高溫脅迫下刺參H3K9ac特征及HATs、HDACs的表達*

張京京, 徐冬雪, 宋文琦, 夏 斌, 高勤峰**

(1. 海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室(中國海洋大學), 山東 青島 266003; 2. 青島農業(yè)大學海洋科學與工程學院, 山東 青島 266109)

刺參(Apostichopusjaponicus)屬于棘皮動物門(Echinodermata)海參綱(Holothuroidea)[1],主要生存于淺海或巖礁底質的沿海、內灣等海域。溫度是影響刺參生長與代謝的重要環(huán)境因素之一,刺參適宜的生長溫度為10～17 ℃。水溫高于20 ℃時大部分刺參會逐漸進入夏眠狀態(tài),而水溫急劇升高時則會出現吐臟、化皮等應激反應,嚴重時導致死亡[2-4]。刺參是我國海洋農業(yè)產業(yè)中單種產值高的養(yǎng)殖對象之一,但是近年來頻發(fā)的夏季高溫對刺參養(yǎng)殖產業(yè)造成了重大沖擊,山東、遼寧等主產地多次出現夏季刺參大面積死亡現象,部分地區(qū)死亡率高達60%以上。解析刺參高溫脅迫響應的調控機制將為耐高溫品種的選育與遺傳改良奠定基礎。

組蛋白是真核生物染色體的基本結構蛋白,共有H1、H2A、H2B、H3和H4五種類型,其中H2A、H2B、H3和H4為核心組蛋白,聚合組成了組蛋白八聚體,它與DNA相互纏繞組成核小體。組蛋白末端氨基酸可以發(fā)生多種修飾,如乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化等,這些修飾模式可作為一種標志或語言,即“組蛋白密碼”[5]。組蛋白修飾是可逆的動態(tài)變化過程,可影響染色質的結構及DNA的結合能力,從而調控相關基因的轉錄和表達。看家基因的組蛋白處于相對穩(wěn)定的狀態(tài),而誘導基因的染色質狀態(tài)會發(fā)生修飾變化,這也為組蛋白修飾參與誘導基因的表達調控提供了重要依據[6]。

組蛋白乙酰化修飾是最重要的基因轉錄表觀調控因子之一,主要發(fā)生在H3和H4亞基:H3上修飾位點有第4、9、14、18、23和27位賴氨酸殘基, H4上修飾位點有第5、8、12和16位賴氨酸殘基[5]。研究證明組蛋白通過特定位點的乙酰化修飾參與高溫脅迫下基因的轉錄表達的調控,為深入解析調控基因表達的機制研究帶來突破。組蛋白乙酰化修飾對HSP22、HSP26和HSP70等基因的調控作用相繼被證實[7-10]。目前大多數研究認為:組蛋白乙酰化可以使其染色質結構變得松散, 有利于轉錄調控因子、RNA聚合酶等與基因關鍵作用元件的結合,從而促進基因的轉錄激活或延伸過程[11-13]。環(huán)境脅迫下H3K9的乙酰化水平發(fā)生顯著變化,是調控基因表達的重要方式之一,其變化由多種組蛋白乙酰轉移酶(Histone acetyltransferase, HATs)和去乙酰化酶(Histone deacetylases, HDACs)競爭性作用共同決定,例如:在植核后馬氏珠母貝的血細胞組蛋白H3和H4的乙酰化修飾都顯著上升[14];玉米幼苗根系在鹽度脅迫24 h后H3K9ac顯著上升,哺乳動物細胞在低氧脅迫下H3K9ac明顯降低[15-16]。在高溫脅迫下,H3K9ac也有明顯的動態(tài)變化,例如短暫的高溫脅迫導致的玉米幼苗葉片組織和雞的腦組織的H3K9ac明顯升高[17-18]。本研究分別選取了4種HATs的代表性酶基因和4種HDACs的代表性酶基因作為研究對象。KAT2B(又被稱為KAT2A/GCN5)是最受關注的組蛋白乙酰化轉移酶之一,其被發(fā)現不僅影響組蛋白的乙酰化狀態(tài),還可在基因區(qū)域被招募富集,調控高溫脅迫下基因的轉錄表達過程[19-20]。KAT5是MYST乙酰轉移酶家族中保守且廣泛表達的成員,研究發(fā)現其在胚胎干細胞(ES)細胞自我更新、DNA損傷修復、轉錄共活化和組蛋白乙酰化中起著關鍵作用[21-22]。本研究還挑選了MYST家族的另外兩個乙酰轉移酶:KAT7和KAT8[23]。KAT7(又被稱為MYST2/HBO1)在各種復合物中與其他表觀遺傳調控因子協同工作,調節(jié)細胞的自我更新[23]。KAT8(也稱為MOF/MYST1)具有組蛋白和非組蛋白底物,在多種細胞功能中發(fā)揮作用[24-25]。HDACs分為四類:HDAC1、2、3和8作為Ⅰ類,HDAC4、5、6、7、9和10作為Ⅱ類,Sirtuin1至7為Ⅲ類,HDAC11為Ⅳ類[26]。SIRT1(Sirtuin1)是一種依賴于煙酰胺腺苷二核苷酸(NAD+)的去乙酰化酶,與酵母細胞中與物質代謝和長壽有關的沉默信息調節(jié)因子SIR2同源,與眾多基因的轉錄調控、能量代謝及細胞衰老過程的調節(jié)有關[27]。研究發(fā)現SIRT1對多種脅迫因子,包括溫度、滲透壓等都有明顯的響應[28-29]。而HDAC1是多種蛋白復合物的催化亞基,參與多種細胞活動[30]。HDAC3參與許多病理過程,具有獨特的結構和亞細胞分布特征以及共抑制依賴性[31]。HDAC4作為Ⅱa類HDAC的成員穿梭于細胞核和細胞質之間,是介導多種細胞反應的應激響應因子[32]。

本研究通過Western Blot技術發(fā)現刺參H3K9ac水平在高溫脅迫下發(fā)生了動態(tài)變化,并對刺參基因組中ajKAT2B、ajKAT5、ajKAT7、ajKAT8和ajSIRT1、ajHDAC1、ajHDAC3、ajHDAC4基因進行基因結構解析和系統(tǒng)進化樹分析;利用qRT-PCR定量研究刺參在高溫脅迫0、6、48和96 h后這8個基因的表達變化模式,為深入開展刺參H3K9ac對高溫脅迫下基因的轉錄調控機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品處理

實驗所用刺參于2021年6月采集自山東煙臺養(yǎng)殖場,快速轉運至實驗室暫養(yǎng)。每個養(yǎng)殖缸隨機放置6頭健康且體質量為(100±10) g的刺參,在溫度18 ℃、鹽度30的條件下暫養(yǎng)7 d。在此期間,每天過量喂食一次配合飼料,并及時清除殘餌和糞便。暫養(yǎng)結束后,參考徐冬雪[33]的實驗方法,每組設置8個生物學重復,取第一個養(yǎng)殖缸(水溫18 ℃)中的刺參腸道作為對照組,另外3個養(yǎng)殖缸通過快速加熱的方式,將水溫從18 ℃升至27 ℃,升溫速度約為2 ℃/h,而后保持(26±0.5) ℃水溫[33-34]。溫度升至26 ℃時刻記為0時刻,分別于6、48和96 h取刺參的腸道組織,并及時固定,保存在-80 ℃冰箱中備用。

1.2 H3K9的乙酰化水平(H3K9ac)的相對定量

H3K9ac抗體選用Rabbit Acetyl-Histone H3 (Lys9) Antiboy(9649,CST),內參蛋白選用histone H3,一抗為rabbit Histone H3 Antibody (4499,CST),二抗均為goat anti-rabbit IgG labelled with HRP (A0208,碧云天)。在預冷的離心管中放入準確稱取的刺參腸道組織,并以1∶9比例加入預冷的RIPA裂解液。4 ℃以12 000 r/min的轉速離心30 min。保留上清液,測定蛋白濃度。將濃度一致的蛋白樣品在冰上解凍,并按4∶1比例加入5×蛋白上樣緩沖液,在95 ℃下煮沸變性5 min。蛋白樣品經過12% SDS-PAGE電泳分離后轉移到PVDF膜上,然后放置于5%的脫脂牛奶中,室溫封閉1 h,封閉結束后,將膜放置于一抗中,4 ℃孵育過夜[33]。TBST溶液漂洗3次,將膜與指示抗體在4 ℃下孵育過夜,加入二抗室溫孵育1 h[35]。用BeyoECL Plus顯色工作液顯影、定影,獲得蛋白條帶,用 NIH Image 1.63 software (Syngene, Cambridge, UK)圖像分析軟件對條帶的灰度值進行分析,獲得目的蛋白的相對表達量[36]。

1.3 刺參HATs 和 HDACs基因結構分析和系統(tǒng)進化樹的構建

從NCBI中獲得刺參基因組信息(ASM275485v1),篩選并分析HATs和HDACs基因的CDS和其對應的基因組序列。通過pI/Mw tool (https://web.expasy.org/compute_pi/)分析蛋白質分子量(Molecular weight, Mw)和等電點等特征(Isoelectric point, pI)。通過在線程序MEME(https://meme-suite.org/meme/tools/meme)獲得蛋白的基序組成。通過TBtools生成外顯子-內含子基因結構圖。

從NCBI下載各物種的ajKAT2B、ajKAT5、ajKAT7、ajKAT8和ajSIRT1、ajHDAC1、ajHDAC3、ajHDAC4基因的氨基酸序列,利用Clustal W和 Mega4.0 軟件進行物種間的多重序列比對,并構建物種間各基因的系統(tǒng)進化樹,通過在線程序Evolview (https://www.evolgenius.info/evolview/#login)美化進化樹。

1.4 mRNA提取及qRT-PCR檢測

采用Trizol試劑(Invitrogen)提取刺參腸道組織的mRNA,檢測RNA提取的完整性、純度和濃度后,利用試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(RR047A, Takara)反轉為cDNA,用試劑TB Green?Premix Ex TaqTM(RR420A, Takara)進行qRT-PCR 實驗[33]。根據各基因的序列信息,設計qRT-PCR所需要的正向引物和反向引物,以β-actin作為內參基因,并設計出對應的引物(見表1)。體系為20 μL,反應程序為:94 ℃維持5 min;40個循環(huán)的94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 min;72 ℃ 10 min;并添加溶解曲線[37]。以β-actin作為內參基因, 采用 2-△△Ct法計算目的基因的相對表達水平[38]。

1.5 數據分析

利用SPSS19.0 軟件 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 對所有目的基因表達量的數據進行方差齊性檢驗(F-test)[39]。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)對符合方差齊性的數據進行檢驗。相對表達量表示為平均數±標準差(Mean±SD)。P<0.05為顯著性差異。

2 結果

2.1 高溫脅迫下刺參H3K9ac動態(tài)變化特征

在高溫脅迫下,刺參的H3K9乙酰化水平有明顯動態(tài)變化(見圖1)。在26 ℃脅迫48 h后,刺參H3K9乙酰化顯著升高,是對照組的1.73倍(P<0.05);在26 ℃脅迫96 h后,刺參H3K9乙酰化顯著降低,是對照組的0.70倍(P<0.05)。

(數值含義為平均值±標準差(n=3)。圖形上方標不同的字母表示差異顯著(P<0.05),標相同的字母表示差異不顯著(P>0.05)。Values indicate mean±SD (n=3).The different letters in the figure mean significant difference (P<0.05), and the same letters mean insignificant difference (P>0.05).)

2.2 刺參HATs和HDACs基因結構和系統(tǒng)進化樹分析

組蛋白乙酰化水平受到乙酰化酶和去乙酰化酶的調控。通過刺參基因組序列,篩選并分析重要的乙酰化酶和去乙酰化酶的基因和蛋白結構(見圖2):ajKAT2B基因長度為9 976 bp,有11個外顯子,編碼540個氨基酸序列,蛋白等電點和分子量預測為8.79

圖2 刺參HATs和HDACs基因結構

和61.41 kDa;ajSIRT1基因長度為7 338 bp,有7個外顯子,蛋白等電點和分子量預測為5.51和55.14 kDa;ajKAT7基因長度為5 797 bp,有6個外顯子,編碼281個氨基酸,蛋白質等電點和分子量分別預測為8.99和33.35 kDa;ajKAT5基因長度為11 219 bp,有12個外顯子,編碼470個氨基酸,蛋白質等電點和分子量分別預測為9.10和55.08 kDa;ajKAT8基因長度為6 652 bp,有9個外顯子,編碼429個氨基酸,蛋白質等電點和分子量分別預測為9.05和51.03 kDa;ajHDAC1基因長度為5 121 bp,有5個外顯子,編碼202個氨基酸,蛋白質等電點和分子量分別預測為6.59和23.26 kDa;ajHDAC3基因長度為10 768 bp,有11個外顯子,編碼428個氨基酸,蛋白質等電點和分子量分別預測為5.16和49.08 kDa;ajHDAC4基因長度為23 459 bp,有23個外顯子,編碼875個氨基酸,蛋白質等電點預測為7.22(見表2)。下載各個物種相應基因后,進行進化樹構建。結果表明:刺參ajKAT2B和ajSIRT1均與棘皮動物門的棘冠海星(Acanthasterplanci)和紫色球海膽(Strongylocentrotuspurpuratus)的對應基因聚類在最近的分支,ajKAT5與綠海膽(Lytechinusvariegatus)的對應基因聚類在最近分支,ajKAT7、ajKAT8和ajHDAC3、ajHDAC4與棘皮動物門的紅海盤車(Asteriasrubens)位于相鄰的枝條上,具有較強的同源性;刺參大多數HATs和HDACs基因與哺乳動物門的人類(Homosapiens)和鼠科(Rattusrattus和Musmusculus)對應的基因聚類在最遠的分支(見圖3)。

圖3 刺參HATs和HDACs基因結構和系統(tǒng)進化樹

通過MEME共鑒定出15個基序。如圖4所示,除了ajKAT2B,乙酰化酶的大多數基因的基序分布和數量相同,且基序在結構上排列一致,在基本相同的位置,基序高度保守;類似的,去乙酰化酶除了ajSIRT1和ajHDAC4外,大多數基因的基序分布和數量相同,且基序在基本相同的位置且排列一致。

圖4 刺參HATs和HDACs基因保守基序

2.3 刺參HATs和HDACs基因在高溫脅迫下的mRNA表達量

通過qRT-PCR對4種HATs基因的mRNA表達的定量研究發(fā)現(見圖5),ajKAT2B在高溫脅迫48 h后有顯著上升,表達量是對照組的1.90倍(P<0.05);在高溫脅迫96 h后,ajKAT2B的表達量則開始下降,與對照組無顯著差異(P>0.05)。ajKAT5在高溫脅迫48 h后表達量顯著高于對照組,約為對照組的2.39倍(P<0.05);在高溫脅迫96 h后,ajKAT5的表達量則與對照組相比顯著下降(P<0.05)。ajKAT7的表達量在高溫脅迫48和96 h后均顯著高于對照組,分別為對照組的2.76和2.37倍(P<0.05)。在高溫脅迫48 h后ajKAT8的表達量顯著上升,約為對照組的4.64倍;在高溫脅迫96 h后,ajKAT8的表達量開始下降,與對照組無顯著差異(P>0.05)。

(數值含義為平均值±標準差(n=5)。圖形上方標不同的字母表示差異顯著(P<0.05),標相同的字母表示差異不顯著(P>0.05)。 Values indicate mean±SD (n=5).The different letters in the figure mean significant difference (P<0.05), and the same letters mean insignificant difference (P>0.05). )

對4種HDACs基因的mRNA表達的定量研究發(fā)現(見圖5):刺參基因ajSIRT1在高溫脅迫6和48 h后均有明顯的上升,表達量分別為對照組的2.31和1.63倍(P<0.05);在高溫脅迫96 h后,ajSIRT1的表達量下降至與對照組無顯著差異水平(P>0.05)。ajHDAC1在高溫脅迫6 h后表達量顯著降低,在48 h后顯著升高并達到峰值,約為對照組的2.51倍;在高溫脅迫96 h后,ajHDAC1的表達量開始下降,與對照組無顯著差異(P>0.05)。ajHDAC3和ajHDAC4的表達量的變化趨勢類似,在高溫脅迫6 h后均顯著上升,表達量分別為對照組的3.01和3.61倍(P<0.05),在48 h后開始下降至與對照組無顯著差異的水平(P>0.05),在高溫脅迫96 h后,ajHDAC3與對照組相比顯著下降(P<0.05),而ajHDAC4繼續(xù)下降與對照組無顯著差異(P>0.05)。

3 討論

組蛋白乙酰化是重要的轉錄后修飾方式之一,對生物的環(huán)境適應性具有重要意義[40]。H3K9ac作為一種組蛋白乙酰化修飾,常被認為與基因的轉錄激活相關[41-42]。有關H3K9ac在環(huán)境脅迫下的變化特征,及其對基因轉錄的調控作用在植物和高等動物中的研究較為廣泛,例如,在擬南芥(Arabidopsisthaliana)的研究中發(fā)現,干旱脅迫可導致其H3K9ac增加,增加水分后其H3K9ac又迅速降低[43]。低氧處理下,哺乳動物細胞整體的H3K9乙酰化水平顯著下降[16,44]。溫度是影響生物最重要的環(huán)境因子之一。在植物中研究發(fā)現,低溫可導致組蛋白乙酰化水平的快速變化,且這種變化是可逆的[45]。短暫的高溫脅迫導致的玉米幼苗葉片組織的H3K9ac明顯升高[17]。研究海洋生物對高溫的生理生態(tài)響應在全球變暖的背景下意義重大,但目前在海洋動物中對高溫脅迫下H3K9乙酰化水平的特征及作用卻鮮有報道。

由于刺參對于溫度非常敏感,在溫度驟升情況下,會出現吐臟、化皮等應激反應。組蛋白乙酰化作為重要的轉錄后調控方式,在刺參中開展高溫脅迫下組蛋白乙酰化修飾特征及其調控機制的研究具有重要的意義。本研究結果表明:在26 ℃高溫脅迫下,刺參腸道組織整體的H3K9ac水平隨著脅迫時間呈明顯的動態(tài)變化:具體表現為脅迫48 h后有明顯的上升,然后在96 h又迅速下降。目前普遍認為組蛋白乙酰化可以使其染色質結構變得松散,促進基因的轉錄激活或延伸過程[11-13]。我們從以上結果推測:高溫脅迫下,受到H3K9ac調控的基因轉錄也呈先上升后下降的趨勢。高溫脅迫會導致很多功能基因表達量發(fā)生顯著變化,很多重要的熱脅迫響應基因(如HSP10、HSP60、HSP26、HSP70和HSP90)mRNA表達量在短時間內迅速升高,但隨著脅迫時間的延長而逐漸下降[34,46]。因此,我們推測高溫脅迫下刺參H3K9ac的動態(tài)變化對調控熱脅迫響應基因的轉錄起到重要作用。

組蛋白的乙酰化水平由一系列組蛋白乙酰轉移酶(HATs)和去乙酰化酶(HDACs)競爭性作用共同決定。組蛋白乙酰化修飾相關基因的表達情況可以間接反映組蛋白乙酰化修飾的過程,本研究在刺參基因組中篩選了組蛋白乙酰化修飾的8個代表性酶基因(HATs:ajKAT2B、ajKAT5、ajKAT7和ajKAT8;HDACs:ajSIRT1、ajHDAC1、ajHDAC3和ajHDAC4),然后對其基因結構進行解析并對保守基序進行分析。結果表明,刺參的大多數HATs基因的基序分布和數量相同,其中ajKAT5、ajKAT7和ajKAT8同屬于組蛋白乙酰轉移酶MYST家族,基序在結構上排列一致,基序在基本相同的位置,且高度保守,因此推測這3種基因行使大致相同的功能,對組蛋白進行乙酰化修飾;在HDACs中也發(fā)現相同的情況,ajHDAC1、ajHDAC3作為Ⅰ類HDACs具有結構相似的保守基序,與其他兩類HDACs有很大的區(qū)別,推測ajHDAC1、ajHDAC3行使類似的功能,而ajSIRT1和ajHDAC4調控不同的組蛋白去乙酰化修飾。此外,4種HATs基因和4種HDACs基因的系統(tǒng)進化樹與物種進化樹呈現一致的趨勢,這也證明刺參HATs和HDACs的功能較保守。

為了進一步證明ajKAT2B和ajSIRT1在刺參高溫脅迫響應中發(fā)揮作用,我們通過qRT-PCR對8個基因的mRNA表達進行了定量研究。結果表明:4種HATs基因的表達量均在高溫脅迫48 h后有明顯上升,并在脅迫96 h后出現下降趨勢,其中ajKAT2B,ajKAT8下降到對照組水平,這與之前王天明等[47]在對刺參長時間夏眠的研究中KAT2B在0～5 d的表達量無明顯變化的結果是一致的。4種HDACs基因中,除ajHDAC1外,其余3種HDACs均在高溫脅迫6 h后表達量達到最高,而后逐漸下降;ajHDAC1在高溫脅迫6 h后有明顯的下降,又在48 h后迅速上升,后降低至對照組水平,這與陳慕雁等研究結果中刺參組蛋白脫乙酰基轉移酶在夏眠期間表達量的檢測結果相符,這表明HDAC4的表達量在深度夏眠期的腸道組織中顯著增加,當夏眠解除時又恢復到正常水平[38],李尚俊等的研究也證明刺參腸道的HDAC3在高溫脅迫下迅速上升,在6 h后略有下降,說明刺參在高溫脅迫下的表觀遺傳調控隨著脅迫時間的延長最終趨于平穩(wěn)[48]。上述結果表明,在高溫脅迫下,刺參HATs和HDACs的響應均是短暫而動態(tài)的。以上結果與其他物種中相關基因mRNA表達水平的研究結果相一致,例如,40 ℃脅迫1 h處理會導致擬南芥GCN5基因的mRNA水平顯著上升[19]。在對斑馬魚的研究中發(fā)現,敲降組蛋白去乙酰化酶基因HDAC8使ZF4細胞的死亡增加[49]。對一種潮間帶帽貝(Cellanatoreuma)的研究發(fā)現,SIRT1對高溫脅迫和滲透壓脅迫均有明顯的響應,可作為脅迫環(huán)境下的指示基因[28]。研究還發(fā)現,在34 ℃脅迫1和4 h的帽貝SIRT1的mRNA表達量相比于對照組(16 ℃)顯著升高[50]。

在高溫脅迫下刺參HATs和HDACs均有短暫升高的響應,兩者表達量的變化可能是導致高溫脅迫下H3K9ac動態(tài)變化的原因之一,從而進一步影響基因的轉錄調控及其對高溫的耐受能力。但是,組蛋白乙酰化動態(tài)變化的調控機制非常復雜,可能有除以上HATs和HDACs外的其他關鍵的組蛋白乙酰化相關酶基因參與該過程,這還需要進一步深入研究落實。

4 結語

組蛋白修飾是重要的表觀調控方式,對生物在環(huán)境脅迫下基因的轉錄表達和環(huán)境耐受性有明顯的作用。本文首次在刺參中研究了高溫脅迫下H3K9乙酰化水平的動態(tài)變化,推測該變化對刺參高溫脅迫下基因的轉錄表達調控有明顯的作用。組蛋白乙酰化水平由乙酰轉移酶和去乙酰化酶共同決定,刺參多種HATs和HDACs在mRNA水平上對高溫脅迫均有明顯響應,這可能是導致該過程中H3K9ac變化的因素之一。