二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物在化妝品中功效性能的研究

＊何俊杰 張目 黃曉東

（1.華南理工大學(xué) 廣東 510641 2.廣州悅薈化妝品有限公司 廣東 510080）

皮膚共生微生物的代謝活動(dòng)是通過(guò)攝取皮膚細(xì)胞分泌物進(jìn)行物質(zhì)與能量交換，其對(duì)維護(hù)健康皮膚有重要作用。皮膚共生菌群可以將表皮油脂分解成游離脂肪酸，調(diào)節(jié)皮膚表面酸堿度抑制致病菌的生長(zhǎng)，釋放抗菌物質(zhì)抑制病原菌的增殖，調(diào)節(jié)宿主皮膚固有免疫防御系統(tǒng)，抵御致病生物體侵害。雙歧桿菌作為腸道共生菌群中的優(yōu)勢(shì)益生菌，對(duì)機(jī)體皮膚健康的促進(jìn)作用具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用在皮膚健康與護(hù)膚品領(lǐng)域[1-2]。雙歧桿菌發(fā)酵底物經(jīng)過(guò)滅活、超聲等方式獲得菌裂解物，即雙歧桿菌發(fā)酵產(chǎn)物溶胞物，常稱二裂酵母發(fā)酵產(chǎn)物溶胞產(chǎn)物，可用于護(hù)膚領(lǐng)域的產(chǎn)品[3]。二裂酵母在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生多種氨基酸、肽類、蛋白質(zhì)、多糖、核苷酸、維生素以及各類分子介質(zhì)，可以滋養(yǎng)、修復(fù)肌膚，補(bǔ)充皮膚所需養(yǎng)分，降低紫外線對(duì)皮膚細(xì)胞DNA的損傷，同時(shí)具有的抗炎、修護(hù)、緊致、抗皺、抗衰老等作用，目前二裂酵母發(fā)酵產(chǎn)物濾液和二裂酵母發(fā)酵產(chǎn)物溶胞產(chǎn)物已經(jīng)錄入《已使用化妝品原料名稱目錄》（2021版）作為化妝品原料使用[4-5]。本文從皮膚共生體系的微生物中選取出優(yōu)異雙歧桿菌進(jìn)行工程發(fā)酵，獲得二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物，通過(guò)細(xì)胞活性、基因表達(dá)促進(jìn)測(cè)試、自由基清除測(cè)試等體外測(cè)試方法對(duì)二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物的抗皺、緊致、抗氧化的效果進(jìn)行研究。

1.實(shí)驗(yàn)部分

(1)主要材料、試劑與儀器

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），分析純，均買于Sigma公司；胎牛血清，F(xiàn)SP500；RNAlater溶液，R0118；DMEM培養(yǎng)基，生物級(jí)，均買于賽默飛公司。TRIzol試劑，100T，阿拉丁公司；PrimerScript RT試劑盒，RR047A，Takara公司；實(shí)時(shí)PCR試劑盒，RR420A，Takara公司。人成纖維細(xì)胞，武漢普諾賽生命科技有限公司提供。

多功能酶標(biāo)儀，HBS-1096A，德鐵；分析天平，BSA224S，德國(guó)賽多利斯；顯微鏡，SG-300，薩伽；紫外分光光度計(jì)，U2910，日立；PCR擴(kuò)增儀，BIO-RAD，伯樂(lè)；超聲清洗機(jī)，VGT-2127QT，威固特。

(2)實(shí)驗(yàn)方法

①I型膠原蛋白（CollagenI）含量測(cè)試

制備細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μL，培養(yǎng)24h。棄去孔中原培養(yǎng)液，每孔加入100μL不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)試樣品、陰性對(duì)照，培養(yǎng)箱孵育24h，每孔加入100μL 0.5mg/mL MTT溶液，培養(yǎng)箱孵育4h。去除孔中液體，每孔加入150μL DMSO，置于振蕩器振蕩15min后，在酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值。

各組數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以對(duì)照組細(xì)胞活性為100%，計(jì)算各組相對(duì)細(xì)胞活性（Viability）

式中：

AS：測(cè)試樣品的在450nm處吸光度；

AC：陰性對(duì)照在450nm處吸光度；

A0：空白組在450nm處吸光度。

②斑馬魚I型膠原蛋白基因（col1a1a，col1a1b,col1a2）與彈性蛋白基因（Elna）表達(dá)促進(jìn)測(cè)試

參照T/HPCAI OOX—2022《化妝品抗皺、緊致功效—斑馬魚膠原蛋白、彈性蛋白基因表達(dá)測(cè)試方法》測(cè)試。

③化妝品自由基（DPPH）清除測(cè)試

二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物稀釋液：取發(fā)酵產(chǎn)物原液去離子水依次稀釋為1%、3%、5%、10%水溶液作為樣品。

維生素C（VC）溶液（作陽(yáng)性對(duì)照組）：使用去離子水配置為0.001g/L、0.002g/L、0.004g/L、0.006g/L、0.008g/L、0.01g/L、0.02g/L和0.5g/L的VC溶液，備用。

將樣品溶液、溶劑或DPPH溶液按等體積混合，避光常溫30min，吸取200μL移入96孔板中，在517nm檢測(cè)各組吸光度，記錄數(shù)據(jù)。將溶液混勻后，避光常溫30min，吸取200μL移入96孔板中，在517nm檢測(cè)各組吸光度，記錄數(shù)據(jù)。

清除率計(jì)算公式為：

式中：

T—樣品管吸光值，即樣品與DPPH反應(yīng)后溶液吸光值；

T0—樣品本底吸光值；

C—DPPH管吸光值，即未加樣品時(shí)DPPH溶液吸光值；

C0—溶劑本底吸光值。

2.結(jié)果與討論

(1)CollagenI含量測(cè)試

二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物的測(cè)試質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、3%、5%進(jìn)行促進(jìn)CollagenI含量檢測(cè)，圖1結(jié)果顯示，1%的添加量即具有促進(jìn)CollagenI含量的效果，且效果隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而提升。二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物能夠顯著促進(jìn)CollagenI含量的效果，且呈劑量依賴性，因此，具有抗皺和緊致的功效。

圖1 二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)促進(jìn)CollagenI含量測(cè)試結(jié)果

(2)斑馬魚I型膠原蛋白基因表達(dá)促進(jìn)測(cè)試

前述從細(xì)胞水平說(shuō)明二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物具有抗皺和緊致的功效，現(xiàn)從分子水平同樣對(duì)溶胞物進(jìn)行測(cè)試。斑馬魚的I型膠原蛋白分布與人體相類似，通過(guò)測(cè)試斑馬魚I型膠原蛋白基因（col1a1a，col1a1b和col1a2）表達(dá)，來(lái)評(píng)價(jià)原料或產(chǎn)品的抗皺和緊致效果[6]。

從圖2結(jié)果表明1%的添加量即對(duì)斑馬魚collalb和col1a2兩種基因表達(dá)具有顯著促進(jìn)作用，促進(jìn)率隨配方質(zhì)量分?jǐn)?shù)提升而同步提高，當(dāng)配方質(zhì)量分?jǐn)?shù)提升至5%后，對(duì)斑馬魚col1a1b和col1a2基因表達(dá)的促進(jìn)效果提升趨于平緩，但對(duì)斑馬魚col1a1a的促進(jìn)作用效果較差。可見(jiàn)二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物樣品能顯著促進(jìn)斑馬魚col1a1b和col1a2基因表達(dá)，可以促進(jìn)I型膠原蛋白再生效果，具有抗皺和緊致的功效。

圖2 二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物對(duì)斑馬魚I型膠原蛋白基因相對(duì)表達(dá)量

圖3 二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物對(duì)斑馬魚彈性蛋白基因相對(duì)表達(dá)量

(3)斑馬魚彈性蛋白基因表達(dá)促進(jìn)測(cè)試

彈性蛋白是人體中一種在拉伸和收縮后可以維持組織細(xì)胞原有形態(tài)，使皮膚在變形后恢復(fù)到初始形態(tài)的蛋白。該基因在斑馬魚體內(nèi)的對(duì)應(yīng)基因是Elna，通過(guò)測(cè)試樣品能否促進(jìn)斑馬魚體內(nèi)Elna基因的表達(dá)，評(píng)判樣品是否有促進(jìn)彈性蛋白再生，使皮膚緊致的功效[7]。

二裂酵母共生發(fā)酵溶胞樣品在1%配方添加量可顯著促進(jìn)斑馬魚Elna基因表達(dá)，但隨著配方添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提升促進(jìn)效果逐漸下降。造成這種原因可能是斑馬魚完全暴露于樣本溶液中，耐受性相比人體局部皮膚低，魚胚胎會(huì)因壓力問(wèn)題，導(dǎo)致測(cè)試結(jié)果并未隨配方質(zhì)量分?jǐn)?shù)增高而效果增強(qiáng)。從計(jì)量分析，1%、5%和10%配方添加量下都能顯著促進(jìn)斑馬魚Elna基因表達(dá)，促進(jìn)彈性蛋白再生效果，二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物具有較好的抗皺和緊致功效。

(4)化妝品自由基（DPPH）清除測(cè)試

DPPH乙醇溶液褪色程度與其接受的電子數(shù)呈線性關(guān)系，由此用于評(píng)判試驗(yàn)樣品清除自由基的能力。圖4結(jié)果顯示，二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物在添加量1%即具有較強(qiáng)DPPH清除率，在添加量為3%后，DPPH清除率基本維持在較高的范圍，因此在二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物1%～10%的檢測(cè)量范圍中表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化性，具有較強(qiáng)的抗氧化效果。

圖4 二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物的DPPH清除率柱形圖

3.結(jié)論

二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物通過(guò)細(xì)胞水平的CollagenI含量測(cè)試表明，具有抗皺和緊致的功效，其次通過(guò)斑馬魚I型膠原蛋白基因表達(dá)促進(jìn)實(shí)驗(yàn)，從分子水平分析抗皺和緊致功效，實(shí)驗(yàn)表明二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物對(duì)col1a1b和col1a2基因表達(dá)具有明顯促進(jìn)作用，但對(duì)col1a1a基因的促進(jìn)效果不明顯，同時(shí)可以促進(jìn)斑馬魚Elna基因表達(dá)，具有可以幫助皮膚抗皺和緊致的功效，另外通過(guò)DPPH清除率實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物具有較好的抗氧化效果。從皮膚共生體系的微生物中選取出優(yōu)異雙歧桿菌進(jìn)行工程發(fā)酵，獲得二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物，通過(guò)細(xì)胞活性、基因表達(dá)促進(jìn)測(cè)試、自由基清除的體外測(cè)試證明二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物具備抗皺、緊致、抗氧化的效果，具有應(yīng)用在化妝品護(hù)膚領(lǐng)域的市場(chǎng)價(jià)值。