不同癥狀類型苜蓿病毒病AMV 病原檢測及其寄主范圍測定

周建玲，梁巧蘭，魏列新，周其宇，田龍，陳應娥，王存穎，張國印

（甘肅農業大學植物保護學院，甘肅省農作物病蟲害生物防治工程實驗室，甘肅 蘭州 730070）

苜蓿屬（Medicago）植物通稱苜蓿（Medicago sativa），豆科（Leguminosae）多年生開花草本植物，含有豐富維生素K、維生素C、維生素B 和粗蛋白，動物喜愛食用，是我國種植面積最大的牧草，但是我國仍是世界上最大的苜蓿進口國，國內的苜蓿生產供不應求［1］，并且隨著“振興奶業苜蓿行動”“糧改飼”政策的持續推進［2］，苜蓿的種植面積不斷增加，隨著種植年限的延長，導致苜蓿病毒病的發生和傳播媒介的活動頻率也隨之提高 ，使得苜蓿的產量和品質降低［3］。據報道，侵染苜蓿的病毒病原有50 多種，苜?；ㄈ~病毒（alfalfa mosaic virus，AMV）和紫花苜蓿甲型雙分病毒2（M. sativaalphapartitivirus 2， MsAPV 2）為主要病毒病原，發病率分別為91.7%和74.4%以上［4-5］；郭志鵬等［6］對河南田間紫花苜蓿的30 個品種進行了抗性研究，發現這30 個品種均受AMV 侵染，田間發病率均超過了94%，病情指數為31.56～55.50。甘肅省作為全國苜蓿種植面積最大的省份，苜蓿病毒病發生普遍，平均發病率和病情指數為32.15% 和16.27，蘭州市安寧區、景泰縣田間苜蓿均受到AMV 侵染，檢出率為100%［7］，對苜蓿造成嚴重危害，可使苜蓿干重降低37.0%～66.0%、花粉萌發率降低21.5%、苜蓿根瘤數減少31.0%～67.0%［8］；同時，AMV 傳播方式多樣，侵染能力強，寄主范圍十分廣泛，除了侵染豆科牧草外還可侵染茄科（Solanaceae）、菊科（Asteraceae）、藜科（Chenopodiaceae）等多種經濟作物［9-10］。

病毒侵染寄主植物后，常常會與寄主植物發生一系列相互作用，從而導致寄主植物表現出多種不同類型的癥狀，引起這些癥狀的原因主要是植物病毒與寄主因子相互作用［11-12］。據報道，AMV 侵染苜蓿可使其葉綠素含量顯著降低［13］；感染馬鈴薯Y 病毒脈壞株系（potato virus Y， PVYN）后，煙草（Nicotiana tabacum）葉綠素含量明顯降低。郭興啟等［14-15］認為病毒侵染后植物體內葉綠素含量明顯下降的原因主要有兩種：一種認為病毒侵染激活了葉綠素分解酶而使葉綠素分解，另一種認為葉綠體脂質過氧化與葉綠素的分解存在偶聯機制，病毒的侵染造成組織壞死進而影響葉綠體的生物合成；有研究發現病毒侵染可導致葉綠體發育畸形、數量減少、基粒和類囊體結構變化，黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus， CMV）侵染寄主后會進入葉綠體，導致其畸形發育，使其葉綠素含量降低，出現黃化、褪綠、花葉、畸形、矮化等癥狀［16-17］；同時，病毒侵染寄主后在寄主體內的積累量與癥狀產生也密切相關，張威等［18］的研究發現馬鈴薯A 病毒（potato virus A， PVA）在植物中含量越高，癥狀表現越明顯，主要表現為葉片出現葉緣皺縮、輕花葉，還能導致馬鈴薯（Solanum tuberosum）塊莖嚴重裂口、芽眼變深。

而有關田間癥狀表現不同的苜蓿病毒病是否由AMV 侵染引起、不同癥狀類型的苜蓿病樣中AMV 濃度、葉綠素含量與癥狀表現的關系，以及AMV 對不同寄主的致病性等問題未見系統研究報道。為此，本研究通過對甘肅農業大學苜蓿試驗田中病毒病發生情況進行調查，對以往沒有研究過的癥狀類型進行歸類，測定各種癥狀類型病樣葉片中葉綠素含量，檢測AMV 的有無，分析葉綠素含量和病毒含量與癥狀表現之間的相關性，并對來自不同癥狀表現的AMV 進行提純，測定其對不同寄主的致病性。研究結果對探明苜蓿病毒病癥狀表現與寄主和病毒之間的關系，明確AMV 的寄主范圍，指導苜蓿病毒病的有效防治具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試試劑 苜?；ㄈ~病毒雙抗體夾心酶聯免疫吸附測定（double antibody sandwich enzyme-linked immune sorbent assay，DAS-ELISA）檢測試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司）、吐溫-20（Tween-20）、0.02 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.0）、丙酮、乙醇、0.01 mol·L-1乙二胺四乙酸二鈉、2% TritonX-1000、1%巰基乙醇、0.01 mol·L-1MgSO4、磷酸鉀緩沖液（pH 7.5，0.5 mol·L-1）、氯仿、正丁醇、6%的聚乙二烯吡絡烷酮 6000、NaCl、0.01 mol·L-1MgSO4磷酸緩沖液。

1.1.2 供試寄主 禾本科（Poaceae）：大麥（Hordeum vulgare）、小麥（Triticeae aestivum）、玉米（Zea mays）、燕麥（Avena sativa）；茄科（Solanaceae）：本氏煙（Nicotiana benthamiana）、心葉煙（Nicotiana glutinosa）、普通煙等9科32 種植物種子均購于蘭州市種子市場。

1.1.3 試驗儀器及設備 酶聯免疫測定儀（ELX800，美國Bio-Tek 公司）、人工氣候箱（QRGN-400-3，杭州琦勝電子科技有限公司）、高壓滅菌鍋（LDZF-75L-Ⅱ，上海申安醫療器械廠）、低溫冷凍離心機（LX-165T2R，德國Eppendorf 公司），勻漿機（FS-1，常州丹瑞實驗儀器設備有限公司），磁力攪拌器（HHS1，上海躍進醫療器械有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 田間調查及癥狀類型歸類 于2022 年5-6 月在甘肅農業大學試驗田以及蘭州北濱河路綠化帶苜蓿種植區，調查具有典型病毒病癥狀的病株，按照癥狀類型進行歸類后，使用消毒剪刀采集病株及健康植株若干，做好標記，帶回實驗室，每種癥狀選取長勢一致的病株各5 株，根據葉片有無花葉、畸形，病株是否矮化等表現，進行進一步歸類，統計每種癥狀類型病葉所占比例；并將同一癥狀類型的病葉用自來水沖洗干凈，放在濕紗布上晾干水分后，去葉脈后每100 g 為1 份，分別裝入一次性封口袋中，做好標記后，每個癥狀類型共采集3 份，置于-80 ℃冰箱保存，用于病毒提純［19］；另外稱取每種癥狀類型病葉和健康葉片各0.20 和1.00 g 分別用于葉綠素含量測定和AMV 檢測，每種癥狀類型為一個處理，重復3 次；備用。

1.2.2 葉綠素含量測定 采用丙酮乙醇混合法［20］測定苜蓿葉片的葉綠素含量，步驟如下：將無水丙酮和無水乙醇等體積混合后，取1.2.1 中保存的不同癥狀類型的苜蓿病樣和健康苜蓿各0.2 g，剪碎混勻后分別裝入具塞試管中，并加入10 mL 丙酮乙醇混合液塞緊塞子，置于黑暗條件下24 h，直至試管中苜蓿葉片完全無綠色后，分別加入酶標板中，以健康苜蓿葉片為對照，每個處理設置3 個重復，測定各樣品提取液在波長663、645、470 nm 處的吸光值，將測得的吸光值代入下式計算葉綠素含量。

式中：V為提取液總體積（mL）；FW為樣品鮮重（g）；A663、A645和A470為吸光值；Ca和Cb分別為葉綠素a 和葉綠素b的含量。

1.2.3 不同癥狀類型的苜蓿病毒病病樣AMV 病原檢測 取1.2.1 中保存的不同癥狀類型的苜蓿病樣和健康苜蓿各1 g，加入4 mL 配好的PBS 和適量的石英砂充分研磨后于4 ℃ 2000 r·min-1條件下離心20 min，取上清液即為樣品液，根據AMV DAS-ELISA 檢測試劑盒說明書，取保存于-80 ℃的提純AMV，設置陰性對照、陽性對照、樣品孔，重復3 次。取出酶標板，放置于室溫下30 min，按照DAS-ELISA 試劑盒操作步驟，分別先后加入陰、陽性對照、樣品液和酶液，溫浴、洗滌、拍干。最后加入顯色液和終止液。測定450 nm 波長的OD 值，根據OD 值與臨界值（陰性對照OD 平均值+0.15）的關系，判斷不同癥狀類型病樣中AMV 是否為陽性。

代入Y=226.63X-10.16［19］計算出樣品中AMV 濃度，其中X 為不同病樣450 nm 處所對應的吸光度值。每種癥狀類型病樣為一個處理，每個處理重復3 次。并按下式計算各樣品病毒的檢出率。

1.2.4 AMV 提純 參考陳永萱［21］、金磊磊［22］的方法進行，略有改動。取保存于-80 ℃冰箱中不同癥狀類型的苜蓿病樣各100 g，加入預冷的含0.01 mol·L-1EDTA、2% TritonX-1000、1%巰基乙醇的磷酸鉀緩沖液（pH 7.5，0.5 mol·L-1）200 mL，用勻漿機勻漿至黏液狀，然后加入1∶1 混勻的氯仿和正丁醇10～20 mL 繼續勻漿1～2min，將混合液在4 ℃ 8000 r·min-1下離心20 min，棄沉淀取上清液，在上清液中加入6%的聚乙二烯吡絡烷酮6000，再加入NaCl 使上清液鹽濃度為0.1 mol·L-1，然后放在磁力攪拌器上攪拌4 h 后，將混合液4 ℃ 8000 r·min-1離心20 min，棄上清液，將沉淀充分溶解于0.01 mol·L-1EDTA、1% TritonX-100 的磷酸鉀緩沖液（pH 7.4，0.02 mol·L-1），合并后4 ℃ 4000 r·min-1離心120 min，棄上清液，將沉淀充分懸浮于含0.01 mol·L-1MgSO4磷酸緩沖液中（pH 7.4，0.02 mol·L-1），4 ℃ 12000 r·min-1離心20 min，棄上清液，沉淀用0.02 mol·L-1，pH 為7.0 磷酸緩沖液充分懸浮，后檢測AMV 濃度（同1.2.3），用2 mL 離心管分裝，保存在-80 ℃冰箱中，備用。

1.2.5 提純AMV 對不同寄主致病性測定 選取籽粒飽滿、大小一致的寄主植物種子放入鋪有海綿和濾紙的滅菌培養皿，每皿加入20 mL 滅菌水，蓋上蓋子后將其放置于25 ℃恒溫箱中催芽，待種子發芽后，種植于裝有滅菌土的塑料花盆中（13 cm×15 cm），每盆種植一株，每種寄主種植160 株，做好標記，罩上防蟲網，放置于溫度25 ℃，相對濕度50%，光照強度8000 Lux、光暗交替16 h/8 h（光照/黑暗）的智能人工氣候箱中培養，定期澆水管理，培養至4～5 葉期，備用。

根據1.2.1 中不同苜蓿病株癥狀類型調查結果，采用摩擦接種法［23］，用不同癥狀類型提純的AMV 接種不同寄主，具體方法為：將保存于-80 ℃冰箱中的4 種AMV 提純病毒液取出，放至提前準備好的冰上，待其溶解至室溫，用0.02 mol·L-1PBS（pH 7.0）將其稀釋為60 pg·mL-1的病毒液，備用；選取長勢一致的供試寄主，用滅菌水沖洗接種葉，待葉片干凈后，將其置于黑暗條件下24 h 后取出，一只手從葉片下面托住，在葉片上撒上少量金剛砂，取上述稀釋好的各病毒液20 μL 滴于靠近葉柄的葉面上，另一只手輕輕用手指將提純病毒由葉柄至葉尖單向摩擦1 次，以20 μL 0.02 mol·L-1PBS（pH 7.0）代替病毒接種為對照，接種完成后用洗瓶沖洗葉片，洗去多余的金剛砂和病毒液，每種癥狀類型的提純AMV 分別接種10 株，重復3 次，放置于溫度25 ℃、光照8000 Lux、光暗交替16 h/8 h（光照/黑暗）的智能人工氣候箱中，定期澆水管理，于接種后第30 天，根據下列分級標準，調查各處理寄主的發病情況，每個處理調查50 片葉，重復3 次，按下列公式計算發病率和病情指數。

式中：Di為病情指數；Ni為各級病葉數；Gi為各級病害代表值；NT為調查總葉數。

同時采集各處理的寄主心葉各1 g，以健康植株為對照，制備樣品液，采用DAS-ELISA 法檢測AMV 侵染情況，并計算AMV 濃度（同1.2.3），每個處理重復3 次。

發病分級標準：0 級：寄主植物無癥狀；1 級：葉片微皺或輕微花葉，病株不矮化；2 級：葉片畸形、皺縮或輕度花葉，病株無明顯矮化；3 級：葉片變小，花葉且皺縮，病株矮化為正常植株的1/5 以上；4 級：葉片明顯變小，中度花葉、皺縮、出現壞死病斑，病株矮化為正常植株的2/5 以上；5 級：重度花葉、明顯病斑及壞死，病株矮化為正常植株的3/5 以上。

1.3 數據分析

采用SPSS 22.0 軟件對所測數據進行單因素方差分析，采用Power Point 2019 作圖。

2 結果與分析

2.1 苜蓿病毒病癥狀類型

調查發現，甘肅農業大學試驗田及蘭州北濱河路綠化帶苜蓿種植區，苜蓿病毒病有4 種新的癥狀類型（圖1）。輕花葉型：葉片顏色黃化褪綠，葉片輕微皺縮，葉緣向下（圖1A）；重花葉型：葉片沿著側脈出現黃、綠相間的斑駁，病面平展（圖1B）；葉片邊緣褪綠黃化型：葉片邊緣褪綠黃化且向上翻卷，主脈深綠色，植株稍矮化（圖1C）；葉片畸形皺縮花葉矮化型：葉面扭曲皺縮，葉尖變鈍，并伴有多個小的黃化斑，且病株嚴重矮化（圖1D）；其中病葉率由大到小依次是葉片畸形皺縮花葉矮化型＞重花葉型＞葉片邊緣褪綠黃化型＞輕花葉型，分別占病葉總數的42.52%、24.41%、21.26%和11.81%。

圖1 苜?；ㄈ~病田間4 種癥狀類型Fig.1 Four symptom types of alfalfa mosaic disease in the field

2.2 苜蓿病毒病癥狀表現和葉綠素含量之間的相關性

通過測定4 種癥狀類型的病樣中葉綠素含量發現，各癥狀類型的病葉中葉綠素含量、類胡蘿卜素含量均發生了明顯變化，葉綠素a、b 和總葉綠素含量均顯著低于對照，類胡蘿卜素含量均顯著高于對照；其中輕花葉型的葉綠素a、b 和總葉綠素含量最高，與對照相比分別降低了20.67%、60.29%和39.16%，類胡蘿卜素含量在4 種病樣中最低，與對照相比提高36.23%；葉片畸形皺縮花葉矮化型的葉綠素a、b 和總葉綠素含量最低，與對照相比分別降低了58.00%、76.47%和66.43%，類胡蘿卜素含量最高，比對照相比提高了134.06%，其他兩種癥狀類型病葉的葉綠素a、b、總葉綠素和類胡蘿卜素含量介于二者之間，且差異顯著（P＜0.05）（表1）。

表1 不同癥狀類型苜蓿病樣中病葉率及葉綠素含量Table 1 The rate of diseased leaves and chlorophyll content in alfalfa disease-like with different symptom types

2.3 不同癥狀類型的苜蓿病毒病病樣AMV 病原檢測及其提純

通過對4 種癥狀類型20 份苜蓿病毒病病樣進行DAS-ELISA 檢測，結果發現輕花葉型、重花葉型、葉片邊緣褪綠黃化型和葉片畸形皺縮花葉矮化型病樣中均檢測出AMV，病毒檢出率均為100%，且純化后4 種類型中AMV 濃度均提高，其中葉片畸形皺縮花葉矮化型病樣中AMV 濃度在純化前后均最高，分別為252.96 和343.43 pg·mL-1，輕花葉型病樣中AMV 濃度在純化前后均最低，分別為102.27 和206.18 pg·mL-1，其他2 種癥狀類型介于二者之間（表2）。

表2 不同癥狀類型苜蓿病樣AMV 提純前后DAS-ELISA 檢測Table 2 DAS-ELISA detection of AMV of alfalfa disease-like with different symptom types before and after purification

2.4 不同癥狀表現病樣中提純的AMV 對不同寄主致病性測定及癥狀表現

2.4.1 不同癥狀表現病樣中提純的AMV 對不同寄主致病性測定 將4 種癥狀類型病樣提取的AMV，分別接種至9 科32 種供試植物上，從發病情況觀察發現來源于4 種癥狀類型病樣中的AMV 均可侵染昆諾藜（Chenopodium quinoa）、莧色藜（Chenopodium amaranticolor）、心葉煙、普通煙、番茄（Lycopersicon esculentum）、辣椒（Capsicum annuum）、菜豆（Phaseolus vulgaris）、豇豆（Vigna unguiculata）、豌豆（Pisum sativum）、地三葉（Trifolium subterraneum）、向日葵（Helianthus annuus）、千日紅（Gomphrena globosa）和雞冠花（Celosia cristata）等7 科27 種植物，發病率均為100%，禾本科寄主中大麥發病最嚴重，病情指數為24.17，茄科寄主中馬鈴薯發病最嚴重，病情指數為39.44，豆科寄主中蠶豆（Vicia faba）發病最嚴重，病情指數為39.21，葫蘆科（Cucurbitaceae）寄主中發病最嚴重的為西葫蘆（Cucurbita pepo），病情指數為42.11，菊科寄主中發病最嚴重的是翅果菊（Pterocypsela indica），病情指數為37.71，莧科（Amaranthaceae）寄主中發病最嚴重的為千日紅，病情指數為39.71，藜科寄主中發病最嚴重的是昆諾藜，病情指數為31.46。不同科寄主植物中發病最嚴重的是葫蘆科植物，其平均病情指數為40.06，病毒含量為213.07 pg·mL-1，發病最輕的是禾本科寄主，其平均病情指數為20.56，病毒含量為163.78 pg·mL-1，其他科寄主介于兩者之間（表3）。

2.4.2 不同癥狀表現病樣中提純的AMV 對不同寄主的侵染致病癥狀表現 4 種病樣提純的AMV 對同一寄主的致病癥狀表現一致，且經DAS-ELISA 檢測均為陽性；6 科23 種寄主植物被接種AMV 后表現出明顯的癥狀（圖2）；茄科植物中，本氏煙葉片出現花葉皺縮，侵染后期上部葉片變小，心葉煙葉片前期有蝕紋現象，后期葉片出現白斑枯萎并伴有葉片皺縮，普通煙葉片出現鮮黃色不規則病斑，辣椒、番茄葉片有局部枯斑，新葉嚴重畸形皺縮，茄子葉片皺縮畸形并伴有白色枯斑，馬鈴薯葉片向下卷曲并出現紅褐色病斑；豆科植物中，菜豆和豇豆葉片出現紅褐色病斑，豌豆沒有系統癥狀但托葉出現萎蔫的癥狀，蠶豆葉片皺縮畸形，葉緣向下卷曲，地三葉葉片沿葉脈有褪綠黃化現象，苜蓿葉片出現了典型的花葉皺縮現象；葫蘆科植物中，黃瓜、西葫蘆癥狀表現為褪綠白色病斑，其中西葫蘆在9 科32 種供試植物中發病最嚴重，其病情指數為42.11，病毒濃度為316.19 pg·mL-1（表3）；菊科植物中，萵苣（Lactuca sativa）和向日葵葉片出現壞死枯斑，翅果菊葉片出現紅褐色病斑；藜科植物中，昆諾藜、莧色藜和灰綠藜都表現出系統花葉和不同程度的壞死、畸形癥狀。禾本科4 種寄主在被侵染后僅表現出輕微的矮化現象，但DAS-ELISA 檢測也均為陽性。龍葵（Solanum nigrum）、菊芋（Helianthus tuberosus）、上海青（Brassicachinensis）、大白菜（Brassica pekinensis）和鵝絨藤（Cynanchum chinense）5 種植物在接種AMV 后沒有出現癥狀，DAS-ELISA 檢測為陰性（圖2）。

圖2 AMV 侵染不同寄主的癥狀表現Fig.2 Symptoms of AMV infecting different hosts

3 討論與結論

3.1 苜蓿病毒病癥狀表現與葉綠素、病毒含量的相關性

苜蓿作為AMV 的天然宿主，受AMV 侵染后表現為花葉、皺縮、矮化、卷曲等典型癥狀［24］。經田間調查及室內病原種類鑒定發現，甘肅農業大學苜蓿試驗田新發現的4 種癥狀類型的苜蓿病毒病病樣均有AMV，分別是輕花葉、重花葉、葉片邊緣褪綠黃化型、葉片畸形皺縮花葉矮化型。葉綠體是病毒侵染寄主后癥狀表現的重要靶標［25-26］，植物病毒在侵染寄主植物后其葉綠體受破壞程度、病毒含量與癥狀表現有一定關系，紫花苜蓿感染AMV 后，表現為植株矮化，葉或葉柄扭曲變形，葉片黃化斑駁皺縮等癥狀，其葉綠素含量、凈光合速率、蒸騰速率和氣孔導度較健康植株分別降低了35.16%、93.30%、65.40%和40.00%［27］；馬鈴薯X 病毒外殼蛋白（potato virus X coat protein，PVX-CP）和病毒顆粒，可以使寄主植物的葉綠體膜和類囊體片層的結構改變，導致葉片黃化［28］。

此外，病毒侵染后，寄主植物體內病毒含量與癥狀也密切相關。煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus， TMV）在侵染寄主后，植物葉綠體中的病毒粒子積累量與花葉癥狀呈正相關［29］，馬鈴薯A 病毒的3 種分離物在馬鈴薯上也表現出植株體內病毒含量越高，馬鈴薯癥狀越嚴重，可導致馬鈴薯塊莖嚴重裂口、芽眼變深的嚴重癥狀［18］；番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus， TSWV）侵染寄主植物后表現為典型癥狀的葉部組織細胞中，病毒粒體呈簇狀聚集于細胞質內的內質網池，葉綠體基粒片層降解，線粒體增多［30-31］；萵苣感染TSWV 后，病毒粒體相對含量、亞細胞病變程度與植株癥狀嚴重度呈正相關，在侵染后期自噬體囊泡明顯增多［32］，由此可見，寄主植物葉綠體破壞越嚴重，寄主體內病毒的積累量越多，寄主植物的癥狀表現越嚴重。

本研究還發現，AMV 侵染苜蓿后引起的癥狀表現與葉綠素含量、AMV 含量之間呈正相關，癥狀表現最嚴重的葉片畸形皺縮花葉矮化型病樣的葉綠素a、b、總葉綠素含量均比對照低58.00%以上，類胡蘿卜素含量相比于對照高134.06%，且AMV 含量最高，為252.96 pg·mL-1。另外，據報道在癥狀表現為花葉、黃斑花葉的苜蓿病樣中除了檢測到AMV 之外還檢測到了白三葉草花葉病毒（white clover mosaic virus， WCMV）、菜豆黃花葉病毒（bean yellow mosaic virus， BYMV）和豇豆花葉病毒（cowpea mosaic virus， CPMV），而在皺縮病樣中檢測到了AMV 和BYMV，在黃斑花葉中檢測到了AMV、BYMV 和CPMV 3 種病毒［7］；同時，在葉片表現為斑駁、黃化、皺縮等的苜蓿病樣中檢測出了AMV、紫花苜蓿甲型雙分病毒1（M. sativaalphapartitivirus 1， MsAPV1）、紫花苜蓿丁型雙分病毒1（M. sativadeltapartitivirus 1， MsDPV1）［33］；在癥狀表現為斑駁花葉、黃化、花葉皺縮等的苜蓿病樣中首次檢測到了AMV 和苜蓿卷葉病毒（alfalfa leaf curl virus， ALCV）［34］；而本研究僅測定和檢測了4 種癥狀類型的苜蓿病樣中葉綠素含量和AMV 濃度，而對不同癥狀類型病樣中是否存在其他病毒與AMV 發生復合侵染加重或使癥狀表現不同的問題尚未涉及，還需進一步探究。

另外，AMV 作為典型的正義單鏈RNA 病毒，變異率很高，適應性很強，其外殼蛋白（coat protein， CP）基因序列差異可能導致在同一寄主上的癥狀差異，Xu 等［35］設計了能擴增CP 全序列的引物，克隆測序得到了AMV 分離物的CP 序列信息，發現侵染加拿大馬鈴薯的AMV 分離株與之前報道的馬鈴薯上的AMV 引起的癥狀不一致，不會引起馬鈴薯塊莖的壞死。而本研究中4 種癥狀類型的苜蓿病樣中導致癥狀差異的原因是否與AMV 基因變異有關等問題還有待進一步研究。

3.2 AMV 對不同寄主的致病性測定

AMV 寄主范圍廣泛，可侵染70 多科的700 余種植物［34］，不僅可以侵染多種豆科牧草，如草木樨屬（Melilotus）、三葉草屬（Trifolium）、羽扇豆屬（Lupinus）以及其他具有食用價值的豆科植物，如豌豆、蠶豆、綠豆（Vigna radiata）、赤豆（Vigna angularis）等，茄科植物也是它主要侵染的對象，如本氏煙、心葉煙、番茄、辣椒、馬鈴薯等［33］，對于不同植物，其引起的癥狀表現各不相同，葫蘆科和茄科植物感染AMV 后，可產生花葉、黃化、褪綠、卷葉癥狀［36-37］，豆科植物感染AMV 后，可引起花葉、畸形、壞死癥狀［38-39］。本試驗通過摩擦接種的方法將來自4 種不同癥狀類型的AMV 分別接種到9 科32 種植物上，通過癥狀觀察及DAS-ELISA 檢測，發現其對大麥、小麥、本氏煙、西葫蘆等7 科27 種植物具有侵染性，可引起系統花葉、葉片畸形等典型癥狀，其中茄科植物癥狀表現為系統花葉及葉片畸形皺縮；豆科植物癥狀表現為葉片出現紅褐色病斑、花葉及葉片畸形；菊科、莧科、葫蘆科、藜科植物除了花葉之外，還出現局部枯斑、葉片皺縮畸形等癥狀，其中西葫蘆癥狀表現最嚴重，為褪綠白色病斑，病情指數為42.11，AMV 含量為316.19 pg·mL-1；禾本科4 種寄主植物僅表現出輕微矮化，但DAS-ELISA 檢測發現為陽性。

本研究將4 種癥狀類型病樣分別提純的AMV 摩擦接種寄主植物后，4 個來源的提純AMV 對同一種寄主的致病癥狀均一致，初步確定了這4 種癥狀類型的苜蓿病樣中所含有的AMV 為同一種株型，但其是否存在差異還需進行分子檢測來進一步確定；另外，AMV 還可侵染田旋花（Convolvulus arvensis）、三葉草（Trifolium）、四川錦葵（Malva parviflora）、菊苣（Cichorium intybus）、薄荷（Mentha haplocalyx）、絞股藍（Gynostemma pentaphyllum）等雜草和藥材植物［40-43］，從而擴大病毒存在的范圍，導致其在經濟作物上進一步傳播危害，而本研究僅對AMV對部分重要的經濟作物和雜草做了致病性檢測，而對大部分田間常見雜草和中藥材植物的致病性以及對豆科牧草受AMV 侵染后根瘤數量、花粉數和蛋白含量的影響等問題尚未涉及，還有待進一步研究。