全株水稻表面優勢乳酸菌的篩選與鑒定

黃麗娟，孫镕基，高文婧，張志飛*，陳桂華，2*

（1. 湖南農業大學農學院，湖南 長沙 410128；2. 水稻油菜抗病育種湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128）

我國水稻（Oryza sativa）秸稈資源年產量已達2.3×108t，資源十分豐富，但因其質地粗糙，并含有一定量的木質素和二氧化硅等，適口性差、消化率低，不宜直接飼喂。未完全枯黃的新鮮水稻秸稈中細胞壁纖維木質化的程度較干稻秸稈低，青貯通過乳酸菌發酵可溶性碳水化合物（water soluble carbohydrates，WSC）產生大量乳酸（lactic acid，LA），其酸化作用可將部分纖維素（cellulose，CL）和半纖維素（hemicellulose，HC）降解為WSC，提高其適口性和營養價值，同時pH 值快速降低，能抑制不良微生物的生長，減少營養物質的損失，并且青貯還可提高水稻秸稈中干物質（dry matter，DM）和中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）的慢速降解部分，有效提高DM 和NDF 的瘤胃有效降解率，是水稻秸稈飼料化利用最為有效的方式之一［1］。研究發現，飼喂水稻秸稈青貯飼料可以提高山羊、肉牛等的采食量、日增重等生長性能［2-3］。

常規青貯中，青貯原料表面附著的乳酸菌數量是決定青貯是否能成功發酵的因素之一，而水稻秸稈表面乳酸菌常低于需求量（105CFU·g-1FM），需額外添加乳酸菌幫助發酵，但有時商用乳酸菌制劑可能受原料特性或青貯發酵條件等的影響，對水稻秸稈青貯無改善效果［4］。研究發現，從植物表面篩選的乳酸菌較常規商用乳酸菌對原生材料有更好的生長適應性，可能對青貯有更好的改善作用，如Cheng 等［5］研究發現從新鮮構樹（Broussonetia papyrifera）葉片上分離的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BP17 較商業乳酸菌劑（植物乳桿菌和布氏乳桿菌混合）更為有效地改善了構樹青貯品質，可以顯著提高LA 含量，減少粗蛋白（crude protein，CP）損失，降低pH 值和氨態氮/總氮（ammoniacal nitrogen/total nitrogen，AN/TN）。

目前，對附生乳酸菌的分離與篩選已有諸多研究，已篩選出許多產酸強、耐高溫、耐低溫等與改善青貯品質相關功能的優勢乳酸菌［6-7］。除改善青貯品質外，乳酸菌的抗氧化功能也已被發掘出來，在人畜健康中的作用備受關注。乳酸菌可以在動物腸道中定殖，促進代謝，平衡體內自由基失衡狀態，有效預防和控制氧化應激導致的相關疾病等［8］。通過增加具有抗氧化能力的生物活性物質，如乳酸菌等有助于提升青貯的抗氧化活性［9］。因此，本研究從不同生育期全株水稻表面分離篩選出生長速度快和產酸能力強的乳酸菌，并以H2O2耐受能力和自由基清除能力為指標篩選出具有高抗氧化活性的優勢乳酸菌，以期挖掘出青貯優良菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料來源與樣品準備

于2021 年6 月3 日在湖南農業大學耘園基地（28°11′02″ N，113°04′34″ E）種植，常規水肥管理。在不同生育期（育苗期、分蘗期、拔節期、孕穗期、抽穗期、揚花期、乳熟期、蠟熟期、完熟期）采集全株水稻100～500 g，于-20 ℃冰箱內保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 附生乳酸菌的分離 參考田靜［10］的方法，于2021 年6-12 月，將每次所取的樣品稱取10 g 加入裝有90mL 無菌生理鹽水的錐形瓶中，在30 ℃、300 r·min-1的搖床上振蕩15 min 后，在超凈工作臺上進行稀釋、涂板等操作。在厭氧箱中37 ℃培養48 h 后，挑取MRS 培養基上形態、大小、顏色等不同的菌落純化3 次，對其進行革蘭氏染色和過氧化氫酶接觸試驗［11］。

MRS 培養基：蛋白胨（10.0 g）、牛肉粉（5.0 g）、酵母粉（4.0 g）、葡萄糖（20.0 g）、吐溫80（1.0 mL）、七水磷酸氫二鉀（2.0 g）、三水乙酸鈉（5.0 g）、檸檬酸三銨（2.0 g）、七水硫酸鎂（0.2 g）、四水硫酸錳（0.05 g）、瓊脂（15.0 g）、蒸餾水（1 L），pH 值（6.2±0.2），121 ℃高壓滅菌15 min。

1.2.2 生長速度快和產酸能力強的乳酸菌的篩選 參考張慶［11］的方法，將革蘭氏染色陽性和過氧化氫酶陰性的菌株37 ℃恒溫培養48 h 后測定菌液的OD600nm值和pH 值（3 次重復），篩選出生長能力和產酸能力強（OD600nm值＞2 和pH 值＜4）的優勢乳酸菌。

1.2.3 抗氧化乳酸菌的篩選 1）乳酸菌耐過氧化氫能力測定：參照李丹丹［12］的方法，將篩選出的優勢乳酸菌以3%接種量接種于初始H2O2濃度為0、1、2、3 mmol·L-1的MRS 液體培養基中，37 ℃培養8 h，測定不同H2O2濃度下600 nm 處的OD 值（3 次重復）。2）自由基清除能力測定：參考李丹丹［12］和陳明［13］的方法，將活化好的乳酸菌接種于MRS 液體培養基中，37 ℃培養24 h，將培養液經8500 r·min-1，4 ℃離心10 min 后，收集上清液即為發酵上清液（cell fermentation supernatants，CFS）；所得菌體用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌3 次，再重懸于PBS 中，調整細胞濃度為109CFU·mL-1，分為兩份，其中一份為完整菌體（intact cells，IC）；另一份經超聲波破碎儀（KS-650ZND，昆山潔力美）冰浴處理后，以8500 r·min-1，4 ℃離心10 min 后，收集上清液，即為無菌體提取物（cell free extracts，CFE）。分別測定其DPPH 自由基［12］、羥自由基［12］及超氧陰離子自由基清除率［13］（3 次重復）。

1.2.4 優勢乳酸菌特性分析及鑒定 1）生理生化特性分析：參考李小鈴等［14］的方法，測定乳酸菌的耐酸能力（pH 值：3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0）；耐溫能力（5、10、37、45 和50 ℃）；耐鹽能力（3.0%、6.8%和10.0% NaCl）（3次重復）；利用細菌微量生化鑒定管（廣東環凱微生物科技有限公司）進行葡萄糖產氣及碳源發酵試驗。2）生長及產酸曲線的測定：按3%接種量將活化好的乳酸菌菌液接種于MRS 液體培養基中（pH 值6.5），37 ℃，250 r·min-1振蕩培養24 h，每隔2 h 取樣測定pH 和OD600nm值，以未接菌的培養基調零，以培養時間為橫坐標，以相應的OD600nm值或pH 值為縱坐標，繪制生長和產酸曲線（3 次重復）。3）16S rRNA 分子鑒定：PCR 擴增引物序列為：27F（5′-CAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。反應體系（25 μL）為：引物27F 和1492R（10 μmol·L-1）各1 μL，2×Master Mix 12.5 μL，ddH2O 補足至25 μL，挑取培養24～48 h 的新鮮菌落于反應體系中混勻。反應條件：95 ℃預變性3 min，30 個循環（94 ℃變性25 s，55 ℃退火25 s，72 ℃延伸25 s），72 ℃保持5 min 使產物延伸完整。將擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，將有條帶的PCR 產物送樣測序，在NCBI 網站上進行序列比對，確定各菌株分類地位。

1.3 數據統計與分析

采用Excel 2016 對數據進行統計與分析；采用DPS 7.05 軟件在0.05 顯著水平下對各指標進行單因素LSD多重比較分析；采用Origin 2023 對圖形進行繪制；利用MEGA 11 中的Clustal W 對最近類群的序列進行多重比較分析；并使用軟件中的鄰接法（neighbor-joining method）構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 附生乳酸菌的分離

從各生育期水稻表面共分離得到180 株細菌。在MRS 培養基上為乳白色、邊緣光滑且中間凸起的菌落形態，符合乳酸菌的形態特征［15］。經革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗鑒定，有154 株菌株革蘭氏染色陽性（紫色）、過氧化氫酶試驗陰性（無氣泡），符合乳酸菌的生理生化特征［15］，初步確定為乳酸菌。

生源地為城市的大學生內隱自殺意念得分顯著高于生源地為農村的大學生，與之前一些研究者通過外顯問卷測量得到的結果相一致[37]，原因可能在于與生源地為農村的大學生相比，家住城市的大學生抗挫折能力相對不夠，情緒易受外界影響而產生自殺意念.本研究發現，不同家庭類型大學生的自殺意念存在顯著差異，普通家庭類型大學生內隱自殺意念得分顯著高于多代家庭類型的大學生，原因可能在于多代家庭類型大學生家庭成員較多，可以獲得情感上的溝通、交流與支持，因而更加積極樂觀.

從‘卓201S/6W1622（A）’、‘卓201S/6W1003（B）’、‘展998S/X5H008（C）’、‘展998S/4W0802（D）’和‘展998S/R302（E）’上分離的菌株數分別為33、32、30、24 和35 株，共154 株，其中25.32%分離自拔節期，19.48%分離自分蘗期，13.64%分離自揚花期（圖1）。

圖1 不同品種及不同生育期分離細菌數量Fig.1 The number of bacteria isolated from different varieties and different growth stages

2.2 生長速度快和產酸能力強的乳酸菌篩選

154 株乳酸菌培養48 h 后，菌液的OD600nm值為0.213～2.268，pH 值為3.70～5.31，其中OD600nm值＞2且pH 值＜4 的乳酸菌有16 株（圖2），為篩選出的生長速度快和產酸能力強的優勢乳酸菌，其中14 株分離自育苗期和拔節期。

圖2 154 株乳酸菌在MRS 液體培養基中培養48 h 時的OD600nm值及pH 值Fig. 2 The OD600nm value and pH value of 154 strains of lactic acid bacteria cultured in MRS liquid medium at 48 h

2.3 抗氧化乳酸菌的篩選

2.3.1 乳酸菌耐H2O2能力 對篩選得到的16 株生長速度快和產酸能力強的乳酸菌進行耐H2O2試驗，16 株乳酸菌在0 mmol·L-1H2O2條件下，OD600nm值為1.430～1.956，生長狀況良好（表1）。隨著H2O2濃度逐漸升高，菌株的生長情況受到不同程度的影響，當H2O2濃度為2 mmol·L-1時，所有菌株OD600nm值均顯著下降（P＜0.05）。當H2O2濃度為3 mmol·L-1時，有7株菌無法正常生長；另有9 株菌OD600nm值為1.016～1.614，說明這9 株乳酸菌（YMA3、BJA4、BJD4、BJD7、BJE1、BJE8、BJE11、CSE9、YHE4）能在3mmol·L-1H2O2條件下良好生長，具有較強的H2O2耐受能力，可用于下一步自由基清除試驗。

表1 不同H2O2濃度下16 株乳酸菌的生長情況Table 1 Growth of 16 strains of lactic acid bacteria at different H2O2 concentrations （OD600nm value）

2.3.2 乳酸菌清除自由基能力 不同菌株的完整菌體對DPPH 自由基清除率為4.52%～9.23%，清除率較低。無菌體提取物組對DPPH 自由基清除率為17.53%～34.67%，高于完整菌體組（表2）。發酵上清液組的DPPH 自由基清除率大于完整菌體組及無菌體提取物組，為72.21%～75.56%，其中菌株BJE11 發酵上清液的DPPH 自由基清除率顯著高于其他菌株（P＜0.05），為75.56%。

表2 9 株乳酸菌對3 種自由基的清除率Table 2 The scavenging rate of 3 kinds of free radicals by 9 strains lactic acid bacteria （%）

不同菌株的完整菌體對羥自由基的清除能力存在較大差異，清除率為9.24%～62.12%，其中菌株YMA3 的清除率顯著高于其他菌株（P＜0.05），為62.12%。有7 株乳酸菌無菌體提取物檢測到對羥自由基具有清除能力，清除率為8.69%～21.31%，均低于完整菌體組。發酵上清液組的羥自由基清除率也高于無菌體提取物組，清除率為13.17%～72.46%，菌株間差異較大，其中菌株YMA3 的清除率顯著高于其他菌株（P＜0.05），為72.46%。

有8 株乳酸菌的完整菌體檢測到了超氧陰離子自由基清除能力，清除率為5.57%～86.33%，菌株間差異較大，其中菌株YMA3 的清除率最高，為86.33%。無菌體提取物組的超氧陰離子自由基清除能力均較低，清除率為2.65%～6.40%。僅有CSE9 的發酵上清液檢測到了超氧陰離子自由基清除能力，清除率為3.33%。

2.4 優勢乳酸菌的特性分析及分子生物學鑒定

2.4.1 生理生化特性分析 乳酸菌YMA3 對羥自由基和超氧陰離子自由基清除率均為最高，分別為72.46%、86.33%，對DPPH 自由基清除率也較高，為72.23%，其抗氧化活性綜合表現最好，為篩選出的抗氧化能力最高的優勢乳酸菌。

對優勢乳酸菌YMA3 進行生理生化特性分析結果顯示（表3），菌株YMA3 革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性、葡萄糖發酵不產氣，為同型發酵乳酸菌。 能在pH 3.5～7.0、10～50 ℃以及3.0%～6.8% NaCl 條件下良好生長，在pH 3.0、5 ℃及10.0% NaCl 的極端環境下生長能力較弱。

表3 菌株YMA3 的生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain YMA3

YMA3 可以利用七葉苷、水楊苷、纖維二糖、木糖、鼠李糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、山梨醇，共10 種碳源，碳源利用范圍廣（表4）。

表4 菌株YMA3 的碳源利用特性Table 4 Carbon source utilization characteristics of strain YMA3

2.4.2 生長曲線及產酸曲線的測定 YMA3 在培養0～6 h 時迅速繁殖，處于對數生長期，6 h 后，生長速率減緩，在18 h 后趨于穩定，進入穩定生長期。菌株的生長速率與產酸速率基本表現一致，在菌株進入生長期時產酸速率變快，穩定期時產酸速率則趨于平緩。培養24 h 后乳酸菌的OD600nm值達2.111，pH 值降至3.95（圖3）。

圖3 菌株YMA3 的生長曲線及產酸曲線Fig. 3 Growth curve and acid-producing curve of strain YMA3

2.4.3 優勢乳酸菌的鑒定 分離株YMA3 與糞腸球菌（Enterococcus faecalis）的親緣關系最近，為100%，因此確定菌株YMA3 為糞腸球菌（圖4）。

3 討論

從植株表面分離的附生乳酸菌對其材料本身具有更好的適應性和特異性，因此，從中分離篩選出的優勢乳酸菌用于青貯接種劑是一種更高效的方法［16］。而篩選青貯接種劑的重要指標是生長速度和產酸能力，生長速度快和產酸能力強的乳酸菌直接影響著青貯品質［17］。本試驗從水稻表面共分離了154 株乳酸菌，大部分乳酸菌培養48 h 后OD600nm值為0.6～1.6，pH 值為4.0～4.6，說明水稻表面大部分乳酸菌的生長速度和產酸能力較弱，若直接進行水稻常規青貯可能難以取得較好的青貯效果。翟海瑞［18］從柱花草（Stylosanthes guyanensis）表面分離出一株產酸能力和生長能力強的類植物乳桿菌（Lactobacillus paraplantarum）HN113，培養18 h 后pH 值可達3.85，OD600nm可達2.0 以上，添加HN113 可以提高柱花草青貯中乳酸菌的數量，降低好氧細菌和酵母菌的數量，降低青貯pH 值，顯著提高LA 和CP 含量，顯著降低NDF 和酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）及AN 含量，有效地改善了柱花草青貯品質。本試驗中篩選獲得的糞腸球菌YMA3 在發酵初期時遲滯期不明顯，培養14 h 后，pH 值可以降低至4.2 以下（優質青貯標準），OD600nm值可達2.167，說明YMA3 在培養初期時能迅速復蘇，起到快速繁殖和降低pH 值的作用，符合生長速度快和產酸能力強的乳酸菌篩選標準，適用于青貯發酵［6，11］。

乳酸菌主要通過清除自由基、螯合金屬離子、酶調節和調節腸道微生物群來發揮抗氧化作用［19］。目前許多乳酸菌已被鑒定出有抗氧化能力，如鄒思博等［20］從自然發酵的酸菜中篩選出了1 株抗氧化能力較強的植物乳桿菌SC3，其完整菌體對羥自由基和DPPH 自由基清除率分別為45.28%和43.66%。本試驗中，糞腸球菌YMA3 綜合表現最好，發酵上清液對DPPH 自由基和羥自由基清除率均較高，為72.23%和72.46%，完整菌體對超氧陰離子自由基的清除率最高，為86.33%。Shen 等［21］研究發現從健康百歲老人糞便樣本中篩選出的動物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis）01 的發酵上清液有較強的抗氧化能力，對DPPH 自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基的清除率為73.11%、78.32%、86.39%。 Yang 等［22］從海南黑山羊胃腸道中篩選出的發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）HCS-05 具有較強的抗氧化能力，對各種自由基的清除能力均為60%以上，且發酵上清液處理組的抗氧化能力高于完整菌體組和無菌體提取物組，可能是因為菌種之間抗氧化能力差異較大。

目前大多數商業乳酸菌添加劑的最適發酵溫度為30 ℃，但發酵時青貯堆中心溫度高達40 ℃，普通商用接種劑會受到限制［23］，因此，篩選耐高溫的乳酸菌對湖南這種高溫濕熱地區的青貯來說至關重要。本試驗中，YMA3能在50 ℃高溫條件下良好生長，具有較強的耐高溫能力，這可能因為YMA3 分離自夏季高溫季節，這也間接說明自然界中存在著能適應該地區特殊環境的天然優勢乳酸菌［24］。

本試驗篩選出的糞腸球菌YMA3 存在于我國《飼料添加劑品種目錄（2013）》［25］中，近年來，許多專家學者已從多種不同材料來源篩選出了具有優良特性的糞腸球菌，在改善青貯品質及其他方面已有大量應用。如糞腸球菌TBT608 能提高玉米（Zea mays）秸稈青貯LA 含量，降低乙酸（acetic acid，AA）含量及pH 值，抑制丁酸（butyric acid，BA）和AN 的產生，還能提高瘤胃體外干物質消化率（in vitrodry matter digestibility，IVDMD），飼喂后能提高泌乳期奶牛的產奶量、乳脂和乳蛋白含量等［26］。糞腸球菌L11 產生的細菌素能抑制大腸桿菌（Escherichia coli）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）、金黃葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等致病菌的生長［27］。糞腸球菌YFI-G720 添加到鯽魚飼糧中可以改善腸道菌群組成，提高鯽魚免疫能力和致病性［28］。糞腸球菌CTB374-1 可能存在纖維素酶基因，能降解纖維素［29］。此外，糞腸球菌在醫學研究等方面也具有潛在價值［30］，說明糞腸球菌具有廣泛的應用前景。本試驗僅對乳酸菌的生長速度、產酸能力、抗氧化、生理生化、碳源利用等特性進行了分析，更多的功能特性等待挖掘。

4 結論

本試驗從水稻表面共分離出了154 株乳酸菌，經篩選得到了16 株生長速度快和產酸能力強的乳酸菌，其中YMA3 綜合表現最好，分離自育苗期的‘卓201S/6W1622’。YMA3 對DPPH 自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基清除率均在70%以上，具有較強的抗氧化特性。同時YMA3 能利用葡萄糖、果糖等多種碳源，還具有較強的耐脅迫能力，為糞腸球菌，屬于《飼料添加劑品種目錄（2013）》［25］，說明YMA3 有繼續作為青貯接種菌的研究潛力。