miR-184通過(guò)TIMP-2/MMP-14促進(jìn)PNX模型中代償性肺生長(zhǎng)*

彭 靜，向旭東，王忠慧，王瓊川，邵世豪，馬維浩，朱波波，趙 力△

［1昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院（云南省腫瘤醫(yī)院）麻醉科，云南 昆明 650118；2昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院（云南省腫瘤醫(yī)院）胸外科，云南 昆明 650118］

代償性肺生長(zhǎng)（compensatory lung growth，CLG）是指在某種原因?qū)е路谓M織受損時(shí)，身體通過(guò)增加肺組織的數(shù)量或改變肺組織的結(jié)構(gòu)來(lái)適應(yīng)呼吸功能的需要［1］。CLG可以通過(guò)多種途徑實(shí)現(xiàn)，包括細(xì)胞增殖、肺泡擴(kuò)張和血管重塑等［2］。這些途徑可以增加肺組織的表面積，提高氣體交換效率，從而改善呼吸功能。研究顯示，成人在接受右肺切除術(shù)后發(fā)生了CLG 現(xiàn)象［3］。而且在大多數(shù)成年哺乳動(dòng)物的肺切除術(shù)（pneumonectomy，PNX）模型中，手術(shù)切除肺組織也會(huì)導(dǎo)致剩下的肺快速生長(zhǎng)［4］。在CLG 過(guò)程中，其余肺葉的肺泡上皮細(xì)胞增殖與肺重量增加和網(wǎng)絡(luò)重建有關(guān)［2］。雖然對(duì)于調(diào)節(jié)CLG 的分子機(jī)制依舊還沒(méi)有明確的解釋，但它可能為治療肺部疾病和肺組織工程提供重要線索。

微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是真核生物中一個(gè)由19～24個(gè)核苷酸組成的小非編碼RNA 家族，可在轉(zhuǎn)錄后水平后調(diào)節(jié)基因［5］。有研究表明，miRNAs 可以調(diào)節(jié)肺細(xì)胞增殖、分化、凋亡、肺泡化、血管生成和血管化［6-7］。探索miRNAs 在肺發(fā)育/損傷中的作用漸漸成為研究熱點(diǎn)。研究顯示，miRNAs 家族中的miR-184 在非小細(xì)胞肺癌中低表達(dá)，可作為非小細(xì)胞肺癌的潛在治療靶點(diǎn)［8］。還有研究觀察到miR-184 在EGFR 突變的非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移患者中高表達(dá)，可用于非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移的新生物標(biāo)志物［9］。但目前尚不清楚miR-184 在肺發(fā)育中的生理和病理功能。基質(zhì)金屬蛋白酶14（matrix metalloproteinase-14，MMP-14）是一種金屬蛋白酶，主要參與細(xì)胞外基質(zhì)的代謝和重塑過(guò)程，在發(fā)育、組織修復(fù)和炎癥等生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。研究顯示，PNX 誘導(dǎo)的肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞激活VEGFR2 和FGFR1，可觸發(fā)MMP-14 的產(chǎn)生，進(jìn)而刺激上皮細(xì)胞的擴(kuò)張［10］。此外，MMP-14的活性還受到金屬蛋白酶組織抑制物2（tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2）的調(diào)控，TIMP-2 作為一種天然的抑制物，其主要作用是調(diào)節(jié)金屬蛋白酶的活性，以維持細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)態(tài)［11］。那么，miR-184在肺發(fā)育中的作用是否通過(guò)TIMP-2/MMP-14 通路來(lái)實(shí)現(xiàn)，目前尚不清楚。本研究通過(guò)切除小鼠左肺構(gòu)建PNX動(dòng)物模型，以及進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，探討miR-184 的作用及其與TIMP-2/MMP-14通路的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

1.1 臨床樣本 從昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院收集了16 例多原發(fā)肺癌（multiple primary lung cancer，MPLC）患者和肺葉切除術(shù)后恢復(fù)較好患者（CLG）的肺組織樣本，在任何與研究有關(guān)的程序之前，已獲得所有個(gè)體參與者的知情同意并獲得了云南省腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（倫理號(hào)：KYCS2022141）。

1.2 動(dòng)物 從湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司獲得20 只8 周齡SPF 級(jí)的雄性C57BL/6J 小鼠（體重20～22 g），許可證號(hào)為SCXK（湘）2019-0004。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的操作獲得了昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理號(hào)：kmmu2020272）。

1.3 細(xì)胞 人肺泡上皮細(xì)胞從深圳豪地華拓生物科技有限公司獲得，并培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM 培養(yǎng)液（HyClone）中，置于37 ℃、5% CO2恒溫孵育箱中培養(yǎng)。

2 實(shí)驗(yàn)分組與處理

2.1 動(dòng)物分組（n=5） PNX 組：在麻醉誘導(dǎo)室中用4.0%異氟烷麻醉小鼠后，用乙醇和碘溶液處理好左胸，沿左側(cè)腋前線切開(kāi)皮膚；在第5 肋間隙處開(kāi)胸進(jìn)入左肺，并用4-0 絲縫線（Ethicon）結(jié)扎肺門；用PDS縫線縫合胸廓切口和皮膚切口，然后皮下注射3 mL溫生理鹽水進(jìn)行復(fù)蘇；術(shù)后皮下注射單劑量丁丙諾啡緩釋劑（3.25 mg/kg）鎮(zhèn)痛。PNX+miR-184 mimic組：術(shù)后將miR-184 mimic 慢病毒（1.5×108TU/mL，200 μL；上海吉瑪基因公司）通過(guò)尾靜脈注射入PNX小鼠體內(nèi)。在第4 天對(duì)小鼠進(jìn)行肺功能測(cè)定后，將小鼠進(jìn)行脫頸處死，取肺組織進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。

2.2 細(xì)胞分組（n=3） 將人肺泡上皮細(xì)胞在24孔板中培養(yǎng)過(guò)夜，待細(xì)胞密度達(dá)到60%～70%左右時(shí)，根據(jù)Lipofectamine 3000（Invitrogen）說(shuō)明書(shū)將NC-mimic、miR-184 mimic、OE-NC 和OE-TIMP-2（上海吉瑪基因公司）以終濃度100 nmol/L 按分組轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，并檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

3 主要實(shí)驗(yàn)方法

3.1 肺功能測(cè)定和肺組織病理學(xué)觀察 （1）在術(shù)后第4 天，參考前人的方法［12］，用異氟烷麻醉小鼠，從頸部中線切口切開(kāi)氣管；用20 號(hào)空心針插入氣管，隨后將其連接到flexiVent 系統(tǒng)（SCIREQ）；總肺活量和肺順應(yīng)性由壓力-容積環(huán)路得出。（2）取出剩余的右肺，用10%福爾馬林在30 cmH2O 下充氣，通過(guò)水置換法測(cè)量肺容量來(lái)評(píng)估肺生長(zhǎng)［13］。所有參數(shù)都根據(jù)體重進(jìn)行歸一化處理。（3）取肺組織置于4%甲醛溶液中，固定48 h；常規(guī)脫水、石蠟包埋、制備組織切片，厚度約為5 μm；進(jìn)行HE 染色；自然晾干后，于光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化并拍照。

3.2 RT-qPCR 實(shí)驗(yàn) 使用Trizol 試劑（Invitrogen）分別提取肺組織和人肺泡上皮細(xì)胞中的總RNA，采用First-Strand cDNA 合成試劑盒（武漢君諾德生物技術(shù)有限公司）將RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以GAPDH 和U6 為內(nèi)參照，結(jié)果采用2-ΔΔCt法計(jì)算。引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. Sequences of the primers for RT-qPCR

3.3 Western blot實(shí)驗(yàn) 用含1%蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液（Sigma-Aldrich）提取人肺泡上皮細(xì)胞和肺組織中的蛋白；根據(jù)BCA 檢測(cè)試劑盒（Thermo Fisher）說(shuō)明書(shū)測(cè)定蛋白濃度；總蛋白通過(guò)SDS-PAGE 分離，再轉(zhuǎn)移到PVDF 膜（Millipore）上，然后用5%脫脂奶粉在室溫下封閉1.5 h；加入稀釋過(guò)的Ⅰ抗［MMP-14抗體（1∶2 000； ab51074）、TIMP-2抗體（1∶1 000； ab180630）和GAPDH 抗體（1∶1 000；ab9485）均購(gòu)自Abcam］，4 ℃下過(guò)夜；將膜與Ⅱ抗（1∶4 000； ab97051，Abcam）在室溫下孵育1 h；用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒（Millipore）顯色；最后用ImageJ軟件對(duì)條帶進(jìn)行半定量分析。

3.4 細(xì)胞增殖檢測(cè) （1）將人肺泡上皮細(xì)胞（每孔5×103個(gè)）接種在96 孔板中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；按分組處理各組細(xì)胞；處理結(jié)束后每孔加入10 μL CCK-8 試劑；用酶標(biāo)儀在450 nm 處測(cè)量每孔吸光度。（2）將細(xì)胞以每孔1×103個(gè)的密度接種在6 孔板中，連續(xù)培養(yǎng)2 周以形成集落；每孔加入5 mL 4%多聚甲醛并孵育15 min；隨后用甲醇固定菌落并用Giemsa 染色試劑盒染色15 min；用自來(lái)水洗滌后，觀察各組細(xì)胞集落形成情況。

3.5 雙螢光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn) 通過(guò)TargetScan 和miRDB 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-184 和TIMP-2 的結(jié)合位點(diǎn)。將含有miR-184 結(jié)合位點(diǎn)的TIMP-2 3'-UTR 克隆至pGL3 載體（Promega），構(gòu)建野生型（wild-type，WT）TIMP-2載體。采用定點(diǎn)誘變?cè)噭┖挟a(chǎn)生突變型（mutant，MUT）TIMP-2 載體。采用Lipofectamine 3000 將WT 或MUT 與miR-184 mimic 或NC-mimic 共 轉(zhuǎn)染 至293T細(xì)胞。48 h后采用雙螢光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)檢測(cè)螢光素酶活性。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 8 軟件分析數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次。采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-184 在肺葉切除術(shù)后恢復(fù)較好的患者中高表達(dá)

RT-qPCR 結(jié)果顯示，miR-184 在MPLC 患者癌組織中低表達(dá)，而在肺葉切除術(shù)后恢復(fù)較好的患者（CLG）肺組織中高表達(dá)（P＜0.01），見(jiàn)圖1。

Figure 1. miR-184 was highly expressed in multiple primary lung cancer （MPLC） patients with good recovery （compensatory lung growth，CLG） after lobectomy. RT-qPCR was used to measure the expression of miR-184 in tissues. Mean±SD. n=16. **P＜0.01 vs MPLC.圖1 miR-184在肺葉切除術(shù)后恢復(fù)較好的患者中高表達(dá)

2 過(guò)表達(dá)miR-184促進(jìn)人肺泡上皮細(xì)胞增殖

miR-184 mimic 的轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC-mimic 組相比，miR-184 mimic 組的miR-184 表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.01），見(jiàn)圖2A。接著檢測(cè)MMP-14的表達(dá)顯示，與NC-mimic 組相比，miR-184 mimc 組MMP-14的mRNA和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01），見(jiàn)圖2B、C。最后CCK-8 和集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-184 mimic 的轉(zhuǎn)染顯著提高人肺泡上皮細(xì)胞活力并促進(jìn)其增殖（P＜0.01），見(jiàn)圖2D、E。

Figure 2. Overexpression of miR-184 promoted the proliferation of human alveolar epithelial cells. A： RT-qPCR was used to measure the transfection efficiency of miR-184 mimic in the cells； B： RT-qPCR was used to measure the mRNA expression of MMP-14 in the cells； C： Western blot was used to determine the protein expression of MMP-14 in the cells； D： CCK-8 assay was used to measure the viability of human alveolar epithelial cells； E： the proliferation of human alveolar epithelial cells was determined by colony formation assay. NC： normal control. Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs negative control mimic（NC-mimic） group.圖2 過(guò)表達(dá)miR-184促進(jìn)人肺泡上皮細(xì)胞增殖

3 miR-184靶向抑制TIMP-2的表達(dá)

通過(guò)TargetScan 和miRDB 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-184的靶向結(jié)合關(guān)系，確定TIMP-2 是miR-184 的下游靶標(biāo)，見(jiàn)圖3A。同時(shí)，雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，miR-184可靶向調(diào)控TIMP-2的表達(dá)，見(jiàn)圖3B。TIMP-2 表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC-mimic 組相比，miR-184 mimic 組人肺泡上皮細(xì)胞中TIMP-2 的表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01），見(jiàn)圖3C、D。

Figure 3. miR-184 achieved targeted inhibition of TIMP-2 expression. A： the target binding relationship of miR-184 and TIMP-2 predicted by TargetScan and miRDB； B： dual-luciferase reporter assay was used to verify whether miR-184 regulated the expression of TIMP-2； C： TIMP-2 mRNA expression was measured by RT-qPCR； D： TIMP-2 proptein expression was determined by Western blot. NC： negative control； WT： wild-type； MUT： mutant. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs NC-mimic group.圖3 miR-184靶向抑制TIMP-2的表達(dá)

4 過(guò)表達(dá)TIMP-2 減弱miR-184 mimic 對(duì)人肺泡上皮細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用

OE-TIMP-2 轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)結(jié)果顯示，與OE-NC組相比，OE-TIMP-2 組人肺泡上皮細(xì)胞中TIMP-2 表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.01），見(jiàn)圖4A。TIMP-2表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC 組相比，miR-184 mimic 組TIMP-2的表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01），而OE-TIMP-2 組TIMP-2的表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01 或P＜0.05）；與miR-184 mimic 組相比，miR-184 mimic+OE-TIMP-2 組TIMP-2的表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)圖4B、C。MMP-14 表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC 組相比，過(guò)表達(dá)miR-184顯著促進(jìn)MMP-14 的表達(dá)（P＜0.01），過(guò)表達(dá)TIMP-2則是顯著抑制了MMP-14 的表達(dá)（P＜0.05），且可顯著逆轉(zhuǎn)miR-184 mimic 對(duì)MMP-14 表達(dá)的促進(jìn)作用（P＜0.01 或P＜0.05），見(jiàn)圖4D、E。CCK-8 和集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC 組相比，miR-184 mimic 的轉(zhuǎn)染顯著提高人肺泡上皮細(xì)胞活力并促進(jìn)其增殖（P＜0.01），而OE-TIMP-2 的轉(zhuǎn)染則顯著抑制人肺泡上皮細(xì)胞活力和增殖（P＜0.05），且可顯著逆轉(zhuǎn)miR-184 mimic對(duì)細(xì)胞活力和增殖的促進(jìn)作用（P＜0.01），見(jiàn)圖4F、G。

Figure 4. Overexpression of TIMP-2 attenuated the promotion of human alveolar epithelial cell proliferation by miR-184 overexpression. A： Western blot was used to determine the overexpression efficiency of TIMP-2 in the cells； B： RT-qPCR was used to measure the mRNA expression of TIMP-2 in the cells； C： the protein expression of TIMP-2 in the cells was determine by Western blot. D： RT-qPCR was used to measure the mRNA expression of MMP-14 in the cells； E： Western blot was used to determine the protein expression of MMP-14 in the cells； F： CCK-8 assay was used to determine the viability of the cells； G： the proliferation of the cells was determined by colony formation assay. NC： negative control； OE： overexpression. Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs OE-NC or NC group； #P＜0.05，##P＜0.01 vs miR-184 mimic group.圖4 過(guò)表達(dá)TIMP-2減弱過(guò)表達(dá)miR-184對(duì)人肺泡上皮細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用

5 miR-184促進(jìn)PNX后小鼠的肺功能恢復(fù)

小鼠肺功能檢測(cè)結(jié)果顯示，與PNX 小鼠相比，miR-184 mimic 的處理顯著提高小鼠的肺容量、肺活量和肺順應(yīng)性（P＜0.01），見(jiàn)圖5A～C。HE 染色結(jié)果顯示，與PNX 組相比，PNX+miR-184 mimic 組小鼠肺部細(xì)胞顯著增多，見(jiàn)圖5D。RT-qPCR 結(jié)果顯示，與PNX 組相比，PNX+miR-184 mimic 組的miR-184 表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01），見(jiàn)圖5E。MMP-14 和TIMP-2 表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果顯示，與PNX 組相比，PNX+miR-184 mimic 組小鼠肺組織中MMP-14 的表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.01），TIMP-2 的表達(dá)量顯著下調(diào)（P＜0.01），見(jiàn)圖5F、G。

Figure 5. miR-184 promoted the recovery of lung function in mice after pneumonectomy （PNX）. A： mouse lung volume measurement； B： mouse total vital capacity measurement； C： mouse lung compliance measurement； D： HE staining was used to observe the pathological changes of mouse lung tissues （scale bar=100 μm）； E： RT-qPCR was used to measure the expression of miR-184 in mouse lung tissues； F： Western blot was used to determine the protein expression of TIMP-2 and MMP-14 in mouse lung tissues； G： RT-qPCR was used to measure the mRNA expression of TIMP-2 and MMP-14 in mouse lung tissues. Mean±SD. n=5. **P＜0.01 vs PNX group.圖5 miR-184促進(jìn)PNX后小鼠的肺功能恢復(fù)

討 論

MPLC 通常是指在肺部同時(shí)或相繼出現(xiàn)兩個(gè)或更多的獨(dú)立原發(fā)癌癥［14］。對(duì)于MPLC 患者，肺葉切除術(shù)是一種常見(jiàn)治療方法。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在PNX 后，剩余的肺組織還會(huì)發(fā)生CLG，以彌補(bǔ)切除部分的功能［15］。CLG 可以通過(guò)肺容積的增加、肺組織的重塑和肺功能的提高來(lái)實(shí)現(xiàn)［16］。目前關(guān)于CLG 機(jī)制的研究較少，本研究確認(rèn)了一種與CLG 發(fā)生的新的分子機(jī)制，即miR-184可以通過(guò)調(diào)控TIMP-2/MMP-14改善PNX后小鼠肺功能。

miRNA 是基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，參與多種細(xì)胞的生物功能調(diào)節(jié)［17］。目前已有很多關(guān)于miR-184 研究的報(bào)導(dǎo)。如Rao 等［18］的研究顯示，miR-184在肺腺癌中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-184 能有效抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。Wu 等［19］的研究顯示，促進(jìn)miR-184 表達(dá)可以抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和順鉑耐藥性。此外，還有研究顯示miR-184作為小細(xì)胞肺癌的腫瘤抑制因子，能在體外抑制小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲［20］。但并未有miR-184對(duì)CLG 影響的相關(guān)報(bào)道。本研究觀察到miR-184 在肺葉切除術(shù)后CLG 的MPLC 患者中顯著高表達(dá)。miR-184 的差異表達(dá)讓我們猜想其可能在CLG 中發(fā)揮重要作用。通過(guò)在人肺泡上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-184 mimic 觀察miR-184 的作用，發(fā)現(xiàn)miR-184 mimic的轉(zhuǎn)染可以有效促進(jìn)人肺泡上皮細(xì)胞增殖。本研究觀察到的miR-184 對(duì)細(xì)胞增殖的作用與前人研究不同，可能是前人的研究集中在癌細(xì)胞上，而本研究集中在正常細(xì)胞中，由此可見(jiàn)miR-184作用廣泛。

本研究進(jìn)一步探究miR-184 調(diào)控人肺泡上皮細(xì)胞增殖的下游機(jī)制。通過(guò)生物信息網(wǎng)站預(yù)測(cè)到TIMP-2 是miR-184 的下游靶標(biāo)。此外，研究顯示肺損傷后細(xì)胞外基質(zhì)的重塑依賴于降解膠原的MMP及其內(nèi)源性抑制劑TIMP［21］。因此我們推測(cè)TIMP-2可能也在CLG 進(jìn)程中有重要作用。Yang 等［22］報(bào)道，miR-550a-3p 可以通過(guò)下調(diào)TIMP-2 促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。本研究觀察到miR-184 靶向負(fù)調(diào)控TIMP-2，并且miR-184 mimic對(duì)人肺泡上皮細(xì)胞增殖的促進(jìn)可以被過(guò)表達(dá)TIMP-2 所逆轉(zhuǎn)。這表明miR-184 通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控TIMP-2 促進(jìn)人肺泡上皮細(xì)胞增殖，與既往研究表現(xiàn)出一致的miRNA 調(diào)控TIMP-2進(jìn)而影響疾病進(jìn)程的調(diào)控機(jī)制。

此外，TIMP-2 作為MMP 的內(nèi)源性抑制劑之一［23］，其抑制人肺泡上皮細(xì)胞增殖的作用可能是通過(guò)調(diào)控MMP 實(shí)現(xiàn)的。已有研究表明，下調(diào)MMP-14能抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［24］。在Ding等［25］的研究中，在PNX 之后，抑制MMP-14 的表達(dá)干擾了肺泡的再生。而且McLaughlin 等［26］的研究表明，TIMP-2 能通過(guò)抑制MMP-14 表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲。因此，我們同樣檢測(cè)了MMP-14在本研究中的表達(dá)情況，觀察到過(guò)表達(dá)miR-184 顯著促進(jìn)MMP-14 的表達(dá)，而過(guò)表達(dá)TIMP-2 則顯著抑制MMP-14 的表達(dá)。這表明TIMP-2 對(duì)人肺泡上皮細(xì)胞增殖的抑制作用是通過(guò)抑制MMP-14實(shí)現(xiàn)的。

總之，本研究揭示了miR-184 通過(guò)抑制TIMP-2促進(jìn)MMP-14的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)人肺泡上皮細(xì)胞增殖以及PNX后小鼠肺功能的恢復(fù)。然而本研究存在一定的局限性。首先，沒(méi)有做關(guān)于MMP-14調(diào)控人肺泡上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)，未來(lái)需要進(jìn)一步驗(yàn)證。其次，只在體外驗(yàn)證了miR-184/TIMP-2/MMP-14 信號(hào)通路對(duì)人肺泡上皮細(xì)胞的調(diào)控作用，并沒(méi)有在動(dòng)物體內(nèi)完全驗(yàn)證整條信號(hào)通路，需要更多的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來(lái)證明這一結(jié)論。