溫度、時間對不同方法檢測地下水中總大腸菌群的影響

摘 要：分別以溫度和時間為變量，比較了濾膜法、酶底物法檢測地下水中總大腸菌群的數量。研究表明，2種方法的檢測結果隨溫度變化趨勢基本一致，在35、36、37 ℃時，大腸菌群生長最快，3個溫度下的檢測結果基本無差異（P < 0.05），而與28、32、40℃下的檢測結果相比差異明顯。濾膜法和酶底物法的培養時間在22、24、28 h時總大腸菌群基本無差異（P < 0.05），而16、18、20、32 h的總大腸菌群數差異明顯。因此為保證實驗數據真實準確，2種檢測方法都應嚴格控制培養溫度和時間。培養溫度為36±1 ℃，培養時間為22～28 h。

關鍵詞：培養溫度；培養時間；總大腸菌群數；濾膜法；酶底物法；影響因素

Temperature and time effects on different methods to detect total coliform bacteria in groundwater

WANG Puyu1，2

（1.Beijing Institute of Geo-Environment Monitoring， Beijing 100195， China；

2.Urban Groundwater Safety Prevention and Control Technology Innovation Base， Beijing 100195， China）

Abstract： This paper compared the number of total coliform bacteria detected by membrane filtration method and enzyme substrate method， using temperature and time as variables， respectively. The study shows that the detection results of the two methods basically agreed with the temperature change trend. At 35 ℃， 36 ℃ and 37 ℃， the coliform bacteria grew the fastest and showed almost no difference for the three temperatures （P<0.05）， but varied significantly at 28 ℃， 32 ℃， and 40 ℃. The primary culture time of filter membrane method and enzyme substrate method were basically not different at 22 h， 24 h and 28 h （P< 0.05）， while the total coliform number at 16 h， 18 h， 20 h and 32 h varied significantly. Therefore， in order to ensure the true accuracy of the experimental data， the culture temperature and time should be strictly controlled when using either of the two detection methods. The incubation temperature and time were 36 ± 1 ℃， and from 22 h to 28 h， respectively.

Keywords： incubation temperature; incubation time; total coliform bacteria; membrane filtration method; enzyme substrate method; influencing factors

地下水是城市生活和工農業生產的重要水源，且許多城市地下水的使用量占整個城市供水量的一半以上，城市垃圾糞便對地下水源的污染深受專家重視（朱濟成，1981；畢桂超等，2010）。大腸菌群是一類與糞便污染有關的菌群（呂肖楠，2014），主要包括大腸埃希氏菌、產氣克雷伯氏菌、檸檬酸桿菌和陰溝腸桿菌等，通常可作為水體糞便污染的指標菌（張楊，2015）。指標菌的數量與水體受糞便污染的程度呈正相關，且這些菌中極可能存在腸道致病菌，對人體健康存在威脅（昝帥君等，2015），地下水中大腸菌群的研究一直以來備受關注（陳露等，2013；劉京梅等，2006）。

在總大腸菌群檢測中，培養溫度和培養時間是重要的控制因素，溫度異常或培養時間有誤均會影響檢測結果。特別是與有機指標和無機指標相比，微生物的檢測周期一般較長。全自動固相萃取-高效液相色譜法檢測16種多環芳烴，40 min內實現了全部待測指標的分離檢測（紀春苗等，2017）；高效液相色譜法分離檢測鐵、銅、鋅，10 min內便實現了Fe3+，Cu2+，Zn2+的同時分離測定（吳憲龍等，2000）；微生物的檢測周期相對要長（≥22 h），檢測中若某個步驟出現偏差，時間、精力均會增加，嚴重影響檢測效率。因此，結果異常的快速定位分析以及清楚了解符合檢測的溫度區間、培養時間區間尤為重要。環境因素、測樣要求不同，檢測方法亦不同。GB/T5750.12-2006生活飲用水衛生指標規定了3種檢測方法：濾膜法、多管發酵法、酶底物法。多管發酵法適用范圍廣，可用于各種水樣的檢測，但操作繁瑣，出具結果慢（鄒文燕等，2022）；相對多管發酵法，濾膜法操作簡便，出具結果快，適用范圍較窄，更適用于濁度較低、總大腸菌群較少的水樣（農樹莘等，1993）；而酶底物法相對前2種方法成本較高，但操作簡單、檢測周期短（孫杰，2020）、準確度高，且無需無菌環境（田立平等，2019），可滿足大量水樣檢測及應急水樣檢測工作的需要（趙春霞等，2009；王士花等，2017），已在國際上被廣泛認可。綜上可知，不同方法檢測總大腸菌群在操作及出具結果周期等方面各有不同，而其在檢測大腸菌群時隨環境如何變化？變化是否一致？逯南南等人（2014）用酶底物法檢測研究了不同溫度、不同時間、是否為無菌環境等條件下的大腸菌群的變化，而對不同方法檢測大腸菌群時檢測結果隨溫度時間的變化、檢測結果是否一致未做研究。

因此，本文分別選擇濾膜法和酶底物法（因多管發酵法流程復雜，檢測周期長，因此本文未選擇此方法），研究了總大腸菌群隨溫度、時間的變化，對比了2種檢測方法對大腸菌群隨環境變化的影響。此研究結果為濾膜法和酶底物法檢測總大腸菌群時控制培養時間、培養溫度提供了理論依據，也為研究其他檢測方法對大腸菌群隨環境變化的影響提供了參考，進而為深入研究不同方法下大腸菌群隨溫度、時間等其他環境條件變化的原理等提供了研究基礎。

1? 材料與方法

1.1? 實驗室設備與試劑

1）濾膜法

奧林巴斯顯微鏡，型號 CX33；博訊壓力滅菌器，型號 BXM-30R；生化培養箱產于上海一恒科學儀器有限公司，型號LRH-150；培養皿采用90 mm玻璃平皿；玻璃試管，直徑180 mm。培養基為品紅亞硫酸鈉培養基、乳糖蛋白胨培養液，為BR（生物試劑），由北京奧博星生物科技有限公司購買。

2）酶底物法

程控定量封口機，型號 lk-2010；定量盤，97孔定量盤；定量瓶，100 mL一次性無菌定量瓶。培養基，Minimal Medium ONPG-MUG（簡稱MMO MUG）培養基試劑，以上儀器設備及試劑均由西安立科有限公司購買；生化培養箱與濾膜法中的描述一致。

1.2? 方法原理

1）濾膜法。水樣通過0.45 ?m的濾膜（已經高溫煮沸滅菌），細菌即被截留在濾膜上，將帶有濾膜的培養基于培養箱中培養24 h后，將可疑菌落進行驗證實驗——革蘭氏染色、乳糖發酵實驗，若革蘭氏染色出現特征菌，且乳糖發酵實驗中有產酸產氣現象，表明此特征菌為大腸菌群陽性。計數濾膜上出現的此特征菌群數，即100 mL水樣中總大腸菌群數。

2）酶底物法。水樣經過選擇性培養基（MMO MUG）培養會產生了一類細菌菌群，此類菌群可產生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase），當β-半乳糖苷酶將MMO MUG培養基中的色原底物分解，便釋放出色原體使培養基呈現顏色變化，通過計算定量盤中顏色變化的格數算出水樣中總大腸菌群數。

1.3? 實驗方法及步驟

為了研究培養溫度、時間對大腸菌群數的影響是否會因檢測方法的不同而變化，本實驗以濾膜法和酶底物法為檢測方法，對6個北京市采集的地下水樣（樣品編號分別為D1、D2、D3、D4、D5、D6）分別在28、32、35、36、37、40℃溫度下培養24 h后研究總大腸菌群數隨溫度的變化，在36℃下分別培養16、18、20、22、24、28、32 h研究總大腸菌群數隨時間的變化。

每個水樣設置2個平行樣，以平行樣的均值作為檢測結果，且每一批水樣均設置空白培養基作為空白對照，設置質控樣驗證檢測結果的準確性。具體檢測步驟見表1。

1.4? 計算方法

1）濾膜法：總大腸菌群數按公式（1）計算濾膜上生長的總大腸菌群數，以每100 mL水樣中的總大腸菌群數（CFU·100 mL-1）表示。公式（1）計算所得總大腸菌群數是以濾膜上生長的大腸菌群數計的。

總大腸菌群菌落數 = （數出的大腸菌群菌落數×100）/過濾的水樣體積 （1）

2）酶底物法：計數經培養后的定量盤中出現黃色反應的孔數，對照MPN表查出最終的大腸菌群數（MPN·100 mL-1）。

對不同溫度和時間做的數據采用SPSS統計17.0軟件進行處理，以P<0.05作為差異標準，具有統計學意義。

2? 結果與分析

2.1? 溫度對總大腸菌群的影響

1）濾膜法

實驗中溫度分別設置為28、32、35、36、37、40℃，培養時間為24 h，檢測結果如圖1-a所示。由圖1-a可知，以濾膜法檢測總大腸菌群時，6個水樣的檢測值隨溫度變化趨勢基本一致，當培養溫度為35～37℃時，各溫度下總大腸菌群數相近，在此區間溫度對其生長基本無影響，當溫度遠離此區間時，總大腸菌群數逐漸降低，表明低溫或者高溫均抑制大腸菌群的生長。

2）酶底物法

以酶底物法檢測水樣分別在溫度為28、32、35、36、37、40℃下培養24 h后的檢測結果，如圖1-b所示。

結果表明，酶底物法與濾膜法檢測大腸菌群隨時間變化趨勢基本一致，不同培養溫度下的檢測結果存在差異。隨著培養溫度由35℃減小到28℃，D1-D6水樣的總大腸菌群數隨之降低，分別由41.9、18.5、8.1、45.4、<1、67.9 MPN·100 mL-1降低到20.8、2.0、1.0、17.1、<1、48.4 MPN·100 mL-1，差異明顯。而在35、36、37℃時總大腸菌群數基本無差異，具有統計學意義（P<0.05）；在40℃時，總大腸菌群相對35、36和37℃時的值偏小，36±1℃是大腸菌群的最佳培養溫度，實驗中為保證結果準確需嚴格控制培養溫度在此范圍（辛生等，2015）。

綜合考慮，不同檢測方法對大腸菌群的最佳生長溫度36±1℃無影響。此溫度下大腸菌群酶的活性最高，生長代謝最快，然而當培養溫度偏離時，會嚴重影響檢測結果，因此檢測水樣時需嚴格控制溫度。

2.2? 時間對總大腸菌群的影響

對于濾膜法，分為初培養階段和驗證階段，初培養階段即本文所研究培養時間對大腸菌群影響階段，驗證階段培養時間為定量（24 h），酶底物法只需培養無需驗證。

1）濾膜法

濾膜法檢測總大腸菌群時的檢測結果如圖2-a所示。由圖2-a可知，不同初培養時間下大腸菌群總數不同，培養了16、18、20 h后，總大腸菌群數值與培養24 h時的總大腸菌群數（36 CFU·100 mL-1、16 CFU·100 mL-1、9 CFU·100 mL-1、47 CFU·100 mL-1、0、78 CFU·100 mL-1）相比明顯較低，可能是接種于培養基中的大腸菌群，未達到其生長周期，菌落未完全生成；在32 h時，菌落數降低，可能是培養時間較久，導致許多菌體衰老死亡，衰老死亡的菌體會使鏡檢呈破裂狀，影響檢測結果。在培養了22、24、28 h后，經每2個檢測數據之間的對比，總大腸菌群基本無差異（P<0.05），具有統計學意義。

2）酶底物法

相比濾膜法，酶底物法操作無需在無菌環境下，增加了操作的簡便性，與濾膜法類似的是，不同培養時間仍是影響檢測結果準確性的因素，水樣在36℃下分別培養16、18、20、22、24、28、32 h，見圖2-b。

由圖2-b可看出，酶底物法檢測大腸菌群實驗結果隨培養時間的變化呈現波動趨勢，在培養時間分別為16、18、20、32 h時，檢測結果與培養24 h的檢測結果有明顯差異（P>0.05），而在培養時間分別為22、24、28 h時，檢測結果無明顯差異。培養32 h后檢測結果與22、24、28 h時差異明顯，可能是因為MMO MUG培養基中的抑制劑隨培養時間增加降低了抑制雜菌生長的效果，從而影響了檢測結果。因此酶底物法檢測總大腸菌群時，培養時間應該控制在22～28 h，黃曉蓉（2018）、吳海鵬（2023）、逯南南等（2014）人的研究也得到此結果。

綜合考慮，2種方法下濾膜法的初培養時間或酶底物法的培養時間都應控制在22～28 h內，不足或者超出此范圍均影響實驗結果。使用濾膜法時不可提早或推遲鏡檢、驗證實驗，使用酶底物法時不可提早或推遲計算定量盤中顏色變化格數。

2.3? 質量控制

2.3.1? 空白對照

檢測中，每批樣品對應2個空白對照水樣，將空白對照水樣與接種水樣的培養基同時培養，以在36℃、培養24 h條件下的總大腸菌群結果為例，空白對照水樣結果如圖3所示。圖3-a為濾膜法實驗的空白對照，結果無大腸菌群生長；圖3-b為酶底物法實驗的空白對照，表明經培養后定量盤無變色反應，大腸菌群未檢出。因此2種檢測方法均表明，在一系列操作后培養基及器皿未被污染且操作無誤，結果準確。

2.3.2? 質控樣品結果

為了驗證整個檢測過程的準確性，本文每批次樣品添加1個質控樣（由CICC《中國工業微生物菌種保藏管理中心》購買）作為對照，由于2種方法的操作及計數單位不同，為了更直觀的反映檢測結果的準確性，濾膜法和酶底物法采用2個不同的質控樣品，編號分別為：CICC FTQC-75-06和CICC HJQC-003，培養溫度為36℃，檢測結果如表2所示。

實驗結果表明，2種方法下檢測結果均可信。濾膜法檢測結果為123 CFU·100 mL-1，雖與真值180 CFU·100 mL-1有差異，但在95%置信范圍71～460 CFU·100 mL-1內；酶底物法的檢測結果雖與真值存在差異但也在95%置信范圍內。2種方法均有效評價了隨著不同培養溫度和培養時間總大腸菌群數的變化，此結果與徐莊艷（2022）研究成果一致。

3? 結論及建議

大腸菌群最適生長溫度為36±1℃，偏離此溫度區間菌株生長變緩，檢測結果偏小。使用濾膜法和酶底物法2種方法檢測大腸菌群，檢測結果隨溫度變化趨勢基本一致，檢測方法基本不會影響大腸菌群的最適培養溫度；2種檢測方法在培養時間為22～28 h時的檢測結果基本無差異，不足和超出此培養時間均會影響實驗結果。濾膜法、酶底物法檢測水中總大腸菌群時溫度和培養時間均為重要影響因素。

使用不同檢測方法對大腸菌群最適培養溫度和培養時間無影響，而2種方法在檢測時各有優缺點。濾膜法相對酶底物法雖檢測成本較低，但操作復雜，需進行驗證試驗，檢測周期長，檢測效率較低，且微生物檢測對樣品時效性要求較高（采樣后2 h完成檢測），為滿足地下水環境監測的需要，酶底物法更適用當前環境下的水樣檢測。

隨著經濟發展，被污染區域的風險可能會加大，地下水中大腸菌群數量、種類也會發生變化，為了更高效的檢測與分析，水質總大腸菌群檢測新方法的研究勢在必行。且對地表水甚至污水等大腸菌群濃度較高、種類較多的水樣的分析，將是我們下一步研究的內容。

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收稿日期：2023-04-21；修回日期：2023-07-12

基金項目：北京市監測網運行項目（2022年）資助

作者簡介：王璞玉（1993- ），女，碩士，工程師，主要從事水質檢測及分析工作。E-mail：w1335280494@163.com

引用格式：王璞玉，2023.溫度、時間對不同方法檢測地下水中總大腸菌群的影響［J］.城市地質，18（4）：113-118