豬毛菜響應干旱脅迫的葉片結構、生理及轉錄組分析

譚炯銳，查同剛，張澤宇，張曉霞，滕紅梅，王玲麗，趙莉麗，王奧，王馨珧

（1. 運城學院生命科學系，山西 運城 044000；2. 北京林業大學水土保持學院，北京 100083；3. 中建一局集團第三建筑有限公司，北京 100161；4. 北京八達嶺林場，北京 102112）

干旱是一種重要的非生物脅迫，是指水勢和膨壓降低到一定程度時植物正常代謝功能和繁殖能力受到損害的現象。全球氣候變化導致降水量減少和蒸發量增加，預計很多區域的干旱將更加普遍和嚴重［1］，水分短缺是干旱區限制植物生存及生產力的主要因素。此外，全球變暖引發不可預測的降水模式，導致反復出現長期干旱［2］。持續干旱顯著影響植物生長發育，導致土壤退化和水土流失加重，且植被修復難度增大。因此近年來植物對干旱環境的響應及適應的研究較多。

干旱脅迫下植物生態、形態、生理和分子等方面都產生響應調節。植物細胞膜感知應激信號，通過細胞和分子信號通路來激活和調節對干旱脅迫的防御。在高等植物中，鈣（Ca2+）是植物常見的第二信使，是植物的許多生理生化過程的重要調節因子。由于在細胞內、外Ca2+存在濃度差，當細胞受到干旱脅迫、脫落酸（abscisic acid，ABA）、茉莉酸（jasmonic acid， JA）和乙烯（ethylene）等各種刺激時，Ca2+能通過Ca2+通道進入細胞，引起細胞內Ca2+濃度短暫明顯升高，繼而產生鈣信號［3-4］。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）通過應激信號轉導來響應脅迫刺激，并激活多種應激反應蛋白［5］。在植物中，活性氧（reactive oxygen species，ROS）信號網絡參與生物和非生物脅迫的響應，而ROS 過量會觸發酶防御機制和非酶防御機制清除過量ROS［6］。

在脅迫信號轉導后，觸發植物的干旱恢復機制。為了耐受干旱產生的損害和影響，植物發展了多種形態和生理途徑，如細胞膨壓降低，葉片變小變厚，柵海比變高，維管束鞘高度發達，氣孔調節、光合響應、呼吸作用、滲透調節等［7］。植物的滲透調節物質包括氨基酸、糖、糖醇、生物堿、可溶性蛋白、無機離子等，對細胞和組織水分平衡起重要作用。植物清除過量ROS 的抗氧化物質包括酶促抗氧化劑如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase， POD）、過氧化氫酶（catalase， CAT）等，及非酶促抗氧化劑如脯氨酸、還原性谷胱甘肽、抗壞血酸等［8］。這些特征通過多基因效應促進了耐旱性。近年來，模式植物和作物抗旱轉錄組測序研究已經有很多報道。與模式植物和作物相比，分布于荒漠區的植物具有更強的抗旱性，開展這類植物抗旱分子機制的研究對植物強抗旱基因的發掘和利用，推動干旱區植被恢復的植物育種和種質創新具有重要意義。然而，荒漠區植物抗旱基因和轉錄組測序研究相對較少。對紫花苜蓿（Medicago sativa）的轉錄組測序研究揭示了干旱脅迫下NO 介導的光合作用和碳水化合物代謝增強的機制［9］。對檸條（Caragana korshinskii）幼苗轉錄組測序研究表明轉錄因子、蛋白激酶和抗氧化酶相關基因與其干旱和鹽脅迫耐受性有關［10］。轉錄組和代謝組分析表明，干旱脅迫促進了梭梭（Haloxylon ammodendron）的糖酵解/糖異生途徑，增加了氨基酸合成途徑基因的表達［11］、胡楊（Populus euphratica）在干旱脅迫下bZIP、AP2/EREPB、NAC、WRKY、NF-Y和MYB等轉錄因子家族成員，以及HSP70、HSP90等熱激蛋白基因家族成員的基因表達豐度有顯著變化［12］，白刺（Nitraria tangutorum）干旱脅迫轉錄組結果顯示差異表達基因主要顯著富集在核糖體、內質網蛋白加工、植物激素信號轉導、氨基酸生物合成、類黃酮生物合成、花青素生物合成等通路中［13］、干旱脅迫下沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）差異表達轉錄因子主要為AP2/EREPB、WRKY、MYB、bHLH和NAC基因家族成員［14］。

一年生草本植物豬毛菜（Salsola collina）為抗旱植物，在荒漠區和極端干旱區廣泛分布。豬毛菜能夠防風減沙，也是飼用植物，是干旱區退化土地植被恢復初期優勢物種［15］，因此在干旱地區退化土地水土保持和植被恢復方面具有很大的應用潛力。同時，豬毛菜在抵御干旱脅迫和水土保持植被恢復方面具有優異的基因資源。然而目前對豬毛菜屬植物抗旱機理的研究多為解剖結構和生理指標測定層面［16-19］，及對小灌木松葉豬毛菜（Salsola laricifolia）NADP-蘋果酸酶基因克隆研究［20］，對一年生草本豬毛菜抗旱分子機制的研究鮮見報道。因此本研究對干旱梯度處理的豬毛菜葉片進行解剖結構、生理指標和轉錄組測序分析。研究結果可為豬毛菜抗旱機制解析提供參考，也為豬毛菜優良抗旱基因資源的開發利用提供了支持。

1 材料與方法

1.1 材料栽培與處理

試驗材料豬毛菜的種子采集自內蒙古烏拉山廢棄礦山周邊。2021 年12 月在運城學院溫室中進行盆栽播種，塑料盆內徑18.5 cm，高15.2 cm，每盆播30 粒種子。栽培基質為泥炭土和珍珠巖（3∶1）混合基質。溫室濕度50%，溫度25 ℃，光照12 h，光強1000 μmol·mol-2·s-1。選取長勢一致的盆栽進行干旱脅迫處理，設5 個處理，每個處理10 盆。在播種后一個月開始控制供水并參考武小飛等［21］的方法測定盆栽土壤相對含水量，1）脅迫0 d，田間持水量的80%；2）脅迫7 d，輕度水分脅迫，田間持水量的65%；3）脅迫14 d，中度水分脅迫，田間持水量的54%；4）脅迫21 d，中度水分脅迫，田間持水量的50%；5）脅迫28 d，重度水分脅迫，田間持水量的28%。由于14和21 d 的土壤相對含水量比較接近，因此處理結束后僅采用0、7、14 和28 d 處理的樣品用于后續測定。各處理采集受光方向相同、大小一致的中部成熟葉片，各處理均勻混合樣品立即浸于液氮中，后儲存于-80 ℃冰箱，用于生理指標測定和RNA 提取。每組混合采集10 片成熟葉片浸泡于FAA 固定液（福爾馬林∶醋酸∶酒精=18∶1∶1），以備石蠟切片。

1.2 石蠟切片及分析

對經FAA 固定后的葉片進行酒精梯度脫水，用無水乙醇和二甲苯進行透明處理，然后放入二甲苯和石蠟溶液中浸蠟處理后進行包埋，蠟塊切片后進行番紅固綠染色，用二甲苯透明處理，干燥后中性樹膠封片。用Nikon顯微鏡（Eclipse Ci-S，日本）觀察拍照，使用CaseViewer 2.3 軟件進行葉片厚度、表皮厚度、柵欄組織厚度、貯水組織厚度以及維管束面積的測量，重復5 次。

1.3 生理指標測定及分析

采用分光光度法測定葉綠素含量；采用考馬斯亮藍 G-250 染色法測定可溶性蛋白含量；采用酸性茚三酮法測定脯氨酸含量；采用四氯化鈦比色法測定過氧化氫含量；采用氮藍四唑（NBT）染色法測定SOD 活性；采用愈創木酚顯色法測定POD 活性；采用紫外吸收法測定CAT 活性；采用硫代巴比妥酸比色法（TBA）測定丙二醛（malondialdehyde， MDA）含量［22］，重復4 次。

1.4 轉錄組測序及分析

使用植物總RNA 提取試劑盒（天根生化科技北京有限公司）按照說明書提取葉片總RNA，各處理重復3 次。質量檢測合格后建庫并測序。對raw data 進行質量控制之后得到clean data，然后使用Trinity （http：//trinityrnaseq. github. io/）軟件進行轉錄組拼接。對拼接后得到的基因進行五大數據庫（Nr，Pfam，Swiss-prot，KEGG，GO）的基因功能注釋。使用feature Counts 軟件計算每個基因在各樣本中表達量FPKM 值。采用DESeq 2 進行基因差異表達分析，差異顯著性標準為padj＜0.05，|log2foldchange|≥1。使用Goseq 對差異表達基因進行GO 富集分析，KEGG 富集分析使用KOBAS（2.0），P＜0.05。使用mapman 軟件進行脅迫相關通路基因表達變化分析。

1.5 實時熒光定量PCR 驗證

在3 個比較組（7 d Vs 0 d，14 d Vs 0 d，28 d Vs 0 d）均有顯著差異表達的基因中隨機挑選6 個差異表達基因，以EF1A為內參基因進行qRT-PCR 分析（表1）。擴增體系：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35 個循環；72 ℃ 10 min。各處理設3 次生物學重復，每個生物學3 次技術重復。

表1 差異表達基因引物序列Table 1 Primers of differentially expressed genes

1.6 數據分析

使用SPSS 17.0 軟件對葉片結構和生理數據進行統計分析，測定結果數據為平均值±標準誤。使用單因素方差分析對不同干旱脅迫處理的數據進行差異顯著性檢驗，Duncan 法進行多重比較。使用Excel，Power Point作圖。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫下豬毛菜葉片解剖結構變化

豬毛菜的表皮細胞排列整齊緊密，有的向外凸起形成表皮毛；表皮細胞內柵欄組織為1 層長圓柱狀細胞，為等葉面全柵欄組織；內側為維管束鞘細胞，兩者緊密排列成連續的環形結構；維管束鞘之內存在發達的貯水薄壁組織，貯水組織中央和外圍有維管束，中央的維管束更大（圖1）。維管束、維管束鞘和柵欄組織共同組成花環結構，符合荒漠生境C4植物的結構特征。

圖1 干旱脅迫下豬毛菜葉片解剖結構Fig.1 Anatomical structures of the leaves of S. collina under drought stress

干旱脅迫0 d 時，柵欄組織排列緊密呈連續的環形，貯水組織細胞飽滿，有晶簇；干旱脅迫7 d 時，貯水組織膨脹、細胞壁平滑、晶簇消失；干旱脅迫14 d 時柵欄組織開始變得稀疏，貯水組織細胞壁開始向外凸起，晶簇再次出現；干旱脅迫28 d 時柵欄組織形成的環形連續性變差，貯水組織細胞壁的凸起程度更高，晶簇更多。

柵欄組織厚度隨著干旱時間延長呈先增加后減小的變化趨勢，重度干旱時顯著減小（表2）。貯水組織厚度在干旱脅迫7 d 時顯著增加（P＜0.05），干旱脅迫28 d 時降低。主維管束面積隨著干旱脅迫時間延長逐漸增大，干旱脅迫28 d 時達到最高， 為（3099.72±151.88） μm2（P＜0.05）。表皮厚度隨干旱脅迫時間的延長呈上升趨勢，干旱脅迫28 d 時達（23.73±0.68） μm，顯著高于其他處理（P＜0.05）。干旱導致葉片厚度顯著增大（P＜0.05），而葉面積減小（7 d 時P＜0.05）。

表2 豬毛菜葉片解剖結構各參數隨干旱脅迫的變化Table 2 Changes of anatomical parameters of leaves of S. collina with drought stress

2.2 干旱脅迫下豬毛菜葉片生理指標變化

豬毛菜葉綠素含量隨干旱脅迫時間延長逐漸降低（圖2）。隨干旱脅迫時間延長，葉片可溶性蛋白含量在7 和28 d 顯著增加（P＜0.05）。脯氨酸含量在干旱脅迫7 和14 d 變化不顯著，干旱脅迫28 d 顯著提高（P＜0.05），為（60.18±4.03） μg·g-1。SOD、POD 和CAT 是植物體內抵御脅迫傷害的抗氧化酶。SOD 和POD 活性在干旱脅迫7 和14 d 差異不顯著，28 d 時SOD 和POD 活性顯著提高（P＜0.05），分別為（860.26±19.93） U·g-1和（32.56±1.91） U·g-1。干旱導致豬毛菜CAT 活性降低，但差異不顯著。過氧化氫和丙二醛是植物受到脅迫時體內產生的毒副物質。干旱脅迫7 d 時過氧化氫含量最低，干旱脅迫14 d 時顯著升高（P＜0.05）。干旱脅迫28 d時丙二醛含量最高（P＜0.05）。

圖2 豬毛菜葉片生理指標隨干旱脅迫的變化Fig.2 Changes of physiological indexes of leaves of S. collina with drought stress

2.3 干旱脅迫下豬毛菜轉錄組分析

轉錄組測序所有樣本的測序數據量均不少于6 G。每個文庫clean reads 超過4900 萬條，12 個文庫共計7.25億條。每個文庫的Q20 值大于98%，Q30 值大于93%，GC 堿基比例大于45%，滿足高通量測序的質量要求。在7和0 d 之間鑒定出103 個差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs），6 個基因上調，97 個基因下調；在14和0 d 之間鑒定出1560 個DEGs，183 個基因上調，1377 個基因下調；在28 和0 d 之間鑒定出270 個差異表達基因（DEGs），78 個基因上調，192 個基因下調（圖3）。實時熒光定量PCR 驗證結果表明6 個差異表達基因的表達趨勢與轉錄組測序的結果相關性極高（R2=0.8779），說明轉錄組測序結果可信度和準確性較高（圖4）。

圖3 不同程度干旱脅迫差異表達基因火山圖Fig.3 Volcanic diagram of differentially expressed genes （DEGs） under different degrees of drought stress

圖4 實時熒光定量PCR 驗證RNA-Seq 數據Fig. 4 Real-time fluorescence quantitative PCR validation RNA-Seq data

2.4 差異表達基因GO 功能顯著性富集分析

干旱脅迫差異表達基因GO 富集分析結果表明（表3），在干旱脅迫7 d Vs 0 d 比較組中主要富集在對拓撲錯誤蛋白質的響應、細胞對未折疊蛋白的反應、層粘連蛋白-5 復合體、蛋白質磷酸酶1 型復合物、檸檬酸合成酶活性、轉移酶活性、轉移酰基等條目。干旱脅迫14 d Vs 0 d 比較組中，主要富集在細胞過程、對化學物質的反應、蛋白結合、結合等條目。干旱脅迫28 d Vs 0 d 比較組中，主要富集在細胞蛋白修飾過程、氧化還原過程、膜整體組件、電子傳遞活性和氧化還原酶活性等條目中。

表3 差異表達基因GO 富集前5 名條目Table 3 Top 5 terms of GO enrichment analysis of the differentially expressed genes

2.5 差異表達基因KEGG 富集分析

干旱脅迫差異表達基因KEGG 富集分析結果表明（圖5），在干旱脅迫7 d Vs 0 d 比較組中，主要富集在礦質養分吸收、類胡蘿卜素生物合成、檸檬酸循環、乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝、氧化磷酸化通路中；干旱脅迫14 d Vs 0 d 比較組中，主要富集在核糖體、氧化磷酸化、DNA 復制、細胞循環、蛋白酶體通路中；干旱脅迫28 d Vs 0 d 比較組中，主要富集在氨基糖和核苷酸糖代謝、MAPK 信號通路-植物、氧化磷酸化、類固醇生物合成代謝途徑中。

圖5 差異表達基因KEGG 富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes

2.6 氧化磷酸化通路差異表達基因分析

氧化磷酸化途徑多數基因隨干旱脅迫時間延長而逐漸下調，在干旱脅迫14 d 時表達量最低，到干旱脅迫28 d 時上調（圖6）。復合物Ⅰ（NADH 脫氫酶）的成員NADH 脫氫酶亞基1（NADH dehydrogenase subunit 1，ND1）、ND3和ND4在干旱脅迫14 d 上調。復合物Ⅲ（細胞色素bc1 復合體）和復合物Ⅳ（細胞色素c 氧化酶）成員ubiquinol-cytochrome c reductase（CYTB）和cytochrome c oxidase subunit 1（COX1）等在干旱脅迫7 d 下調，14 d 上調。復合物Ⅴ（ATP 合成酶）多數基因在干旱脅迫14 d 下調，在28 d 上調。F-type H+-transporting ATPase subunit delta（ATPeF1D）和F-type H+-transporting ATPase subunit O（ATPeF0O）在干旱脅迫14 d 上調，28 d 下調。

圖6 氧化磷酸化途徑差異表達基因Fig.6 Differentially expressed genes of oxidative phosphorylation pathway

2.7 脅迫相關通路基因表達變化分析

脅迫相關基因在輕度干旱下較少，且多數下調（圖7a）。在中度干旱脅迫下差異表達基因最多，非生物刺激相關基因中熱激蛋白基因heat shock protein 70 cognate 1（HSC70-1），heat shock protein 70（HSP70），heat shocklike protein 90.1（HSP90.1）等上調表達，氧化還原反應中的硫氧化還原蛋白基因（disulfide isomerase-like，PDIL）兩個上調兩個下調，部分谷胱甘肽過氧化物酶基因（glutathione peroxidase2，GPX2）上調，過氧化物酶基因peroxidase（POD）有一個上調其余下調。COP9光信號基因上調，鈣信號通路基因calcium-dependent protein kinase 19（CPK19）和CBL-interacting protein kinase 9（CIPK9）、部分G 蛋白信號和一個MAPK 信號通路MAP 激酶基因PAS domain-containing protein tyrosine kinase family protein（F7H19.240）上調表達。ERF、WRKY和MYB轉錄因子下調表達。生長素信號轉導通路基因GH3.9和乙烯信號轉導通路基因RH20上調。蛋白質降解通路大部分基因上調。次級代謝通路的酰基活化酶基因（acyl activating enzyme 1，AAE1），磷酸吡哆醛依賴轉移酶超家族蛋白基因（aromatic aldehyde synthase，AAS）上調（圖7b）。

圖7 脅迫相關通路基因表達隨干旱脅迫的變化Fig. 7 Gene expression of stress-related pathways changes with drought stress

重度干旱脅迫下，非生物刺激相關基因中heat shock-like protein 70（HSP70），heat shock-like protein 81.4（HSP81.4），heat shock-like protein 81.2（HSP81.2）等熱激蛋白基因顯著上調表達。氧化還原反應中超氧化物歧化酶基因SOD（superoxide dismutase）和過氧化物酶基因POD（peroxidase）上調。乙烯信號轉導基因RH20下調。次級代謝途徑的咖啡酸3-O-甲基轉移酶基因（caffeic acid 3-O-methyltransferase-like，CAOMT）、黃酮醇合酶/黃酮3-羥化酶基因（flavonol synthase/flavanone 3-hydroxylase-like）和黃烷酮3-羥化酶基因（flavanone 3-hydroxylase，F3H）上調，細胞壁生物合成酶葡糖醛酸脫羧酶基因（UDP-glucuronate decarboxylase 1，UXS1）上調（圖7c）。

3 討論

植物受到環境脅迫的分子響應包括脅迫感知、信號轉導和脅迫敏感基因的表達。鈣（Ca2+）信號通路是植物響應干旱脅迫的重要信號通路。通過質膜傳輸的Ca2+在細胞質中可以激活鈣調磷酸酶B 樣蛋白（calcineurin Blike protain，CBL）及其互作蛋白激酶（CBL-interacting protein kinase，CIPK），它們是Ca2+傳感器和效應器［4，23］。CIPK 通過一種微調機制參與環境脅迫下不同途徑的調控［24］。MdCIPK22過表達促進了轉基因蘋果（Malus domestica）植株的糖積累和抗旱性的提高［25］。擬南芥（Arabidopsis thaliana）CPK6過表達株系表現出較強的耐旱性［26］。辣椒（Capsicum annuum）CaCIPK7通過提高植株ROS 清除酶和抗壞血酸-谷胱甘肽（ascorbate-glutathione，AsA-GSH）循環的活性來提高抗旱性［27］。豬毛菜Ca2+信號通路基因CIPK9和CPK19在中度干旱脅迫時顯著上調。推測豬毛菜可通過上調Ca2+傳感器和效應器蛋白激酶基因CIPK9和CPK19轉導干旱脅迫信號。

MAPK 信號通路是植物應對非生物和生物脅迫的重要工具，它通過轉導信號響應細胞外刺激來調節反應。ROS 的積累是生物和非生物脅迫條件下MAPK 信號的激活因子［8］。MAP3Ks 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過G 蛋白結合位點、SH3 綁定結構域和PH 結構域等特定結構域接收脅迫信號，激活不同級聯途徑調節下游基因［5］。MAP3K18 激酶參與擬南芥的氣孔信號轉導和發育，可能通過調控氣孔信號轉導參與抗旱。棉花（Gossypium hirsutum）GhMAP3K49基因被ABA 和ROS 顯著誘導，參與了ROS（H2O2）和ABA 介導的對各種非生物脅迫的反應［28］。干旱條件下馬鈴薯（Solanum tuberosum）StMAPK11上調可促進SOD、CAT 和POD 活性從而提高抗旱性［29］。本研究MAP 激酶基因F7H19.240在中度干旱脅迫時上調，推測豬毛菜在中度干旱脅迫時通過上調MAP 激酶基因F7H19.240轉導干旱脅迫信號。

植物在非生物脅迫下產生ROS。ROS 是信號分子，而ROS 的過量產生會對蛋白質、脂質、細胞膜、DNA 和葉綠素造成不可修復的損害［4，30］。桑樹（Morus alba）在干旱脅迫下ROS 積累增多，ROS 作為信號分子可以促進桑樹抗逆性［31］。與前人研究結果相似，本研究中與輕度干旱相比，中度干旱脅迫時豬毛菜葉片中H2O2含量顯著升高，在解剖結構上輕度干旱脅迫時葉片貯水組織厚度最大，隨后逐漸減小（表2），推測輕度干旱脅迫下豬毛菜貯水組織細胞吸水使活性氧H2O2含量降低，中度干旱脅迫時貯水組織中水分減少導致活性氧H2O2的積累增加。同時，豬毛菜葉片中葉綠素含量隨干旱脅迫時間的延長逐漸降低，可能是由于干旱脅迫產生的活性氧積累對葉綠素產生了持續的破壞作用［4，30］。ROS 的清除是通過非酶途徑和酶途徑來完成的。植物酶促防御系統包括硫氧還蛋白（thioredoxin）、SODs、PODs、CATs、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPXs）等；非酶自由基清除劑主要由谷胱甘肽、脯氨酸、黃酮類和抗壞血酸等抗氧化物質組成，抵御氧自由基、抑制脂質過氧化，保護膜的完整性［30］。檸條在干旱脅迫下GPX基因上調表達［10］。還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）和H2O2在GPX 的催化下生成水和氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG），抵御非生物脅迫［30］。本研究中，中度干旱脅迫時豬毛菜GPX和POD基因上調，推測用來防御H2O2對膜質的破壞。POD 可清除H2O2，同時將初期過氧化物氧化生成MDA，MDA是反映膜脂過氧化程度的指標，后期保護酶將其徹底清除［8］。本研究豬毛菜中MDA 含量在重度干旱脅迫時顯著升高，這一結果與光叉委陵菜（Potentilla bifurca）MDA 含量在干旱脅迫25 d 內持續升高的結果相似［32］，與此同時POD 活性顯著增大，推測重度干旱脅迫時POD 催化過氧化物氧化生成更多的MDA。本研究中，重度干旱下豬毛菜SOD 和POD 活性顯著提高而CAT 活性無顯著變化，可能是由于不同植物或者不同器官對脅迫的反應有差異［33］。重度干旱脅迫下，豬毛菜POD和SOD基因上調，這一結果與SOD 和POD 活性顯著提高相符；另外非酶自由基清除劑黃酮類合成通路基因上調、脯氨酸含量顯著增加，可能幫助豬毛菜抵御新一輪的氧自由基破壞。

呼吸作用在線粒體中進行，通過氧化作用和磷酸化作用的偶聯反應產生ATP，為細胞生命活動提供能量來源。電子從NADH 或FADH2通過兩條不同的途徑從泛醌傳遞給分子氧生成水，并偶聯ADP和Pi 生成ATP。當干旱等脅迫阻礙了沿著初級細胞色素介導的氧化途徑的電子傳遞時，ATP 的生成就會減少［7］。因此，植物在干旱脅迫條件下的呼吸速率增加，導致碳資源消耗失衡，ATP 合成減少，ROS 產量增加［6］。花生（Arachis hypogaea）耐旱性更強的材料復合體Ⅰ中NADH 泛醌氧化還原酶基因和復合體Ⅴ中ATP 合酶基因顯著上調，顯示其在逆境下具有更強的能量代謝能力［34］。電子傳遞系統復合體Ⅲ基因ppr40-1突變體應激敏感性的增強伴隨著活性氧的積累、脂質過氧化的增強、SOD 活性的提高以及幾種應激反應基因的激活改變，表明擬南芥氧化呼吸調節與非生物脅迫響應密切相關［35］。與之相似，本研究中氧化磷酸化途徑復合體Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ多數基因的表達量在輕度和中度干旱下持續下調，表明在干旱脅迫下豬毛菜呼吸電子傳遞鏈上氧化和磷酸化過程均受到影響，ATP 合成受到抑制，同時ROS（H2O2）含量顯著增加；在重度干旱脅迫下氧化和磷酸化途徑基因上調，同時SOD 和POD 活性顯著提高。推測豬毛菜在重度干旱脅迫下可通過上調氧化磷酸化途徑的基因來增強能量代謝，提高SOD 和POD 活性，抵御嚴重的干旱。

植物可以通過多種形態和生理途徑耐受干旱脅迫環境，如細胞膨壓降低，葉片變小變厚，表皮變厚，滲透調節等［4］。在本研究中豬毛菜在干旱脅迫下也出現了葉面積變小、變厚，表皮增厚的顯著變化。在旱生植物中普遍存在晶簇，晶簇的積累可以降低細胞滲透勢，是植物的抗旱特征［36］。豬毛菜屬植物葉片貯水組織中存在晶簇［17］。本研究在無脅迫豬毛菜貯水組織中也觀察到晶簇，在輕度干旱脅迫時可溶性蛋白含量顯著增加，與之相對應的是蛋白質降解通路基因下調、葉片貯水組織厚度顯著增加和細胞膨脹晶簇消失。輕度干旱脅迫下滲透調節物質可溶性蛋白含量增加［37］，推測豬毛菜在輕度干旱脅迫下通過蛋白質降解通路基因下調促進可溶性蛋白的積累，降低細胞滲透勢，促進細胞吸水，從而葉片貯水組織膨脹，晶簇吸水后消失［36］。中度干旱脅迫時可溶性蛋白含量顯著降低，與之對應的是蛋白質降解通路基因多數上調和貯水細胞中晶簇少量出現。推測豬毛菜此時在更強的干旱脅迫下蛋白質降解，細胞開始失水，晶簇變多。豬毛菜在重度干旱脅迫下可溶性蛋白含量再次顯著增加，與之對應的是蛋白質降解通路基因多數下調；表皮厚度顯著增加但是貯水組織的厚度沒有隨之增加，細胞中晶簇增多。推測豬毛菜在嚴重的干旱脅迫下再次通過下調蛋白質降解通路基因幫助積累可溶性蛋白，然而由于此時土壤水分嚴重虧缺導致細胞無法吸收更多水分，釋放水分后晶簇出現更多［36］。

4 結論

輕度干旱脅迫導致豬毛菜下調蛋白質降解通路基因，可溶性蛋白質含量增加，貯水組織細胞吸水膨脹且晶簇消失，葉片變厚面積變小。中度干旱脅迫使豬毛菜貯水組織細胞失水晶簇出現，呼吸作用氧化磷酸化途徑多數基因下調，ATP 合成受阻，H2O2含量增加，Ca2+及MAPK 信號通路接收和傳導脅迫信號，上調GPX和POD幫助清除H2O2。重度干旱脅迫下晶簇增多、葉表皮增厚、MDA 含量增多，通過上調POD、SOD增加SOD 和POD 活性，上調氧化磷酸化途徑基因增強能量代謝，并增加脯氨酸含量和誘導黃酮類合成基因表達來清除ROS。研究結果為豬毛菜強抗旱基因的挖掘提供了參考資料。