化橘紅黃酮類化合物對黃嘌呤氧化酶抑制活性研究

＊何勤勤 鄧詩婷 林歡 楊澤林 何玉冰 韓寒冰 黃新敏

（廣東石油化工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院 廣東 525000）

化橘紅是我國著名的南藥，由蕓香科植物化州柚（Citrus grandis cv.‘Tomentosa’）加工而成，化橘紅中主要的活性成分是揮發(fā)油、黃酮類物質(zhì)及多糖[1-2]。柚皮苷和野漆樹苷是化橘紅中含量最高的黃酮類物質(zhì)[3]，具有祛痰、鎮(zhèn)咳、抑制哮喘、降血壓、降心率和抗氧化等效用[4-5]。近年來，隨著人類生活水平提高，不良飲食、作息習(xí)慣等造成的高尿酸血癥患病率逐年上升，已經(jīng)成為人類第二大代謝性疾病[5-6]。黃嘌呤氧化酶是體內(nèi)催化黃嘌呤或次黃嘌呤轉(zhuǎn)化為尿酸的關(guān)鍵酶，通過抑制黃嘌呤氧化酶的活性，可降低尿酸的形成[7]。在對黃酮類化合物活性的分析中發(fā)現(xiàn)，具有黃酮骨架的化合物可抑制黃嘌呤氧化酶活性[8]。李夢榮等[5]研究表明車前草內(nèi)黃酮化合物異澤蘭黃素通過氫鍵、范德華力、π-σ鍵和疏水作用力等與黃嘌呤氧化酶結(jié)合進(jìn)而抑制酶活性。基于此，本文采用乙醇提取化橘紅果實(shí)及花中黃酮類化合物并進(jìn)行體外黃嘌呤氧化酶抑制效果研究，同時分析不同化橘紅果、花代用茶浸泡方式浸出液對黃嘌呤氧化酶的抑制效果，以期為化橘紅在治療高尿酸血癥和痛風(fēng)中的應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1.材料與方法

(1)實(shí)驗(yàn)材料

化橘紅果實(shí)（果齡60d）及花（花瓣剛展開）采自橘品天下科技發(fā)展（化州）有限公司基地，采摘后運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，烘干后粉碎過40目篩得到小粉末用于提取。化橘紅果實(shí)及花代用茶制備參照傳統(tǒng)方法，將果實(shí)烘干后切成厚度3mm的薄片為果實(shí)代用茶，花烘干后為花代用茶。黃嘌呤氧化酶、黃嘌呤等購于上海源葉生物科技有限公司。柚皮苷、野漆樹苷、柚皮素、芹菜素等標(biāo)準(zhǔn)品購于ChemFaces公司。其他分析純試劑等購于天津市大茂化學(xué)試劑廠。

(2)儀器

萬分之一電子天平（AR224CN，奧豪斯儀器有限公司）、數(shù)控超聲波清洗器（PS-60A，江蘇省昆侖山市超聲儀器有限公司）、光吸收全波長酶標(biāo)儀（ReadMax 1200，上海閃譜生物科技有限公司）、高效液相色譜（LC-20A，株式會社島津制作所）。

(3)化橘紅黃酮類化合物提取

化橘紅果實(shí)、花黃酮類化合物提取參照韓寒冰等[3]方法進(jìn)行優(yōu)化，以60%乙醇作為提取溶劑，在30℃下采用300W超聲輔助提取2h，提取完成后7500r/min離心10min，上清液即為化橘紅黃酮類化合物提取液。上清液以韓寒冰等[3]建立的方法采用高效液相色譜檢測四種主要成分柚皮苷、野漆樹苷、柚皮素、芹菜素的含量，并以總和代表總黃酮含量。隨后將提取液稀釋為50μg/mL、100μg/mL和150μg/mL用于分析黃嘌呤氧化酶抑制活性。

(4)化橘紅果實(shí)和花代用茶浸液制備

結(jié)合化橘紅代用茶使用習(xí)慣，取0.5g化橘紅果實(shí)或者花，按照不同料液比加入溫度90℃的水，浸泡10min后過濾，收集過濾液，其中果實(shí)料液比為1:100、1:200、1:300、1:400、1:500，花料液比為1:50、1:100、1:150、1:200、1:250。取0.5g化橘紅果實(shí)或者花，果實(shí)按照1:300料液比，花按照1:150料液比加入60℃、70℃、80℃、90℃、100℃的水，浸泡10min后過濾，收集過濾液。取0.5g化橘紅果實(shí)或者花，果實(shí)按照1:300料液比，花按照1:150料液比加入90℃的水，浸泡5min、10min、15min、20min、25min，過濾收集過濾液，濾液用于分析不同時間浸提液對黃嘌呤氧化酶抑制活性。根據(jù)單因素結(jié)果，采用正交實(shí)驗(yàn)法進(jìn)行不同料液比、不同水溫度、不同浸泡時間化橘紅果實(shí)和花代用茶浸提（表1）。正交實(shí)驗(yàn)表如表1，分別取0.5g化橘紅果實(shí)和花，按照正交試驗(yàn)表進(jìn)行浸泡和過濾，濾液用于檢測黃嘌呤氧化酶抑制活性。

表1 正交實(shí)驗(yàn)法浸提化橘紅果實(shí)因素水平表

(5)黃嘌呤氧化酶抑制效果分析

黃嘌呤氧化酶抑制效果檢測方法參照王亞楠等[10]方法。使用酶標(biāo)儀在295nm波長下檢測吸光度。根據(jù)一定時間內(nèi)測定的吸光度計(jì)算酶活力。加入化橘紅提取物的酶活力表示為U1；加入0.01mL磷酸緩沖液作為陽性對照組的酶活力表示為U2，酶相對抑制率=（1-U1/U2）×100%。

(6)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)均3個生物學(xué)重復(fù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SigmaPlot 11進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及制圖。

2.結(jié)果與分析

(1)化橘紅果實(shí)和花提取液中黃酮類物質(zhì)含量

化橘紅果實(shí)中總黃酮4095.07μg/mL，其中柚皮苷4016.67μg/mL，野漆樹苷48.39μg/mL，柚皮素25.33μg/mL，芹菜素4.68μg/mL（表2）。花中的總黃酮為673.76μg/mL，其中柚皮苷626.18μg/mL，野漆樹苷36.53μg/mL，柚皮素3.88μg/mL，芹菜素7.17μg/mL（表2）。

表2 化橘紅果實(shí)和花提取液中黃酮類物質(zhì)含量

(2)化橘紅果實(shí)和花黃酮類化合物提取液對黃嘌呤氧化酶抑制效果

酶活性抑制結(jié)果顯示化橘紅果實(shí)和花的黃酮類化合物提取液對黃嘌呤氧化酶活性的抑制效果隨濃度上升而加強(qiáng)。其中150μg/mL的果實(shí)提取液抑制效果為53.13%，而150μg/mL的花提取液抑制效果為49.47%（圖1）。

圖1 化橘紅黃酮類化合物提取液對黃嘌呤氧化酶抑制效果

(3)不同因素對化橘紅果實(shí)和花代用茶浸液黃嘌呤氧化酶抑制效果的影響

化橘紅果實(shí)和花浸提液黃嘌呤氧化酶抑制率隨著料液比的升高而呈現(xiàn)下降趨勢（圖2A，B）。隨著浸提水溫上升，浸提液酶抑制率呈現(xiàn)上升趨勢，水溫100℃時，果實(shí)和花酶抑制率分別為54.3%和47.7%（圖2C）。隨著浸泡時間延長，浸提液酶抑制率呈現(xiàn)上升趨勢，浸泡時間在15min之后，抑制率上升緩慢（圖2D）。結(jié)合代用茶引用習(xí)慣，化橘紅果實(shí)正交試驗(yàn)因素水平選擇料液比1:200、1:300、1:400，料液比1:100、1:150、1:200，溫度80℃、90℃、100℃，浸泡時間5min、10min、15min。

圖2 單因素對化橘紅果實(shí)及花浸提液黃嘌呤氧化酶活性影響

正交實(shí)驗(yàn)法影響果實(shí)和花浸出液酶抑制效果的因素依次為料液比＞浸泡時間＞溫度，其中果實(shí)浸出液最佳條件是料液比1:200、水溫100℃、浸泡時間15min，花浸出液最佳條件是料液比1:100、水溫100℃、浸泡時間15min（表3）。在優(yōu)化方案下化橘紅果實(shí)浸提液酶抑制率為55.1%，花浸提液酶抑制率為51.1%，該結(jié)果與正交實(shí)驗(yàn)相符合（表3）。

表3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

3.討論

本研究結(jié)果顯示化橘紅果實(shí)及花乙醇提取物中均含有柚皮苷、野漆樹苷、柚皮素和芹菜素4種黃酮類物質(zhì)，這與其他研究結(jié)果一致[2-3]。化橘紅果實(shí)和花的黃酮類化合物提取液均能抑制黃嘌呤氧化酶活性，150μg/mL的果實(shí)提取液抑制效果為53.13%，150μg/mL的花提取液抑制效果為49.47%，有研究結(jié)果表明柚皮苷可能通過三個傳統(tǒng)氫鍵與黃嘌呤氧化酶結(jié)合進(jìn)而起到抑制作用[11]。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示果實(shí)料液比1:200，花料液比1:100，在水溫100℃浸泡15min，該條件下獲得的化橘紅果實(shí)及花浸出液達(dá)到最高的黃嘌呤氧化酶抑制效果，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明抑制效果分別為55.1%和51.1%。隨著我國中醫(yī)藥科技的發(fā)展與復(fù)興，臨床用中藥來控制痛風(fēng)取得積極的成果，本研究結(jié)果顯示化橘紅果實(shí)和花提取液及代用茶浸提液均對黃嘌呤氧化酶有抑制效果，可進(jìn)一步進(jìn)行應(yīng)用開發(fā)研究，為化橘紅用于預(yù)防和治療高尿酸血癥提供參考依據(jù)。