鹽生草根系基因HgAKR6C 的克隆與初步功能分析

胡尚欽，汪軍成，姚立蓉，司二靜，馬小樂，楊軻，張宏，孟亞雄，王化俊，李葆春*

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)干旱生境作物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

土壤鹽漬化是當(dāng)今世界共同面對的環(huán)境難題，主要分為土壤原生鹽漬化、土壤次生鹽漬化和氣候變化3 種，形成了不利于人類發(fā)展的鹽漬化土壤［1］。在我國，鹽漬土廣泛分布，從海邊到內(nèi)陸、熱帶到副寒帶、濕潤到干旱地區(qū)，約占我國可利用土地面積的6%［2-3］。鹽漬化土地造成的非生物脅迫更是嚴(yán)重影響了植物的生長發(fā)育過程［4］。鹽漬化土壤中的鹽分對植物生長發(fā)育的抑制脅迫機(jī)制主要體現(xiàn)在離子脅迫、滲透脅迫和氧化脅迫［5］。離子脅迫和滲透脅迫是主要的鹽脅迫效應(yīng)［6-7］。在長期的鹽脅迫下，Na+和Cl-在植物細(xì)胞質(zhì)中的積累會(huì)抑制K+、Ca2+和Mg2+等營養(yǎng)離子的吸收，導(dǎo)致植物營養(yǎng)缺乏，使植物受到雙重抑制，即鹽離子脅迫和營養(yǎng)離子虧缺，最終因打破植物體內(nèi)維持的離子穩(wěn)態(tài)而使植物的生長發(fā)育受到抑制［5］。

Shaker 型電壓依賴性K+通道蛋白（Kv1）是由β 亞基（Kvβs）構(gòu)成，通過控制K+進(jìn)出細(xì)胞膜的流動(dòng)以響應(yīng)膜電位變化的四聚體膜蛋白，其中Kvβ1 和Kvβ2 的核心結(jié)構(gòu)域是醛酮還原酶（aldo-keto reductase，AKR）［8-9］。醛酮還原酶蛋白超家族是一組以NADPH 為輔因子，將醛、酮代謝為相應(yīng)醇的酶［10］。目前，分子克隆和基因組測序項(xiàng)目已經(jīng)確定了190 多個(gè)潛在的AKR基因共16 個(gè)家族，具有（α/β）8 桶狀折疊結(jié)構(gòu)，植物AKR 屬于AKR2、AKR4 或AKR6 家族［11］。植物AKRs 可大致分為4 個(gè)重要的功能基團(tuán)，參與植物的多種代謝反應(yīng)，如活性醛解毒、生物合成滲透調(diào)節(jié)因子、次生代謝和膜轉(zhuǎn)運(yùn)等，植物中研究的大多數(shù)AKRs 屬于家族4，目前研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)AKR4C 亞家族成員有極大的潛力助力于探索植物應(yīng)對非生物脅迫的能力［12-13］。例如Simpson 等［14］研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥（Arabidopsis thaliana）的AKR4C 亞家族中，這些酶的主要作用可能是對應(yīng)激過程中產(chǎn)生的一系列有毒的醛和酮進(jìn)行解毒；在水稻（Oryza sativa）中發(fā)現(xiàn)AKR4C15 與OsI_04426 和AKR4C14 可能對小活性醛和中鏈醛起到保護(hù)作用［10］；通過對泰國香米的研究發(fā)現(xiàn)單子葉植物的AKR4Cs 家族和雙子葉植物AKR4Cs 家族功能相似，可能在活性醛的解毒機(jī)制中發(fā)揮重要作用［15］。

鹽生草（Halogeton glomeratus）是被子植物門，藜科（Chenopodiaceae），鹽生草屬（Halogeton），一年生草本植物。主要分布于中國西北地區(qū)的山腳和戈壁灘，生長地區(qū)海拔為700～1000 m［16］。由于鹽生草的生長環(huán)境極端，易于遭受非生物脅迫的侵?jǐn)_，因此其植株地上部分肉質(zhì)化的葉片和多分支的莖及地下部分茂密強(qiáng)壯的根系使其擁有很強(qiáng)的耐鹽抗旱能力［17］。耐鹽機(jī)制中，根作為排鹽器官必須排除土壤溶液中溶解的大部分Na+和Cl-［18］。鹽生草是典型的組織耐鹽型鹽生生物，其根系更是最先感知土壤鹽分的組織器官，土壤里的大量鹽分積聚在肉質(zhì)的葉片中，然后區(qū)隔化于葉片中的液泡組織內(nèi)［19］。由于鹽生草根系對鹽分呈限制性吸收特性，其中蘊(yùn)含豐富的與鹽分吸收相關(guān)的功能基因［20］，但目前對鹽生草耐鹽性的研究大多集中于其葉片組織，對根系相關(guān)基因的報(bào)道較少。

本試驗(yàn)選取鹽生草根系作為耐鹽基因發(fā)掘的研究材料，依據(jù)鹽生草鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)篩選并克隆得到基因HgAKR6C，通過生物信息學(xué)分析和親緣關(guān)系初步了解該基因的基礎(chǔ)特性；利用亞細(xì)胞定位探究HgAKR6C響應(yīng)鹽脅迫的細(xì)胞部位；結(jié)合缺陷性酵母表型分析初步研究該基因的耐鹽調(diào)控功能，以期為后期HgAKR6C基因的耐鹽調(diào)控機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

通過課題組于2017 年發(fā)表的以Iso-Seq 技術(shù)捕獲的鹽生草鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫篩選出目的基因HgAKR6C（Hg42639，BioProject ID：PRJNA359784）［21］。試驗(yàn)所用鹽生草種子采自甘肅省會(huì)寧縣鹽堿地，均勻撒播于裝有蒸餾水浸透培養(yǎng)基質(zhì)（細(xì)沙∶蛭石=1∶1 均勻混合）的花盆中，花盆上覆保鮮膜并扎孔透氣，放于人工氣候室中培養(yǎng)，每天澆灌適量Hoagland’s 營養(yǎng)液保證培養(yǎng)基質(zhì)的濕潤狀態(tài)，待幼苗長至2 個(gè)月后，使用200 mmol·L-1NaCl 進(jìn)行鹽脅迫處理7 d。

1.2 總RNA 提取與反轉(zhuǎn)錄

挑取長勢強(qiáng)壯的鹽生草根系經(jīng)清洗消毒后使用天根植物總RNA 提取試劑盒（TIANGEN RNAsimple Total RNA Kit）提取鹽生草根系RNA，使用天根反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用作克隆的模板，具體操作過程參考說明書。

1.3 目的基因的PCR 擴(kuò)增

使用NCBI Primer-BLAST（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/ primer-blast/）以鹽生草根系HgAKR6C基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)（coding sequence，CDS）序列以及pBI121-eGFP、pYES2 載體質(zhì)粒上的多克隆位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的特異性引物HgAKR6C-F1、HgAKR6C-R1，HgAKR6C-F2、HgAKR6C-R2，分別進(jìn)行構(gòu)建亞細(xì)胞定位表達(dá)載體和酵母異源表達(dá)載體（表1）。以cDNA 為模板，擴(kuò)增體系為：ddH2O 9.5 μL，Green Taq Mix 12.5 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，cDNA（100 ng·μL-1）1 μL，共25 L。構(gòu)建亞細(xì)胞定位表達(dá)載體PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 4 min，94 ℃ 50 s，63.4 ℃ 50 s，72 ℃ 90 s，35 次循環(huán)，72 ℃終延伸10 min。構(gòu)建酵母異源表達(dá)載體PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 4 min，94 ℃ 50 s，60.8 ℃ 50 s，72 ℃ 90 s，35 次循環(huán)，72 ℃終延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物通過1.0% 瓊脂糖含量的凝膠電泳檢測后得到目的條帶，使用瓊脂糖凝膠DNA 膠回收試劑盒（TIANgel purification kit）對目的條帶進(jìn)行純化，在冰浴條件下連接pMD19-T 載體并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，培養(yǎng)單菌落搖菌后進(jìn)行PCR 檢測，檢測后的菌液送至上海生工生物工程有限公司測序，具體步驟見試劑盒說明書。

表1 試驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in the study

1.4 鹽脅迫下HgAKR6C 基因的實(shí)時(shí)熒光定量分析

使用NCBI Primer-BLAST 設(shè)計(jì)qRT-PCR 引物HgAKR6C-q1F、HgAKR6C-q1R，HgActin為內(nèi)參基因（表1）。反應(yīng)程序根據(jù)SuperReal 熒光定量預(yù)混試劑（天根）兩步法進(jìn)行 qRT-PCR 檢測：95 ℃預(yù)變性 15 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火 32 s，40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系：2×SuperReal PreMixPlus 10 μL、正反向引物（10 μmol·L-1）各 0.6 μL、cDNA 模板（100 ng·μL-1）1 μL、RNase-free ddH2O 7.8 μL。設(shè)置 3 次技術(shù)重復(fù)，利用2-ΔΔCT法計(jì)算HgAKR6C基因在不同鹽脅迫時(shí)間下的表達(dá)量。

1.5 HgAKR6C 基因的生物信息學(xué)功能分析

對已測序的HgAKR6C使用ORFfinder 分析開放閱讀框，通過EXPASy 翻譯為蛋白序列。用ProtParam分析其理化性質(zhì)，用SOPMA 和Swiss-Model 預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)，用TMHMM、SignalP 4.1 和ProtScale 預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽和親疏水性，用NetPhos 3.1 Server、PSORT Ⅱ Prediction 預(yù)測磷酸化位點(diǎn)和亞細(xì)胞定位。使用MAFFT 和DNAMAN 進(jìn)行同源氨基酸序列比對分析，利用MEGA 11 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，選擇近鄰相接法（neighbor-joining，NJ）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析（Bootstrap 設(shè)置為1000）。

1.6 HgAKR6C 基因亞細(xì)胞定位載體和酵母異源表達(dá)載體的構(gòu)建

通過pBI121-GFP 和pYES2 表達(dá)載體分別構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體和酵母異源表達(dá)載體，使用天根質(zhì)粒小提試劑盒提取活化后的載體菌液質(zhì)粒和HgAKR6C基因的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物菌液質(zhì)粒，選擇XbaⅠ、SmaⅠ，EcoRⅠ、XbaⅠ分別為構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體和酵母異源表達(dá)載體的上下游限制性內(nèi)切酶，雙酶切后用T4 連接酶連接到相應(yīng)位點(diǎn)得到載體pBI121-HgAKR6C-GFP、pYES2-HgAKR6C。對構(gòu)建好的載體進(jìn)行PCR 驗(yàn)證、測序、提取質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，然后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，送公司測序。

1.7 滲透法瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草（Nicotiana tabacum）和亞細(xì)胞定位觀察

運(yùn)用注射滲透法將農(nóng)桿菌菌液瞬時(shí)轉(zhuǎn)化至煙草葉片，使用2.5 mL 針管從煙草葉片背面注射。注射煙草前1 d 在托盤中加入充足的水，并把煙草做好標(biāo)記。注射完成后，將煙草置于黑暗環(huán)境中培養(yǎng)2～3 d。使用激光共聚焦顯微鏡（Zeiss LSM800，德國），觀察煙草葉片熒光分布位置。其中綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）激發(fā)光波長為488 nm，發(fā)射光波長為510 nm；葉綠體熒光信號(hào)激發(fā)波長為640 nm，發(fā)射波長為675 nm。

1.8 缺陷性酵母菌株感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化

選取Na+敏感型酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株AXT3［△ena1-4：：HIS3，△nha1：：LEU2，△nhx1：：TRP1］和K+吸收功能缺失型酵母菌株CY162［MATa，△trk1，trk2：：pCK64，his3，leu2，ura3，trp1，ade2］制備缺陷性酵母菌株AXT3 和CY162 感受態(tài)細(xì)胞，通過醋酸鋰酵母轉(zhuǎn)化法將酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)入上述兩種缺陷型菌株中：在10 mL 離心管中順次加入240 μL 50% PEG、36 μL 1 mol·L-1LiAc、65 μL 無菌水、5 μL 鮭魚精DNA、空載體質(zhì)粒及載體質(zhì)粒各2 μL，混勻后封口并于28 ℃培養(yǎng)箱保溫30 min、42 ℃熱激20 min，取出后離心倒掉上清液，加入無菌水500 μL 離心后再棄上清，重復(fù)步驟使管內(nèi)體積為50 μL；吸取30 μL 轉(zhuǎn)化混合液，均勻涂在Ura 固體培養(yǎng)基（制備1 L Ura 固體培養(yǎng)基需稱量無氨基酵母氮源6.7 g，Ura Do Supplement 0.77 g，葡萄糖20 g，KCl 7.456 g，2%瓊脂）上，封口，置于28 ℃培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)3 d。待長出單菌斑后，在10 mL Ura 液體選擇培養(yǎng)基中挑取單個(gè)菌斑，擴(kuò)大培養(yǎng)備用，并進(jìn)行菌液PCR 驗(yàn)證。

1.9 酵母生長表型分析及Na+、K+含量測定

在600 nm 下，以Ura 液體選擇培養(yǎng)基為對照，測定菌液的OD 值至0.5 左右時(shí)，將菌液分別稀釋1、10、100 和1000 倍，依次吸取5 μL 菌液按稀釋順序點(diǎn)于AP 培養(yǎng)基上（制備AP 固體培養(yǎng)基成分為8 mmol·L-1磷酸、10 mmol·L-1L-精氨酸、2 mmol·L-1硫酸鎂、0.2 mmol·L-1氯化鈣、2%葡萄糖、0.77 g·L-1Ura Do Supplement 及適量維生素和微量元素，并用L-精氨酸將pH 調(diào)至6.5，最后添加2%瓊脂），在AP 培養(yǎng)基（添加1 mmol·L-1KCl+0、10、30、50 mmol·L-1NaCl；添加0、0.2、1、5、10、100 mmol·L-1KCl）上從上往下依次點(diǎn)轉(zhuǎn)化pYES2、pYES2-HgAKR6C-AXT3；pYES2 空載體、pYES2-HgAKR6C-CY162。吹干菌斑，28 ℃倒置培養(yǎng)36～48 h，取出觀察酵母菌落長勢并拍照［22］。挑取長勢相似的pYES2、pYES2-HgAKR6C-AXT3、pYES2-HgAKR6C-CY162 酵母菌斑在Ura 液體選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD600為0.5 后，取1.2 mL 加到80 mL 含有不同Na+、K+濃度的AP 液體培養(yǎng)基（1 mmol·L-1KCl+10、50 mmol·L-1NaCl；添加0.2、100 mmol·L-1KCl）中，培養(yǎng)3 d，離心收集菌體沉淀，用無菌水沖洗兩次，離心，收集沉淀后用ICP-MS 質(zhì)譜分析儀（Anton Paar MW3000，奧地利）測定菌液中Na+、K+含量。

1.10 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2016 和IBM SPSS 22 對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HgAKR6C 基因的PCR 擴(kuò)增

本研究以200 mmol·L-1NaCl 處理一周的鹽生草根系cDNA 為模板，以HgAKR6C-F1、HgAKR6 C-R1，HgAKR6C-F2、HgAKR6C-R2 為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證片段大小后進(jìn)行膠回收純化和再次電泳檢測，得到與目的基因大小一致的條帶，為951 bp。將目的條帶膠回收產(chǎn)物連接pMD19-T、轉(zhuǎn)化大腸桿菌及藍(lán)白板篩選，以菌液為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，成功擴(kuò)增出目的片段，大小為951 bp（圖1）。陽性菌液送公司測序，測序結(jié)果經(jīng)DNAMAN 9.0 序列比對顯示同源性達(dá)100%，表明完整擴(kuò)增出目的基因HgAKR6C。

圖1 HgAKR6C 基因克隆PCR 驗(yàn)證Fig.1 The PCR validation of HgAKR6C

提取克隆成功的目的基因的質(zhì)粒以及活化后的pYES2 載體、pBI121-GFP 質(zhì)粒，HgAKR6C基因使用兩種限制性內(nèi)切酶雙酶切跑膠驗(yàn)證后通過T4 連接酶構(gòu)建載體，XbaⅠ、SmaⅠ雙酶切構(gòu)建pBI121-HgAKR6CGFP 載體；EcoRⅠ、XbaⅠ進(jìn)行雙酶切構(gòu)建pYES2-HgAKR6C，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取單克隆并做菌液PCR擴(kuò)增，條帶大小與目的基因一致（圖2），測序后借助DNAMAN 軟件比對序列成功后，提取菌液質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，條帶大小與目的基因一致。

2.2 HgAKR6C 基因生物信息學(xué)分析

2.2.1HgAKR6C基因組成及蛋白的理化性質(zhì)分析 ORFfinder 分析開放閱讀框結(jié)果顯示，HgAKR6C基因全長1657 bp，最長開放閱讀框?yàn)?87 bp，CDS 區(qū)為951 bp（187～1137 位），編碼317 個(gè)氨基酸。采用ProtParam 預(yù)測HgAKR6C基因的理化性質(zhì)（表2），HgAKR6C編碼蛋白的理論等電點(diǎn)（isoelectric point，pI）值為6.25，屬于酸性蛋白（pI＜7）；分子量大小為35151.21 Da，分子式為C1575H2473N419O468S12；帶負(fù)電荷殘基數(shù)為36，帶正電荷殘基數(shù)為34；脂肪系數(shù)為90.41；不穩(wěn)定系數(shù)為32.06，為穩(wěn)定蛋白。

表2 HgAKR6C 基因的理化性質(zhì)分析Table 2 Analysis of physical and chemical properties of HgAKR6C

2.2.2HgAKR6C編碼蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測、跨膜結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽、親疏水性預(yù)測分析HgAKR6C基因編碼的蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明（圖3），占比最多的結(jié)構(gòu)為α-螺旋（alpha helix，Hh），比例為52.68%，其次是無規(guī)則卷曲（random coil，Cc），占25.87%，延伸鏈（extend strand，Ee）占14.2%，剩下的7.26%為β-轉(zhuǎn)角（beta turn，Tt），這與Swiss-Model 預(yù)測的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果相符。TMHMM 軟件分析基因編碼的蛋白的跨膜區(qū)得出HgAKR6C基因無跨膜區(qū)，即該基因編碼的蛋白屬于非跨膜性蛋白（圖4a）。SignalP 4.1 分析結(jié)果顯示，HgAKR6C基因存在信號(hào)肽的可能性為0.0038，推測HgAKR6C基因編碼的蛋白不存在信號(hào)肽，不能引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞或亞細(xì)胞器，屬于非分泌型蛋白（圖4b）。使用ProtScale 分析蛋白疏水性，根據(jù)每一點(diǎn)的比值在0 點(diǎn)以上判斷為疏水性，在0 點(diǎn)以下判斷為親水性，因此HgAKR6C編碼蛋白為親水性蛋白（圖4c）。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果顯示，HgAKR6C基因編碼的蛋白存在絲氨酸（serine）、蘇氨酸（threonine）和酪氨酸（tyrosine）磷酸化位點(diǎn)（圖4d）。

圖3 HgAKR6C 基因編碼蛋白的二（a）、三（b）級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Second （a） and third （b） order structure prediction of HgAKR6C gene encoded protein

圖4 HgAKR6C 基因的生物信息學(xué)分析預(yù)測Fig.4 Bioinformatics analysis and prediction of HgAKR6C genes

2.2.3HgAKR6C基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測 用NCBI 中的CD-Search 預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域，預(yù)測HgAKR6C基因編碼蛋白含有AKR_SF 超家族結(jié)構(gòu)域，具有31 個(gè)活性位點(diǎn)和4 個(gè)催化四聯(lián)體（圖4e）［8］。

2.2.4HgAKR6C基因亞細(xì)胞定位預(yù)測 使用PSORT Ⅱ Prediction 預(yù)測HgAKR6C基因的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示大部分位于細(xì)胞質(zhì)，占比60.9%，另外還有13%定位在細(xì)胞核，13%定位在線粒體內(nèi)，4.3%位于細(xì)胞骨架（表3）。

表3 亞細(xì)胞定位預(yù)測Table 3 Subcellular localization prediction （%）

2.2.5HgAKR6C基因編碼蛋白的親緣關(guān)系分析 通過NCBI BLSAT（https：//blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast.cgi）對HgAKR6C基因的蛋白序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)HgAKR6C 與茄科曼陀羅（Datura stramonium）［23］、西番蓮科時(shí)鐘花（Turnera subulate）［24］、土瓶草（Cephalotus follicularis）［25］、大戟科南歐大戟（Euphorbia peplus）［26］的相關(guān)功能基因蛋白序列具有較高的同源性。參考AKRs 家族在數(shù)據(jù)庫（www. med. upenn. edu/akr）中的記錄和Sengupta 等［13］發(fā)表的目前已知植物AKRs信息表，選取AKR2A 家族、AKR4A 家族、AKR4B 家族、AKR4C 家族、AKR6C 家族的蛋白序列，通過DNAMAN、MAFFT 和MEGA 11 與HgAKR6C 蛋白序列進(jìn)行序列比對和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖5和圖6）。分析發(fā)現(xiàn)：HgAKR6C 與擬南芥和水蘊(yùn)草（Egeria densa）的AKR6C 家族氨基酸序列具有較高的同源性，與擬南芥AKR6C1 的氨基酸序列親緣關(guān)系最近。

圖6 HgAKR6C 同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.6 Phylogenetic analysis of homologous proteins of HgAKR6C

2.3 HgAKR6C 基因的亞細(xì)胞定位分析

將pBI121-GFP 與pBI121-HgAKR6C-GFP 瞬時(shí)轉(zhuǎn)化至煙草，使用激光共聚焦顯微鏡觀察基因在煙草細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位（圖7）。由圖7 可以看出，pBI121-GFP 空載體在煙草細(xì)胞中各個(gè)位置均表達(dá)，而pBI121-HgAKR6C-GFP 主要在細(xì)胞質(zhì)中觀察到綠色熒光，少量分布于細(xì)胞核中，確定HgAKR6C基因在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中表達(dá)，這與2.2.4 中預(yù)測結(jié)果一致。

圖7 HgAKR6C 基因亞細(xì)胞定位Fig.7 Subcellular localization of HgAKR6C gene

2.4 鹽脅迫下HgAKR6C 基因的表達(dá)量分析

通過實(shí)時(shí)熒光定量分析200 mmol·L-1NaCl 處理0、2、6、24、72 h 下鹽生草根系HgAKR6C基因的表達(dá)情況（圖8），發(fā)現(xiàn)HgAKR6C基因在鹽脅迫2、6、24、72 h 處理下均有顯著表達(dá)，表達(dá)量隨著處理時(shí)間的延長呈先上升后下降的趨勢，在24 h 時(shí)達(dá)到峰值后下降。

圖8 200 mmol·L-1 NaCl 脅迫不同時(shí)間下鹽生草根系HgAKR6C 的表達(dá)量Fig. 8 Expression of HgAKR6C in saltbush root systems under different times of 200 mmol·L-1 NaCl stress

2.5 HgAKR6C 的酵母表型分析和Na+、K+的吸收特性分析

在AP 培養(yǎng)基中K+濃度為1 mmol·L-1、Na+濃度≤30 mmol·L-1的情況下，將轉(zhuǎn)化空載體和重組載體的菌液稀釋1000 倍時(shí)可明顯看出轉(zhuǎn)化HgAKR6C基因的酵母菌株長勢更好；在AP 培養(yǎng)基中K+濃度為1 mmol·L-1、Na+濃度為50 mmol·L-1的情況下，將菌液稀釋10 倍時(shí)可明顯看出轉(zhuǎn)化HgAKR6C基因的酵母菌株長勢比轉(zhuǎn)化空載體的菌株長勢更好，表明HgAKR6C基因的轉(zhuǎn)入減少了Na+對酵母細(xì)胞的毒害，說明HgAKR6C基因參與調(diào)控Na+的外排（圖9）。當(dāng)AP 培養(yǎng)基中K+濃度為10 和100 mmol·L-1時(shí)， 轉(zhuǎn)化空載體pYES2 的酵母菌株與轉(zhuǎn)化HgAKR6C基因的酵母菌株均能生長，在AP 培養(yǎng)基中K+＜7 mmol·L-1（0、0.2、1、5 mmol·L-1）時(shí)，只有轉(zhuǎn)化HgAKR6C基因的酵母菌株生長，說明該基因在酵母中的超表達(dá)具有彌補(bǔ)K+缺陷型酵母菌株CY162 的功能，即在酵母中介導(dǎo)K+的吸收（圖10）。

圖9 HgAKR6C 基因和pYES2 空載體在突變型酵母AXT3 中的表達(dá)Fig.9 Expression of HgAKR6C gene and pYES2 empty vector in mutant yeast AXT3

圖10 HgAKR6C 基因和pYES2 空載體在突變型酵母CY162 中的表達(dá)Fig.10 Expression of HgAKR6C gene and pYES2 empty vector in mutant yeast CY162

菌株生長環(huán)境中的Na+濃度對PYES2 和AXT3-HgAKR6C中Na+、K+含量具有顯著影響（圖11a，b）；當(dāng)酵母菌株生長環(huán)境中Na+濃度增大時(shí)，AXT3-HgAKR6C菌株體內(nèi)K+、Na+含量均減少；菌株生長環(huán)境中的K+濃度對PYES2 和CY162-HgAKR6C中Na+、K+含量具有顯著影響，當(dāng)酵母菌株置生長環(huán)境中K+濃度增大時(shí)，CY162-HgAKR6C菌株體內(nèi)K+含量增加而Na+含量減少（圖11c，d）。

圖11 酵母菌株細(xì)胞內(nèi)Na+、K+含量Fig.11 Intracellular accumulation of Na+， K+ content in yeast strains

3 討論

鹽生草是獲取植物耐鹽基因的理想材料，本研究成功從鹽生草根系中克隆到一個(gè)耐鹽基因HgAKR6C，使用在線軟件工具對HgAKR6C基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，HgAKR6C基因全長1657 bp，CDS 區(qū)全長951 bp（187～1137 位），編碼 317 個(gè)氨基酸。

蛋白質(zhì)磷酸化能夠使蛋白質(zhì)的活力發(fā)生變化，并且在生物體內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長發(fā)育方面發(fā)揮重要作用［27］。Wang 等［28］通過比較魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）的生理學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)鹽脅迫導(dǎo)致酵母細(xì)胞內(nèi)4 種氨基酸（蘇氨酸、酪氨酸、賴氨酸和脯氨酸）含量顯著增加。通過對魯氏接合酵母進(jìn)行預(yù)熱試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)預(yù)熱適應(yīng)可以提高魯氏接合酵母耐鹽脅迫的能力，鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致5 種氨基酸（纈氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、甘氨酸和酪氨酸）含量升高，將先預(yù)熱適應(yīng)后鹽脅迫的細(xì)胞與未進(jìn)行預(yù)熱適應(yīng)的細(xì)胞進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)絲氨酸、蘇氨酸和賴氨酸含量顯著增加，由于預(yù)熱試驗(yàn)對酵母細(xì)胞也有一定的應(yīng)激作用，推測部分氨基酸可能由于熱應(yīng)激而起到了交叉保護(hù)以抵抗鹽脅迫［29］。Wong 等［30］通過磷酸化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)對擬南芥模型進(jìn)行分析，并發(fā)現(xiàn)一系列磷酸化位點(diǎn)受高脫落酸誘導(dǎo)磷酸酶1（highly ABA-induced1，HAI1）的影響以調(diào)節(jié)植物用于應(yīng)對非生物脅迫的信號(hào)傳導(dǎo)和防御反應(yīng)機(jī)制。綜上，本研究推測，HgAKR6C基因編碼蛋白包括3 種磷酸化位點(diǎn)（絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸），可能通過非生物應(yīng)激反應(yīng)或者蛋白質(zhì)磷酸酶的去磷酸化作用起到交叉保護(hù)或者信號(hào)調(diào)節(jié)的功能以抵抗鹽脅迫。通過NCBI 進(jìn)行蛋白序列比對發(fā)現(xiàn)HgAKR6C基因編碼蛋白與茄科曼陀羅［23］和西番蓮科時(shí)鐘花的KAB1 基因編碼蛋白序列［24］、土瓶草AKR_AKR6C1_2 結(jié)構(gòu)域區(qū)蛋白序列［25］、大戟科南歐大戟的電壓門控K+通道β 亞基1（Kvβ1）氨基酸序列［26］等具有高度同源性，進(jìn)一步推測HgAKR6C是電壓門控Kvβ1 相關(guān)功能蛋白。陳倩等［31］通過對200 mmol·L-1NaCl 脅迫4 個(gè)時(shí)間段下的鹽生草葉片和根系進(jìn)行 qRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，鹽生草HgWRKYs家族的HgWRKY19、HgWRKY23和HgWRKY27基因在24 h 的表達(dá)量最高。本研究通過對鹽生草根系基因HgAKR6C在不同時(shí)間（0、2、6、24、72 h）鹽處理下的表達(dá)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在鹽處理24 h 時(shí)HgAKR6C具有最顯著表達(dá)量，HgAKR6C基因編碼蛋白的表達(dá)與鹽脅迫有密切聯(lián)系。

結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示HgAKR6C基因編碼蛋白含有AKR_SF 超家族結(jié)構(gòu)域，特定位點(diǎn)AKR_AKR6C1_2 電壓門控K+通道β 亞基（KCAB）分別來自擬南芥（GenBank：AAA87294）和水蘊(yùn)草（GenBank：CAA12646），分屬于醛酮還原酶家族6 成員C1（AKR6C1）和C2（AKR6C2）的初始成員［13］。而醛酮還原酶（AKRs）是一個(gè)大型的蛋白質(zhì)超家族，主要是NAD（P）依賴性氧化還原酶，參與羰基代謝，其主要目的是將醛和酮還原成一級(jí)和二級(jí)醇［32］。KCAB，也稱為K+通道亞基，或KAB1，是一種可能的輔助K+通道蛋白，調(diào)節(jié)成孔α 亞基的活性，與酮醛還原酶和K+通道蛋白具有一致的相關(guān)功能［33］。根據(jù)NCBI 蛋白序列比對和結(jié)構(gòu)域預(yù)測，本研究選取了現(xiàn)有的AKRs 家族蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹［13］，根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化分析表明HgAKR6C 與擬南芥的AtAKR6C1 親緣關(guān)系最近，這與結(jié)構(gòu)域預(yù)測的具有特定位點(diǎn)AKR_AKR6C1_2 結(jié)果相符合，因此推測HgAKR6C 可能是屬于AKR6C1 家族的功能蛋白。Yu 等［34］通過研究蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）AKRs 基因家族在鹽脅迫、干旱脅迫和ABA 處理下的葉和根中的表達(dá)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)MtAKR1、MtAKR5、MtAKR11、MtAKR14、MtAKR20和MtAKR29可能在上述脅迫下發(fā)揮重要作用，推測其中一些AKRs 家族可以通過清除一些植物細(xì)胞的醛毒性來增強(qiáng)植物的抗非生物脅迫能力。植物電壓門控K+通道電流模型的分子結(jié)構(gòu)類似于在廣泛的動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的K+通道多肽的“Shaker”家族，對兩個(gè)植物K+通道基因產(chǎn)物（KAT1和AKT1）的蛋白序列進(jìn)行分析表明，編碼這些多肽的mRNA 在異種系統(tǒng)（如非洲爪蟾卵母細(xì)胞）中的表達(dá)，KAT1基因的翻譯產(chǎn)物在靶膜上賦予K+通道活性，可以形成一個(gè)功能性的、電壓門控的、向內(nèi)糾偏的K+通道［35-38］。綜上結(jié)果，本研究推測，HgAKR6C基因編碼蛋白是電壓依賴型K+通道β亞基中依靠AKRs 作為輔助因子發(fā)揮耐鹽脅迫的功能基因。

AXT3 是一種對Na+敏感的酵母菌株，不含ATP 酶（ENA1～ENA4），故對Na+極其敏感［39］，CY162 是一種K+缺陷型酵母菌株，不含K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TRK1、TRK2，在低鉀條件下（K+＜7 mmol·L-1）不能生長［40］，二者常用于基因的初步驗(yàn)證。范龍等［41］使用pYES2 空載體質(zhì)粒為對照，將GmNHX1基因轉(zhuǎn)進(jìn)AXT3 酵母菌株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因能夠通過參與Na+的轉(zhuǎn)運(yùn)，提高酵母的耐鹽性。郭歡［42］通過酵母異源表達(dá)研究，發(fā)現(xiàn)AcSOS1基因能夠介導(dǎo)Na+的轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)也可以維持K+的穩(wěn)定。王文穎［43］通過酵母異源表達(dá)研究了霸王（Zygophyllum xanthoxylon）HKT 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的Na+吸收機(jī)制。Zhang 等［44］的研究表明鹽生短芒大麥草（Hordeum brevisubulatum）HbHAK1在酵母CY162 中表達(dá)，在極低的外部K+條件下表現(xiàn)出很強(qiáng)的K+攝取活性，并降低Na+毒性，以維持酵母細(xì)胞在高鹽脅迫下的生存。本研究通過將HgAKR6C基因構(gòu)建的過表達(dá)載體pYES2-HgAKR6C與pYES2 空載體分別轉(zhuǎn)入Na+敏感型酵母菌株AXT3 與K+缺陷型酵母菌株CY162，觀察酵母生長表型和測定Na+、K+含量，結(jié)果證實(shí)HgAKR6C基因參與Na+的外排和介導(dǎo)K+的吸收。綜合以上研究結(jié)果，可以合理預(yù)測HgAKR6C是作用于細(xì)胞質(zhì)上的穩(wěn)定蛋白，具有AKR 基因家族結(jié)構(gòu)域且趨向于AKR6C1 家族，通過Kvβ 以維持離子穩(wěn)態(tài)進(jìn)而提高植株的耐鹽性。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)基于課題組前期鹽生草鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選并克隆基因HgAKR6C，研究發(fā)現(xiàn)該基因編碼蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)；結(jié)構(gòu)域分析顯示HgAKR6C基因編碼蛋白具有AKRs 家族結(jié)構(gòu)域，與系統(tǒng)進(jìn)化分析中的AKR6C1 家族蛋白序列具有高度同源性。qRT-PCR 結(jié)果顯示一定濃度鹽脅迫可導(dǎo)致HgAKR6C的表達(dá)量增加。最后通過構(gòu)建酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)入缺陷性菌株顯示該基因具有使Na+外排和K+轉(zhuǎn)運(yùn)的功能，確定HgAKR6C可作為鹽生草根系耐鹽基因調(diào)控機(jī)制的研究對象，為后期HgAKR6C的功能分析提供了理論依據(jù)。