紫胡蘿卜復合發酵飲料的研制及其揮發性風味物質分析

袁辛銳，楊其長，王 芳，林致通,2,

（1.中國農業科學院都市農業研究所，四川成都 610065；2.四川天味食品集團股份有限公司，四川成都 610200）

羽衣甘藍是十字花科蕓薹屬甘藍種的一個變種[1]，一種高營養、低熱量、高膳食纖維的蔬菜，被稱為“超級食物”[2]。其富含多種維生素和礦物質，尤其Ca、Fe、P 含量突出[3]，含有異硫氰酸酯、多酚、類胡蘿卜素等生物活性成分，有助于抗氧化[4]、抗炎[5]、抗癌[6]。冰菜（Mesembryanthemum crystallinum）別名冰葉日中花、冰草，屬番杏科（Aizoaceae）[7]，葉面底部和莖上附著大量包含鹽類的細胞[8]，自身帶微咸味，口感清脆，富含礦物質和維生素，黃酮類化合物含量也較高[9-10]，具有保護肝臟、抗痘、抗病毒的功效[11]。紫胡蘿卜由于富含花青素而呈現紫色，花青素是迄今為止發現的抗氧化性較強的天然活性物質之一，屬于多酚類化合物，具有顯著的抗氧化、抗菌、抗炎功效、改善視力[12]等功效。

目前對羽衣甘藍、冰菜和紫胡蘿卜的研究多集中在種植技術和品種鑒定上，除鮮食外，其食用價值未被充分開發利用[13]。近年來發酵果蔬飲品受到消費者的喜愛[14]，因為蔬菜水果經發酵后，不僅營養吸收效率得到顯著提高[13]，同時，果蔬飲料含大量益生菌，能夠調節腸道菌群[15]，維持腸道健康[16-17]。對于發酵飲料的研究也逐漸深入，比如王紫琳等[18]、王鑫等[19]分別優化了雪蓮果、清澗紅棗發酵飲料的發酵參數，但對于蔬菜發酵飲料，尤其是以羽衣甘藍、冰菜和紫胡蘿卜的復合飲料發酵工藝鮮有研究。因此，亟需對此開展深加工技術，提升產品附加值。

本研究以羽衣甘藍、冰菜和紫胡蘿卜為主要原料，以安琪乳酸菌為發酵劑，制備紫胡蘿卜復合發酵飲料，以總糖、總酸、乳酸菌活菌數及感官評分為指標，利用單因素實驗和正交試驗，研究了紫胡蘿卜復合發酵飲料的最佳工藝參數，并探討了發酵飲料的揮發性風味物質，旨在釀造一款口感佳、營養豐富的發酵飲料，為蔬菜發酵飲料的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冰菜、羽衣甘藍、紫胡蘿卜、白砂糖 購自超市；乳酸菌 安琪酵母股份有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、硫酸銅、氯化鈉、葡萄糖 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；MRS 培養基 北京索萊寶科技有限公司。

MJ-BL1206A 破壁機、SN2105T 電磁爐 美的集團有限公司；HWS-250 恒溫培養箱 紹興蘇珀儀器有限公司；XHF-D-XZ 高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；TD50002A 電子天平 寧波市鄞州華豐儀器廠；SW-CJ-2FD 超凈工作臺 上海尚道儀器制造有限公司；QP2010Ultra 氣相色譜-質譜儀（Gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫胡蘿卜復合發酵飲料的制備

1.2.1.1 工藝流程 原料→清洗→漂燙→打漿→過濾→調配→均質→煮沸殺菌→冷卻→接種→發酵→成品

1.2.1.2 操作要點 漂燙：將清洗干凈的羽衣甘藍進行漂燙，漂燙溫度100 ℃，時間1 min，料液比1:30（g:mL）。

打漿：將處理好的羽衣甘藍、冰菜和紫胡蘿卜分別以料液比1:2 的比例與純凈水混合后打漿。

過濾：將蔬菜漿過100 目紗布得到濾液。

調配：將羽衣甘藍、冰菜和紫胡蘿卜三種蔬菜汁以質量比5:5:1 混合，加入蔬菜汁總質量7%的糖并混合均勻。

均質：常溫下用4000 r/min 均質1 min。

殺菌：將混合液加熱，直至煮沸。

接種：待混合液冷卻到40 ℃，按7‰的比例加入發酵劑，并攪拌均勻。

發酵：在40 ℃恒溫條件下發酵36 h 后結束發酵。

1.2.2 單因素實驗 根據前期實驗結果選取糖添加量、乳酸菌接種量、發酵溫度和發酵時間來進行單因素實驗。

1.2.2.1 糖添加量 設定糖添加量分別為4%、5%、6%、7%、8%，接種量為7‰，發酵溫度為40 ℃，發酵時間為36 h 進行發酵，研究不同糖添加量對紫胡蘿卜復合發酵飲料品質的影響。

1.2.2.2 乳酸菌接種量 設定乳酸菌接種量分別為4‰、5‰、6‰、7‰、8‰，糖添加量為7%，發酵溫度為40 ℃，發酵時間為36 h 進行發酵，研究不同乳酸菌接種量對紫胡蘿卜復合發酵飲料品質的影響。

1.2.2.3 發酵溫度 設定發酵溫度分別為38、39、40、41、42 ℃，糖添加量為7%，接種量為7‰，發酵時間為36 h 進行發酵，研究不同發酵溫度對紫胡蘿卜復合發酵飲料品質的影響。

1.2.2.4 發酵時間 設定發酵時間分別為30、32、34、36、38 h，糖添加量為7%，乳酸菌接種量為7‰，發酵溫度為40 ℃進行發酵，研究不同發酵時間對紫胡蘿卜復合發酵飲料品質的影響。

1.2.3 正交試驗 在單因素實驗的基礎上，選擇對實驗結果影響較大的糖添加量（A）、乳酸菌接種量（B）、發酵溫度（C）、發酵時間（D）4 個因素進行L9（34）正交優化試驗。因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平設計Table 1 Factors and levels for orthogonal experiments

1.2.4 理化指標的測定 總糖的測定：按照GB 5009.7-2016 采用滴定法，還原糖以葡萄糖計。總酸的測定：按照GB/T 12293-90 采用滴定法，總酸以乳酸計。膳食纖維的測定：按照GB 5009.88-2014《食品中膳食纖維的測定》方法測定。乳酸菌數：MRS 培養基平板計數法。

1.2.5 揮發性風味物質的測定 參照楊定寬等[20]的方法進行測定。

1.2.5.1 樣品的前處理 將3 mL 樣品加入頂空瓶中，于60 ℃條件下萃取55 min。

1.2.5.2 GC 條件 色譜柱：SH-Rtx-Wax 強極性毛細管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；45 ℃保持3 min，以3 ℃/min 升溫至180 ℃，保持3 min，接著以12 ℃升溫至220 ℃，保持3 min；載氣（He）流速1.67 mL/min，壓力19.0 kPa；分流比10:1。

1.2.5.3 MS 條件 質譜條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；離子源溫度200 ℃；溶劑延遲：3 min；增益系數：1.16；質量掃描范圍m/z 35～500。

1.2.6 感官評價 參照葛永輝等[21]的方法制定發酵飲料的感官評分標準，產品在4 ℃下貯藏24 h，請10 位專業人員根據產品的色澤、澄清度、香氣、滋味進行評分，滿分100 分，評分標準見表2。

表2 紫胡蘿卜復合發酵飲料感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standards of purple carrot compound fermented beverage

1.3 數據處理

所有試驗重復3 次，結果均采用平均值±標準偏差的表示方法。數據統計使用Excel 2010 軟件進行，采用SPSS 25.0 軟件進行數據顯著性分析（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 糖添加量對紫胡蘿卜復合發酵飲料品質的影響 糖是乳酸菌生長代謝可利用的底物，乳酸菌可通過轉化酶將糖水解為葡萄糖和果糖，從而利用這種碳源[22]。如表3 所示，隨著糖添加量的增加，總糖含量逐漸上升，膳食纖維含量無明顯差異，總酸含量先升高后趨于穩定，活菌數和感官評分先升高后降低。發酵過程中飲料中的乳酸不斷積累使總酸含量大量增加[23]。糖添加量為4%～5%時，添加量較低，不足以為微生物生長增殖提供充足的能量，導致部分微生物的死亡[24-25]，從而影響了活菌數及其產酸能力，因此總酸含量、活菌數和感官評分均較低。糖添加量為5%～7%時，乳酸菌大量增殖，活菌數和總酸含量上升，活菌數在7%時達到最大值；糖添加量為7%～8%時，添加量過多，飲料的滲透壓增大，抑制了乳酸菌的生長和代謝，從而影響乳酸的繼續產生[26]。糖添加量對飲料的感官評分影響重大，添加量過低會導致在發酵時間內無法形成特殊的發酵風味，導致蔬菜本身的味道過重；添加量過高則會因為甜度過高，掩蓋了發酵飲料的特殊風味；在添加量為7%時，飲料的糖酸比適宜，感官評分最高。因此，紫胡蘿卜復合發酵飲料的適宜糖添加量為7%。

表3 糖添加量對紫胡蘿卜復合發酵飲料品質的影響Table 3 Effects of sugar addition on the quality of purple carrot compound fermented beverage

2.1.2 接種量對紫胡蘿卜復合發酵飲料品質的影響

如表4 所示，隨著接種量的增加，總酸、活菌數逐漸升高，總糖持續減少，感官評分先升高后降低，膳食纖維含量無明顯變化，說明膳食纖維并非由微生物發酵獲得。當接種量為4‰時，由于乳酸菌含量較低，產酸量較低，飲料風味物質積累少，糖消耗量低、總糖含量較高導致整體感官偏甜且有異味，因此感官評分也較低。當接種量為5‰～6‰時，飲料中的總酸逐漸上升，總糖含量逐漸降低，說明在一定的接種量下，總酸含量與接種量呈正相關，總糖含量與接種量呈負相關。當接種量在7‰～8‰時，飲料的總酸上升趨勢不明顯，活菌數持續增加，但感官評分稍有降低，在接種量7‰時達到最高。這是由于乳酸菌是發酵飲料中的優勢菌種，適宜的接種量使發酵液充分發酵[27]，同時乳酸菌能夠通過降低pH 和提高CO2水平來減少雜菌的干擾[28]，保證了飲料的良好口感；但當接種量過大時，營養物質消耗過快，同時產生醇類、醛類等刺激性氣味，從而影響飲料的口感[29]。當接種量為7‰時，酸度適中，總糖較低，活菌數較高，感官評分最高。因此，紫胡蘿卜復合發酵飲料的適宜接種量為7‰。

表4 乳酸菌接種量對紫胡蘿卜復合發酵飲料品質的影響Table 4 Effect of lactic acid bacteria inoculation amount on the quality of purple carrot compound fermented beverage

2.1.3 發酵溫度對紫胡蘿卜復合發酵飲料品質的影響 如表5 所示，隨著發酵溫度的增加，飲料中的膳食纖維含量變化不明顯，總酸含量和活菌數呈現增加趨勢，總糖含量大幅度降低，感官評分先增加后減少。發酵溫度過高或過低都會影響菌種的生長代謝。當發酵溫度為38～39℃時，低于微生物的適宜發酵溫度時，微生物細胞內酶活下降，影響產酸能力和發酵速度，不利于乳酸菌的生長，導致總酸含量、活菌數及感官評價較低[30-31]；當溫度為41～42℃時，高溫會抑制菌體生長代謝甚至導致菌種死亡，使雜菌污染的概率升高。此外，高溫脅迫使乳酸菌發酵能力被抑制[32]，風味物質的積累減少，同時高溫會導致發酵液損失更多的芳香揮發性物質[33]，導致感官評分較差。因此發酵飲料最適發酵溫度為41 ℃，在此溫度下乳酸菌活菌數較高，感官評分最高。

表5 發酵溫度對紫胡蘿卜復合發酵飲料品質的影響Table 5 Effects of fermentation temperature on the quality of purple carrot compound fermented beverage

2.1.4 發酵時間對紫胡蘿卜復合發酵飲料品質的影響 從表6 可看出，總糖隨著發酵時間的延長逐漸減少，總酸逐漸增加，活菌數先增加后趨于穩定，膳食纖維含量無明顯變化，感官評分先增大后略微降低。有研究表明，在適宜接種量下，隨著發酵時間的增加，乳酸菌活菌數增加趨勢先緩慢后快速，最后趨于穩定[34]。如表6 所示，在30～32 h 區間活菌數增加較慢，32～36 h 區間增速上升，而36～38 h 活菌數增加速度緩慢，在38 h 時活菌數最高。其原因可能是32 h 前為調整期，乳酸菌為適應環境，主要活動為增殖，產酸少，風味不佳，感官評分低；32～36 h 區間為對數期，菌體生長迅速，代謝加強，總酸含量逐步升高；36～38 h 區間為成熟期，菌體總數穩定，一定時間內烯烴物質（不良風味來源）減少，有機酸、氨基酸和各種芳香族化合物生成[35]，使得總酸和風味物質積累較多，但發酵時間過長不良風味物質積累，產酸過多，導致感官評分下降。在當發酵時間為36 h 時，感官評分最高，飲料風味協調，活菌數也較高。因此，飲料的最佳發酵時間為36 h。

表6 發酵時間對紫胡蘿卜復合發酵飲料品質的影響Table 6 Effects of fermentation time on the quality of purple carrot compound fermented beverage

2.2 正交試驗

通過單因素實驗，選擇糖添加量（A）、乳酸菌接種量（B）、發酵溫度（C）、發酵時間（D）作為考察因素，以感官評分作為評價指標，進行4 因素3 水平的正交試驗，試驗結果及方差分析見表7 和表8。

表7 紫胡蘿卜復合發酵飲料發酵工藝優化正交試驗結果與分析Table 7 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation technology optimization of purple carrot compound fermented beverage

表8 正交試驗結果方差分析Table 8 Variance analysis of orthogonal experiment results

由表7 極差分析結果可知，4 種因素對紫胡蘿卜復合發酵飲料的感官評分影響的強弱順序依次為：發酵溫度＞糖添加量＞發酵時間＞乳酸菌接種量。由表8方差分析結果可知，糖添加量和發酵溫度對紫胡蘿卜復合發酵飲料的感官評分的影響極顯著（P＜0.01），發酵時間也對其影響顯著（P＜0.05），但乳酸菌接種量對其的影響不顯著（P＞0.05）。

實驗結果表明紫胡蘿卜復合發酵飲料的最優發酵條件為A2B1C3D3，即糖添加量7%，乳酸菌接種量5‰，發酵溫度41 ℃、發酵時間38 h，但正交試驗中未發現有此組合，對該組合進行驗證，驗證所得總糖含量0.21 g/L，總酸含量0.38 g/L，膳食纖維含量0.41 g/L，活菌數7.42×107CFU/g，感官評分最高為93.3 分。

2.3 揮發性風味物質的組成及含量分析

由表9 可知，紫胡蘿卜復合發酵飲料中，檢測出71 種揮發性風味物質。包括22 種醇類、16 種酮類、15 種醛類、8 種酯類、3 種酸類，以及其他化合物7 種。含量最高的是酮類化合物，為32.24%，其次是醛類化合物，為31.61%，然后是醇類化合物、酸類化合物、其他化合物及酯類化合物，其分別為16.27%、14.09%、3.36%、2.43%。

表9 紫胡蘿卜復合發酵飲料中揮發性風味物質的種類和含量Table 9 Content and kinds of volatile compounds of purple carrot compound fermented beverage

酮類化合物主要有香葉基丙酮、（Z）-五癸-6-烯-2-酮、β-紫羅蘭酮等，香葉基丙酮是71 種揮發性物質中含量最高的。酮類通常是不飽和脂肪酸氧化而成[36]，其中香葉基丙酮具有甜木蘭花香[37]，β-紫羅蘭酮具有紫羅蘭花香[38]。

醛類化合物主要有反式-2-癸烯醛、反式-2-辛烯醛、壬醛、苯甲醛等，醛類物質通常閾值較低，較低濃度時對氣味也能起到積極促進作用[39]，通常由多酚氧化或醇類轉化而來[40]。反式-2-癸烯醛、反式-2-辛烯醛都具有脂香和清香[41]，壬醛具有柑橘、玫瑰清香[42]，苯甲醛具有果味和杏仁味[43]。

醇類化合物有里哪醇、壬醇、辛醇、柏木醇等。醇類在發酵過程中有糖代謝合成和芳香族氨基酸降解合成兩條途徑[44]。里哪醇不僅是呈香物質，也是健康活性成分，具有清香和果香，壬醇具有強烈的玫瑰和橙子香氣，辛醇具有油脂和柑橘香味，柏木醇具有溫和的柏木芳香[45]，會使發酵飲料風味更加復合濃郁。

酯類化合物主要有δ-十二內酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、異硫氰酸烯丙酯等，酯類物質通常呈現多種水果香味，發酵過程可以促進酯類的形成[46]。δ-十二內酯具有桃子果香[47]，鄰苯二甲酸二異丁酯具有芳香氣味[48]，異硫氰酸烯丙酯是含介子苷類十字花科蔬菜及其加工產品中的獨特風味物質，具有一定的辛辣味和芳香味[36]。

酸類化合物包括乙酸、癸酸和壬酸。酸類主要在發酵過程中形成[49]。乙酸含量13.14%，在檢測出的揮發性物質中含量排第二位。有機酸不僅能產生酸味，還能提供其他香氣物質的前體，共同構成了發酵飲料的酸甜口感。

其他化合物包括芐腈、新植二烯、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚、反式-2-（2-戊烯基）呋喃和甲氧基苯基-肟。腈類化合物是十字花科蔬菜特有的風味物質，帶有苦杏仁味[50]，這與何洪巨等[51]的研究結果一致。這些物質雖然含量不高，但它們共同構成了發酵飲料的豐富香氣。

3 結論

紫胡蘿卜復合發酵飲料的最佳發酵參數為：糖添加量7%、乳酸菌接種量5‰、發酵溫度41 ℃、發酵時間為38 h。該條件下得到的發酵飲料酸甜適中、色澤艷麗，總糖含量0.21 g/L，總酸含量0.38 g/L，膳食纖維含量0.41 g/L，活菌數7.42×107CFU/g，感官評分93.3 分；共檢測出71 種揮發性風味物質，主要的揮發性風味物質是酮類、醛類、醇類和酸類化合物，其中，香葉基丙酮、乙酸、（E）-2-癸烯醛含量位居前三。羽衣甘藍、冰菜和紫胡蘿卜本身就具有豐富的營養價值和開發價值，本研究所得復合發酵飲料不僅氣味芳香，而且酸甜適口。因此，為今后蔬菜發酵飲料的開發提供新思路，同時也增加了蔬菜加工產業的經濟效益。但本研究未對發酵飲料的花青素、多酚等活性物質含量以及抗氧化性展開深入探究，后續可深入研究。