20%的區域。于HE染色片腫瘤富集區域刮取3張白片對應區域組織用于DNA提取。采用全自動核酸提取儀進行DNA提取并采用紫外分光光度計測得DNA標本的濃度和純度。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)技術檢測標本DNA中KRAS基因第2外顯子,NRAS基因第2、3、4號外顯子,BRAF基因第15號外顯子的熱點突變。DNA標本的提取、稀釋、加樣、擴增程序和結果判讀均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.3MSI檢測 采用一代測序片段分析法(熒光PCR-毛細管電泳法),使用MSI檢測試劑盒對所有患者腫瘤組織和血液標本進行MSI檢測。試劑盒覆蓋5個MS位點(BAT-25、BAT-26、D5S346、D2S123、D17S250)。結果判定:≥2個MS位點不穩定為高度微衛星不穩定(MSI-H);1個MS位點不穩定為低度微衛星不穩定(MSI-L);若5個MS位點均穩定,則為微衛星穩定(MSS)。

1.4統計學處理 采用SPSS25.0統計軟件處理和分析數據。計數資料采用例數或百分率表示,突變狀態及臨床特征單因素分析采用χ2檢驗,當理論數1≤T<5時用連續性校正χ2檢驗;當T<1或n≤40時,用Fisher確切概率法;多因素Logistic回歸分析基于單因素分析結果。采用一致性檢驗(Kappa值)統計分析免疫組化法檢測MMR蛋白和熒光PCR-毛細管電泳法檢測MSI結果的一致性程度:Kappa值<0表示極差;0～0.2表示微弱;>0.2～0.4表示弱;>0.4～0.6表示中度;>0.6～0.8表示高度;>0.8～1.0表示極強。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1MMR蛋白表達,MSI,KRAS、NRAS、BRAF基因突變情況 352例CRC患者中dMMR檢出率為8.2%,4種MMR蛋白(MSH2、MSH6、MLH1、PMS2)的缺陷檢出率分別為0.9%、1.7%、4.5%和6.8%。MSI-H檢出26例,MSI-L檢出3例,MSS共323例。

KRAS、NRAS、BRAF基因突變率依次為45.7%、3.7%、3.1%;NRAS基因只檢出G12D和Q61R位點突變,未發現KRAS、NRAS、BRAF基因之間存在交叉突變。42例非CRC的腫瘤患者dMMR檢出率、MSI-H檢出率、KRAS和NRAS基因突變率依次為2.4%、4.8%、23.8%、2.4%,未檢出BRAF基因突變。與非CRC組相比,CRC組的KRAS基因突變率顯著升高(P<0.05),兩組MMR蛋白表達,MSI、NRAS和BRAF基因突變情況比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 dMMR,MSI-H以及KRAS、NRAS、BRAF常見基因突變類型分析[n(%)]

2.2不同臨床病理特征CRC癌組織中MMR蛋白表達,MSI,KRAS、NRAS、BRAF基因突變狀態 352例CRC患者的5種分子標志物與臨床病理特征關系的分析結果顯示:年齡≤50歲、黏液腺癌、原發于右半結腸的患者dMMR檢出率更高(P<0.05);MSI-H多見于年齡≤50歲、有腫瘤家族史、黏液腺癌、原發于右半結腸、TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結轉移的患者(P<0.05)。KRAS基因高突變率的臨床特征表現為女性、無吸煙史、黏液腺癌(P<0.05);NRAS基因僅在有淋巴結轉移的患者中突變率升高(P<0.05);BRAF基因突變率在低分化和原發于右半結腸的患者中更高(P<0.05)。見表3。

將單因素分析中差異有統計學意義的變量納入多因素Logistic回歸模型。由于在單因素分析中只有淋巴結轉移與NRAS基因突變有關,因此在多因素分析中排除了NRAS基因突變。多因素Logistic回歸分析結果顯示,黏液腺癌患者更易發生KRAS基因突變(P<0.05);低齡、有腫瘤家族史的右半結腸癌患者更易表現出MSI-H(P<0.05);dMMR和BRAF基因突變多因素分析結果與單因素分析一致。見表4。

表4 影響MMR蛋白表達,MSI,KRAS、BRAF基因突變的多因素分析

2.3不同MMR蛋白表達和MSI狀態下RAS和BRAF基因突變情況 352例CRC患者中,KRAS、BRAF基因突變與dMMR有關,與pMMR患者相比,dMMR患者KRAS基因突變率降低而BRAF突變率顯著升高(P<0.05)。MSI-H的患者同樣具有更高的BRAF基因突變率(P<0.05),而KRAS和NRAS基因突變率與MSI狀態無關(P>0.05)。見表5。

表5 不同MMR蛋白表達和MSI狀態下RAS和BRAF基因突變情況分析[n(%)]

2.4MMR蛋白檢測與MSI檢測一致性分析 將MSS和MSI-L劃為一組,dMMR對應MSI-H,pMMR對應MSS或MSI-L,分析免疫組化法檢測MMR和熒光PCR-毛細管電泳法檢測MSI結果的一致性。兩組共394份標本中,MMR蛋白檢測和MSI檢測結果相符的共有378例,總體相符率為95.9%,Kappa一致性檢驗結果表明,兩種檢測方法檢測結果高度一致(Kappa=0.702,P<0.001)。結果不一致標本中有9例免疫組化檢測為dMMR,PCR-毛細管電泳結果為MSS;7例PCR-毛細管電泳結果為MSI-H,免疫組化顯示pMMR。

3 討 論

MMR基因的主要功能是修復DNA復制和重組過程中的堿基錯配,以確保基因結構的穩定性,其編碼的最重要的蛋白家族包括MSH2、MSH6、MLH1和PMS2。dMMR可引起微衛星復制錯誤、不能被修復,導致微衛星長度改變,從而表現為MSI。既往研究已經證實,MMR基因突變或高甲基化和MSI不僅是林奇綜合征的主要原因,也是CRC的重要發病機制之一[2,7]。本研究顯示,dMMR在CRC患者中的檢出率為8.2%,與之前報道3%～13%的亞洲CRC患者表現出dMMR狀態的結果相符[8];MSI-H檢出率為7.4%,略低于dMMR檢出率。在本研究中,與dMMR和MSI-H高檢出率有關的共同臨床病理因素為低齡和原發部位為右半結腸癌,表明dMMR和MSI-H與CRC疾病早發性和原發部位有關。也有研究報道,TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的無淋巴結轉移的CRC患者中MSI-H的發生率較高[9-10],這與本研究中MSI的單因素分析結論相符。但在多因素Logistic回歸分析中,與MSI相關因素排除了病理學類型、分期和淋巴結轉移,顯示有腫瘤家族史的患者更容易發生MSI-H,黏液腺癌更容易發生dMMR。

既往研究發現,dMMR或MSI-H的CRC患者中BRAF V600E突變和MLH1啟動子甲基化與散發性CRC密切相關[11-12]。本研究顯示,BRAF V600E突變與dMMR和MSI-H密切相關,其突變率在dMMR和MSI-H患者中明顯高于pMMR和非MSI-H(MSS和MSI-L)患者。因此,當CRC患者單獨檢測到MSI-H或MLH1缺失時,有必要進行BRAF基因突變和(或)MLH1啟動子甲基化的后續檢測,如有BRAF V600E突變則不能確診為林奇綜合征。有報道指出,在dMMR或MSI-H的轉移性CRC患者中,若存在BRAF基因突變則提示生存率更差,而RAS基因突變可能與生存率無關[13]。

盡管MMR蛋白表達和MSI反映的是同一生物學事件,但本研究中MMR蛋白表達和MSI與臨床病理特征的關系仍存在略微不同,這可能是由于兩種標志物檢測結果不完全一致所致。同一標本出現免疫組化結果為pMMR而熒光PCR-毛細管電泳法結果為MSI-H這種情況的原因:一方面可能是MMR蛋白的基因發生變異,這些變異雖不影響蛋白的抗原結構,但卻能影響其MMR功能,導致微衛星位點MMR失敗;另一方面可能是其他MMR蛋白(除外MSH2、MSH6、MLH1和PMS2這4種主要的MMR蛋白)的缺失亦會影響微衛星的穩定性,表現出pMMR而微衛星不穩定[14]。當然,由于MMR蛋白之間存在功能重復(PMS2和PMS1、MSH6和MSH3),當孤立性的MSH6缺失時,MSH3可以功能性替代部分MSH6,活化MMR系統而繼續保留MSS狀態,從而表現為dMMR而MSS[14]。此外,免疫組化法依賴于染色過程,染色質量不佳會影響結果準確判讀,同一份標本不同的切取角度也有可能造成兩種檢測結果不一致。因此,為提高檢測準確性,不管是在林奇綜合征的篩查時,還是CRC患者治療指導時,建議進行MMR蛋白和MSI聯合檢測,相互補充。

表皮生長因子受體(EGFR)是臨床上治療CRC的主要靶點之一。KRAS、NRAS和BRAF基因是EGFR依賴的下游絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路中的3個關鍵分子,這些基因的突變可導致MAPK通路的激活,促進大多數癌細胞增殖和抗凋亡,使EGFR受體抑制劑無效。臨床研究表明,MSS、RAS和BRAF基因野生型的轉移性CRC患者能從抗EGFR單抗治療中獲益[15]。本研究中KRAS基因第2外顯子突變率為45.7%,與文獻[16]報道結果相近。在單因素分析中,與KRAS基因突變有關的臨床病理參數為女性、黏液腺癌和無吸煙史,但多因素Logistic回歸分析顯示,僅黏液腺癌是KRAS基因突變的獨立影響因素。已有研究報道,由于CRC中KRAS等位基因的多樣性,不同KRAS基因突變可能具有不同的預后,但導致預后不同的原因尚不清楚。其中KRAS基因第2外顯子12號密碼子G12C已被證明與較差的總生存率相關[17-18]。NRAS基因突變較少發生,本研究中CRC組NRAS基因突變檢出率為3.7%,有淋巴結轉移的患者NRAS基因突變率高于無淋巴結轉移者(P=0.010),有腫瘤家族史和MSI-H的CRC患者未檢測出NRAS基因突變。筆者推測NRAS突變可能與淋巴結轉移、腫瘤家族史及MSI有一定關系,但因本次NRAS基因突變例數較少,有待增加病例數進一步分析證實。

BRAF基因編碼一種RAF激酶蛋白,參與調控細胞生長、增殖、分化和凋亡等過程,其突變狀態與多種腫瘤的發生、發展和臨床預后相關。BRAF基因V600E突變往往被認為是腫瘤侵襲性的標志,與BRAF野生型相比,它是轉移性CRC患者預后不良和總生存期更短的危險因素[19]。本研究中,CRC組BRAF基因V600E突變率為3.1%,低于西方人群8%～12%的突變率[20],但與之前報道的中國CRC患者BRAF基因突變率相當[21],進一步證實CRC患者BRAF基因突變在中國和西方人群存在種族差異。本研究顯示BRAF基因在低分化、原發于右半結腸的患者中突變率高,但未發現與淋巴結轉移和遠處轉移等其他不良預后的臨床病理特征有關。BRAF和RAS基因同處于RAS-RAF-MAPK通路,突變結果相互排斥,本研究未發現RAS和BRAF基因同時發生突變。

毋庸置疑,MMR蛋白,MSI,以及KRAS、NRAS、BRAF基因已經成為需要新輔助治療和轉移性CRC腫瘤患者的常規檢測項目[4]。隨著分子診斷技術的飛速發展,適用于腫瘤早篩早診的分子標志物也得到越來越多的關注和重視。硫酸類肝素蛋白多糖2(SDC2)、隔膜蛋白9(SEPT9)、組織因子通路抑制因子2(TFPI2)基因被認為是潛在的CRC早篩分子標志物,特別是糞便標本SDC2基因甲基化檢測,有望普及作為一種新的無創的高靈敏度、高特異度的CRC輔助診斷方法[22]。循環腫瘤細胞(CTC)檢測也是一種理想的臨床腫瘤液體活檢技術,可提供CRC患者疾病狀態的實時信息,有助于CRC的預后評估、治療反應監測、復發轉移風險評估等。

綜上所述,本研究分析了CRC患者的MMR蛋白,MSI,以及KRAS、NRAS、BRAF基因共5個分子標志物,發現它們與多種臨床病理特征相關。這些發現為CRC的臨床診斷和個體化精準治療提供了額外的支持。本研究也存在不足,缺乏這些患者的臨床治療和預后的數據,不能分析這些分子標志物與療效或預后之間的關系,下一步將繼續完善隨訪數據,進行更深入全面的探討。