環(huán)糊精類聚陽離子納米載體材料的合成及其自組裝性能研究
——介紹一個生物醫(yī)學(xué)材料課程的綜合設(shè)計實驗

＊楊 斌

（廣州醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院 廣東 511436）

納米載體技術(shù)的發(fā)展革新了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的診斷和治療，為多種疾病的治療提供了高新技術(shù)手段。利用不同納米材料并合理選擇制備方法可以獲得具有各種尺寸、形狀和表面性質(zhì)的載體，通過考察相關(guān)性質(zhì)對納米制劑生物學(xué)效應(yīng)的影響，可以得到針對不同種類細胞進行遞送的納米載體系統(tǒng)。進一步篩選合適的分子作用靶點，能夠利用特定的納米制劑調(diào)控相應(yīng)的功能，最終實現(xiàn)對疾病的靶向治療[1-3]。作為功能性納米載體的一種，刺激響應(yīng)型（stimuli-responsive）聚合物在藥物控制釋放、基因載體及納米反應(yīng)器等諸多領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景[4-5]。聚陽離子納米材料能夠通過靜電作用負載DNA等負電性治療劑，同時可以實現(xiàn)對藥物的包封和可控釋放，是一類理想的納米載體系統(tǒng)。本實驗源于生物醫(yī)用高分子領(lǐng)域的前沿研究成果，應(yīng)用于我校生物醫(yī)學(xué)工程專業(yè)的生物醫(yī)學(xué)材料綜合實驗課程教學(xué)，面向大三年級本科生開設(shè)。通過本教學(xué)實驗的開展，期望學(xué)生能夠在指定的實驗方向下自主設(shè)計實驗內(nèi)容和詳細步驟，在不同實驗分組完成后比較實驗結(jié)果并進行分析，最終得出結(jié)論。在該課程中綜合了本專業(yè)相關(guān)基礎(chǔ)實驗的內(nèi)容與操作，同時將設(shè)計性融入到實驗過程中，有利于培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新精神。由于該實驗相對比較復(fù)雜，需要學(xué)生前期掌握有機化學(xué)、高分子化學(xué)、生物材料的合成與制備技術(shù)、生物材料的表征技術(shù)等相關(guān)理論和實驗課程，而這些課程已經(jīng)在本專業(yè)前期教學(xué)中均有所涉及，從而為本實驗的順利開展奠定了良好的基礎(chǔ)。

1.實驗?zāi)康?/h2>

（1）掌握聚陽離子納米載體材料構(gòu)建的基本原理和方法。

（2）掌握納米載體材料的常用表征手段。

（3）熟悉自組裝的原理和方法。

（4）了解主客體化合物的基本性質(zhì)。

2.實驗原理

環(huán)糊精是由葡萄糖單元經(jīng)（1→4）糖苷鍵相連形成的環(huán)狀低聚物，根據(jù)單糖個數(shù)的不同（6、7、8個）分別命名為α-、β-、γ-環(huán)糊精。環(huán)糊精本身具有兩親性結(jié)構(gòu)，內(nèi)腔疏水，外側(cè)親水，這使得其能在水中溶解，毒性很低且無免疫原性。作為主體分子，環(huán)糊精能夠與多種小分子客體通過超分子作用力進行組裝，從而引入不同的功能。最為典型的是，β-環(huán)糊精（Cyclodextrin，CD）與金剛烷（Adamantane，AD）能夠通過主客體作用形成類似“鎖鑰”關(guān)系的分子間專一性結(jié)合。因此，借助環(huán)糊精和金剛烷的主客體自組裝構(gòu)建聚陽離子材料不會涉及復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，易于實現(xiàn)材料的功能化修飾，通過后期組裝制備具有納米尺度的載體，具有廣泛的應(yīng)用前景[6-7]。

本實驗通過模板-模塊的形式將功能性客體分子組裝到低分子量的陽離子載體體系中[8-9]，即以氨基修飾的環(huán)糊精作為模板分子（主體部分）有效負載DNA，同時功能化的金剛烷衍生物作為模塊（客體部分）可以介導(dǎo)特定的功能，二者自組裝得到聚陽離子納米載體材料（如圖1所示）。進一步借助實驗室現(xiàn)有的儀器設(shè)備和條件，通過核磁共振氫譜、掃描電子顯微鏡、凝膠電泳儀等探究載體材料的結(jié)構(gòu)正確性和功能有效性，以期用于基因和藥物的有效負載，最終實現(xiàn)治療的目的。

圖1 聚陽離子納米載體材料的合成路線示意圖（A）主體化合物CD-TAEA的合成；（B）客體分子PB-AD的合成及其主客體組裝納米載體的結(jié)構(gòu)

3.儀器和試劑

儀器：磁力攪拌器，渦旋震蕩器，水浴鍋，pH計，冷凍干燥機，核磁共振波譜儀，掃描電子顯微鏡，凝膠電泳儀。

試劑：N,N-二甲基甲酰胺（DMF），二甲亞砜（DMSO），三乙胺（TEA），3-氨基苯硼酸（PB-NH2），N,N'-羰基二咪唑（CDI），β-環(huán)糊精（CD），1-金剛烷酰氯（ADC），三(2-氨基乙基)胺（TAEA），D2O，氫氧化鈉，鹽酸，瓊脂糖，編碼熒光素酶的質(zhì)粒pGL-3，GelRedTM染料。

4.實驗內(nèi)容

（1）β-環(huán)糊精-三(2-氨基乙基)胺（CD-TAEA）的合成。將CD（1.0g，0.9mmol）溶解在10mL DMF中，然后將事先溶解在10mL DMF中的CDI（2.0g，12.3mmol）溶液逐滴加入到上述溶液中，室溫下攪拌2h進行活化，然后倒入無水乙醚中沉淀，離心后收集沉淀物并重新溶解在15mL DMSO中。將1mL三乙胺加入該DMSO混合液后滴加至事先溶解在5mL DMSO的TAEA溶液中，室溫下攪拌反應(yīng)24h。反應(yīng)混合液經(jīng)透析（MWCO：3500）后冷凍干燥得產(chǎn)品CD-TAEA。

（2）金剛烷修飾的苯硼酸（PB-AD）的合成。將PB-NH2（0.6g，4.4mmol）與ADC（0.6g，3.0mmol）溶解在20mL DMF中，加入三乙胺1.2mL，0℃下攪拌反應(yīng)24h。將DMF溶劑減壓蒸出，過量的ADC及反應(yīng)生成的三乙胺鹽酸鹽用蒸餾水多次洗滌除去，然后在50℃下真空干燥得到淺黃色產(chǎn)品PB-AD。

（3）核磁氫譜（1H NMR）表征。分別取CD-TAEA和PB-AD固體，在氘代試劑中溶解后制備樣品，使用核磁共振波譜儀檢測。納米組裝體的結(jié)構(gòu)通過1H-1H COSY二維譜來表征其相互作用。

（4）納米組裝體的構(gòu)建。將PB-AD與CD-TAEA一起溶解在10mL DMF中，在50℃下劇烈攪拌1h。然后將5mL蒸餾水通過注射器在2h內(nèi)緩慢加入到上述溶液中，50℃下繼續(xù)攪拌過夜，將組裝體溶液對水透析（MWCO：3500），過濾后凍干得到超分子自組裝體PBAD/CD-TAEA。

（5）凝膠電泳。將不同N/P比的載體材料與0.1μg DNA的復(fù)合物加入含有2μL GelRedTM染料的0.7%(w/v)的瓊脂糖凝膠中，電泳實驗在80V電壓下TAE緩沖溶液中進行，1h后在凝膠成像儀下通過紫外照射成像來觀察。

（6）緩沖能力的測定。載體材料的緩沖能力通過酸堿滴定的方法測定。分別稱取6mg的載體材料溶解于30mL的超純水中，將該溶液先用0.1M的NaOH調(diào)節(jié)pH到10，然后用0.1M的HCl溶液進行滴定使其pH達到2.5，以pH值的變化對所加HCl溶液的體積作圖。在這里將緩沖能力定義為pH在7.4到5.1的范圍內(nèi)能夠被質(zhì)子化的氨基所占的百分含量，計算公式如下：PA=(ΔVHCl×0.1M)/Nmol×100%。其中ΔVHCl是將溶液的pH范圍從7.4滴定到5.1所需要的HCl溶液的體積；Nmol為6mg載體材料中能夠被質(zhì)子化的氨基總的摩爾數(shù)。

（7）掃描電鏡觀測形貌。載體材料與DNA的復(fù)合物形貌通過掃描電鏡來觀察。將三種材料在最佳N/P比時的復(fù)合物樣品進行減壓噴金處理，在放大500倍的情況下對組裝體復(fù)合物的形貌進行觀察。

5.結(jié)果與討論

（1）聚陽離子納米載體的合成與結(jié)構(gòu)表征。本實驗以氨基功能化的環(huán)糊精與金剛烷修飾的苯硼酸通過主客體作用構(gòu)建了一種超分子組裝體。首先，帶有多個氨基的TAEA小分子與經(jīng)CDI活化的環(huán)糊精反應(yīng)制備主體分子，然后通過3-氨基苯硼酸與1-金剛烷酰氯的酰胺化反應(yīng)合成苯硼酸連接的金剛烷作為客體分子。通過1H NMR來表征相關(guān)分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，CD與TAEA所有基團的特征峰都有相應(yīng)的歸屬，通過積分面積計算可以得出每個CD分子上連接TAEA分子的數(shù)目。PB-AD的合成在ADC過量的前提下通過酰胺化反應(yīng)完成，其中PB與AD基團的特征峰都有相應(yīng)的歸屬。通過主客體組裝成功構(gòu)建了超分子體系，以1H-1H COSY二維譜（圖2）來證實組裝體的形成，可以看到CD與AD基團的相關(guān)質(zhì)子具有偶合關(guān)系，相關(guān)峰的信號呈對稱狀出現(xiàn)在二維譜圖中，從而證實了自組裝過程的發(fā)生。

圖2 PB-AD/CD-TAEA組裝體在D2O溶液中的1H-1H COSY圖譜

（2）聚陽離子納米載體的性能測試。通過瓊脂糖凝膠電泳實驗評估CD-TAEA及PB-AD/CD-TAEA結(jié)合質(zhì)粒DNA的能力，在不同的N/P比下考察氨基密度變化和聚陽離子納米載體復(fù)合能力的關(guān)系。通過酸堿滴定的方法測定CD-TAEA及PB-AD/CD-TAEA的緩沖能力，以生理鹽水為陰性對照，金標(biāo)準(zhǔn)PEI25K為陽性對照。一般而言，聚陽離子的電荷密度越高，其復(fù)合DNA的能力越強，緩沖能力也越高，通過不同分組間聚陽離子電荷密度的差異來驗證上述結(jié)論。最后通過掃描電鏡（SEM）觀察載體與DNA在最佳N/P比下所形成復(fù)合物的形貌，可以發(fā)現(xiàn)復(fù)合物分布均勻且呈規(guī)則的球形，粒子大小均在100nm以下。

6.實驗教學(xué)組織形式

本實驗專為我校生物醫(yī)學(xué)工程專業(yè)生物醫(yī)學(xué)材料綜合實驗課程開設(shè)，面向大三年級本科生，目前已經(jīng)完成2屆學(xué)生的教學(xué)。在學(xué)生課前進行文獻調(diào)研的基礎(chǔ)上，以小分子化合物三(2-氨基乙基)胺與環(huán)糊精的的投料比不同進行分組，每組4～5人，在完成所有實驗后進行組間對比，通過討論分析實驗結(jié)果，最終形成完整的實驗報告。整個綜合實驗課程分3個階段完成：（1）理論講述相關(guān)實驗背景和主要實驗原理和內(nèi)容（1學(xué)時），分別完成主客體化合物的合成（7學(xué)時）；（2）表征合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，研究主客體自組裝行為（4學(xué)時）；（3）通過相關(guān)表征手段研究聚陽離子納米載體的理化性質(zhì)并分析實驗結(jié)果（8學(xué)時）。

7.結(jié)語

本實驗結(jié)合納米技術(shù)與生物材料研究中的熱點，通過主客體化學(xué)構(gòu)建不同電荷密度的聚陽離子納米載體，并通過多種手段表征其理化性質(zhì)，綜合了本專業(yè)相關(guān)基礎(chǔ)實驗的內(nèi)容與操作，同時將設(shè)計性融入到實驗過程中，有利于培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新精神。在教學(xué)過程中，將思政教育與生物醫(yī)學(xué)材料的教學(xué)元素有機融合，重點發(fā)掘知識體系中自帶的科學(xué)理性價值觀，可以有效激發(fā)學(xué)生的興趣，引導(dǎo)學(xué)生樹立正確的人生觀和價值觀。