超聲輔助高凝固點低共熔溶劑提取黃芪黃酮

孟 悅， 潘 旭， 張鑫藝， 袁 帥， 劉婷婷，2，3 ， 袁 橙， 劉吉成

（1.齊齊哈爾醫學院藥學院，黑龍江齊齊哈爾 161000；2.齊齊哈爾醫藥科學研究所博士后科研工作站，黑龍江齊齊哈爾 161000；3.黑龍江中醫藥大學博士后流動站，黑龍江齊齊哈爾 161000）

黃芪（Astragalus membranaceus），屬于豆科植物，具有益氣解毒、強身健體、斂瘡生肌、調節新陳代謝等功效（梁子敬等，2018）。目前，黃芪人工種植技術日益成熟，其產量不斷增加，在畜禽生產中的應用日趨廣泛（韓戰強等，2022）。 將黃芪作為飼料添加劑能夠改善動物的生長性能， 調節免疫功能，提高養殖收益（孫超等，2022）。 黃芪黃酮是黃芪中一類重要的化學成分，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌和抗血栓作用，在保健食品、制藥行業和動物飼料領域都具有廣泛的應用前景（付佳樂等，2022；Liu 等，2020）。王永林等（2013）研究表明，黃芪黃酮對促進動物免疫性能有積極作用，因此有望作為新型天然免疫調節劑應用于畜禽業生產中。

黃酮類化合物難溶于水， 傳統提取溶劑多為甲醇、 乙醇等揮發性有機溶劑， 對環境存在威脅（陳港等，2021）。 低共熔溶劑（DESs）是一種快速興起的可替代傳統有機溶劑的新型綠色溶劑，具有低揮發性、熱穩定性、可設計性、低毒性、可生物降解和制備簡單等突出特點（周立錦等，2020；Xu等，2018；Abbott 等，2003）。DESs 各組分之間不僅可以通過氫鍵相互連接， 而且還可以與藥材中的活性成分形成氫鍵， 因此可以將多種物質溶解出來，并適用于一些難溶于水的化合物（胡鵬程等，2018）。目前，DESs 已被應用于提取中草藥的活性成分，Yin 等（2020）使用DESs 從牛蒡中提取了四種黃酮，其黃酮得率顯著高于甲醇提取。

當前， 對DESs 的研究更多在于開發新的DESs 體系和探索新的應用領域。 DESs 在中草藥研究中尚處于初始階段，還存在許多問題和制約，其中主要包括DESs 的黏度較高以及一類DESs凝固點較高的問題（Wang 等，2022）。 而本研究通過超聲強化技術不僅增加了黃酮的得率， 超聲機所產生的機械熱還可以改善DESs 的高凝固點問題。 本研究旨在為高效提取黃芪黃酮及黃芪黃酮飼料添加劑的開發提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 黃芪中草藥飲片，采購自北京同仁堂 （毫州） 飲片有限責任公司 （批號：201000098J），經齊齊哈爾醫學院藥物分析教研室鑒定為黃芪（Astragalus membranaceus）的干燥根；毛蕊異黃酮標準品（≥98%）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷標準品（≥98%）、刺芒柄花苷標準品（≥98%）、刺芒柄花素標準品（≥98%）、 槲皮素標準品（≥98%）、氯化膽堿（分析純），上海麥克林生化科技有限公司；草酸（分析純）、尿素（分析純）、乳酸（分析純）、丙二酸（分析純）、1，2-丙二醇（分析純）、1，3-丙二醇（分析純）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、甲酸（色譜純），天津市凱通化學試劑有限公司。

1100 型高效液相色譜儀，美國安捷倫科技公司；XS105DU 型電子天平， 美國梅特勒托利多公司；KJ-11030AL 型多頻超聲波清洗儀，深圳市科潔超聲科技有限公司；SHJ-2A 型磁力攪拌水浴鍋，常州金壇良友儀器有限公司；MFJ-W300 型多功能研磨機， 北京利仁科技股份有限公司；TD6A型離心機，長沙英泰儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 DESs 的制備及篩選 采用加熱攪拌法制備DESs，將氫鍵受體（HBA）與氫鍵供體（HBD）按表1 中的摩爾比混合均勻，在80 ℃下不斷加熱攪拌， 直到形成澄清透明的液體即制備完成。 分別考察表1 中10 種不同的DESs 對黃芪中五種黃酮得率的影響，同時使用甲醇提取作為對照試驗。不同組分DESs 的制備及其物理性質見表1。

表1 不同組分DESs 的制備及其物理性質

1.2.2 超聲輔助DESs 提取黃芪中五種黃酮 黃芪飲片經粉碎后過80 目篩，將黃芪粉末與一定量的DESs 均勻混合于錐形瓶中， 然后在超聲水浴中進行提取。 提取液在8000 r/min 的條件下離心10 min，迅速分離上清液和藥渣，上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾后，注入HPLC，得到色譜圖，將峰面積帶入對應的各標準品回歸方程中可得出濃度，計算含量，黃酮得率（Y）計算公式如下：

式中：C 為供試品溶液的濃度，mg/mL；V 為供試品溶液體積，mL；M 為黃芪粉末的質量，g。

1.2.3 黃酮含量測定方法 使用HPLC 法對黃芪中五種黃酮含量進行測定。 HPLC 分析參考梁麗娟等（2010）的方法并進一步摸索洗脫條件，該條件可同時測定黃芪中五種黃酮的含量。色譜條件：色 譜 柱Agilent Eclipse XDB C18 Column （250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.2%的甲酸水溶液（B）；梯度洗脫條件：0 ~ 15 min，15% A，85% B；15 ~ 25 min，20% A，80% B；25 ~ 40 min，25% A，75% B；40 ~ 55 min，37% A，63% B；55 ~60 min，46% A，54% B。 流速：1 mL/min； 檢測波長：280 nm；進樣量：20 μL。

1.2.4 單因素試驗 選擇超聲溫度分別為20、30、40、50、60 ℃； 超聲時間分別為20、30、40、50、60 min； 液固比分 別為10：1、15：1、20：1、25：1、30：1（mL/g）；含水量分別為0%、20%、40%、60%、80%； 超聲功率分別為120、240、360、480、600 W進行單因素試驗。 考察DESs 的超聲溫度、超聲時間、液固比、含水量、超聲功率對黃芪中五種黃酮總得率的影響。

1.2.5 響應面優化提取工藝 根據（BBD）設計原理，在單因素試驗的基礎上，以黃芪中五種黃酮的總得率為響應值，選取超聲時間、超聲溫度、DESs的含水量這三個因素為變量， 使用Design Expert 13.0 統計分析軟件的響應面分析法（RSM）進行響應面試驗。 黃芪五種黃酮總得率響應面因素水平設計見表2。

表2 響應面因素水平設計

響應面二次回歸方程為：

式中：Y 為預測響應值，k 為自變量的數量，Xi和Xj為編碼的自變量 （i=j），β0為常數系數，βi、βii和βij分別為一次項、二次項和交互項的系數。1.2.6 數據處理 以上試驗均重復進行三次。 采用SPSS 統計軟件22.0 版進行方差分析。 使用Design Expert 13.0 軟件進行響應面分析， 對提取條件進行優化。

2 結果與分析

2.1 DESs 的篩選 Smith 等（2014）將DES 分為四類，第一類為季銨鹽和金屬鹽，第二類為季銨鹽和金屬水合物， 第三類為金屬氯化物和有機化合物，第四類為有機化合物和有機鹽。由于前三類中均添加了金屬離子，不適合在醫藥、食品等領域的應用。 本研究選擇的10 種DESs 均為第四類，包括有機鹽氯化膽堿和有機化合物天然酸和有機醇。DESs 具有較強的可設計性，DESs 的理化性質會隨HBA 和HBD 類型和比例的變化而變化，不同性質的溶劑（黏度、電導率和氫鍵作用力）對化合物的提取效果均不同。 從圖1 可知， 由氯化膽堿-草酸（摩爾比1：2）形成的DESs 對黃芪黃酮的提取能力最好，五種黃酮的總得率高于其他DESs和甲醇的提取， 這可能是因為由草酸和氯化膽堿組成的DESs 具有較強的氫鍵作用力。 因此，本試驗選擇氯化膽堿-草酸（1：2）組成的DESs 作為提取溶劑。

圖1 低共熔溶劑種類對黃芪五種黃酮得率的影響

2.2 黃酮含量測定 按照1.2.3 中方法， 使用HPLC 對五種黃酮含量進行測定， 色譜圖見圖2。以各黃酮標準品溶液的濃度為橫坐標（X，mg/mL），以峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線，得到各標準品的回歸方程和線性范圍，結果見表3。

圖2 高效液相色譜圖

表3 五種黃酮的線性回歸結果

2.3 單因素試驗

2.3.1 超聲溫度對黃芪黃酮總得率的影響 超聲溫度對五種黃酮總得率的影響結果見圖3。 在20~40 ℃時，溫度與黃酮總得率呈正線性關系。 當超聲溫度為40 ℃時，黃酮總得率達到1.62 mg/g。 但當超聲溫度超過40 ℃時，黃酮總得率隨著溫度的升高而降低。 溫度的升高有利于降低黃酮與其所在位置之間的物理吸附和相互作用， 游離的黃酮在氫鍵的作用下與DESs 結合 （Guo 等，2021）。DESs 的黏度隨溫度的升高而降低， 促進了傳質，提高了溶劑的擴散速率，從而提高了提取率（Adetunji 等，2017）。 然而，如果溫度過高，黃酮可能會發生降解，導致總得率降低。 因此，提取黃芪中五種黃酮的最佳超聲溫度為40 ℃。

圖3 超聲溫度對黃芪黃酮總得率的影響

2.3.2 超聲時間對黃芪黃酮總得率的影響 不同超聲時間對黃芪黃酮總得率的影響如圖4 所示，在20 ~ 40 min 時， 總黃酮的得率隨著超聲時間的增加而增加。 但是超過40 min 后，總黃酮的得率隨時間的延長而下降。這可能是因為，在早期階段， 黃酮類化合物會隨著時間的延長逐漸滲透到DESs 中，使得率不斷增加。 經過一段時間后，反應體系達到平衡，如果繼續延長超聲時間，總黃酮的得率不會顯著增加。 相反，長時間的超聲輻射還可能會降解一些黃酮類化合物，導致總得率下降。 這與王君等（2022）提取菊花中總黃酮的趨勢一致。五種黃酮的總得率在40 min 時達到最大值1.64 mg/g，因此本試驗選擇40 min 作為提取條件。

圖4 超聲時間對黃芪黃酮總得率的影響

2.3.3 液固比對黃芪黃酮總得率的影響 如圖5所示，黃酮的得率與液量呈正線性關系。當液固比達到25 mL/g 時， 繼續增加液體比例至30 mL/g，黃酮總得率沒有顯著增加（P > 0.05）。 增加溶劑量，可使提取溶劑更充分的與植物細胞接觸，有利于黃芪類黃酮化合物的擴散與溶出， 從而提高總黃酮的得率。 溶劑量不足可能會導致DESs 體系快速飽和，限制提取。但是液量過多不僅會導致浪費以及后續分離純化的困難還會增加其他雜質的溶出（隋志方等，2022）。綜合考慮成本因素和黃酮的得率，選擇液固比為25 mL/g 作為提取條件。

圖5 液固比對黃芪黃酮總得率的影響

2.3.4 含水量對黃芪黃酮總得率的影響 含水量對黃芪中五種黃酮得率的影響見圖6， 隨著含水量的增加， 黃酮總得率呈現先增后降的趨勢。 在含水量為60%時， 黃酮總得率達到最大值1.66 mg/g。 這可能是因為向DESs 體系中加入一定量的水可以降低溶劑的黏度，增加傳質量，提高提取效率。 但是過量的水會破壞DESs 的超分子結構，削弱DESs 和目標化合物之間的相互作用， 導致DESs 的提取能力下降（Dai 等，2015）。 含水量是影響DESs 提取目標化合物的關鍵因素， 因此要嚴格控制水的添加量，本試驗將含水量60%作為后續研究參數。

圖6 含水量對黃芪黃酮總得率的影響

2.3.5 超聲功率對黃芪黃酮總得率的影響 超聲功率對黃芪中五種黃酮得率的影響如圖7 所示，五種黃酮的得率與超聲功率呈正線性關系， 且超聲功率為480 W 和600 W 時，總黃酮的得率沒有顯著性差異（P > 0.05）。 超聲輻射可通過空化效應、機械效應、熱效應等破壞植物細胞的細胞壁和細胞膜，促進溶劑穿透植物細胞，或細胞內的化學成分擴散出細胞（Jha 等，2021）。 因此，超聲輔助DESs 提取黃芪中的類黃酮化合物可以顯著提高黃酮的得率。 但是過度超聲可能會破壞黃酮類化合物的結構，因此本試驗選擇超聲功率480 W 作為試驗條件。

圖7 超聲功率對黃芪黃酮總得率的影響

2.4 響應面優化

2.4.1 響應面試驗結果與方差分析 以五種黃芪黃酮的總得率為響應值， 根據單因素試驗結果選取對總得率影響顯著的三個因素（超聲時間、超聲溫度和含水量）， 進行三因素三水平分析試驗。BBD 試驗設計見表4，方差分析見表5。

表4 試驗設計及黃芪中五種黃酮總得率

表5 響應面擬合回歸方程的方差分析結果

將表4 的數據用Design-Expert 13.0 軟件進行二次多元線性回歸方程擬合， 可得到黃芪中五種黃酮總得率響應面模型的二次多元線性回歸方程為：Y=0.691+1.08×10-2A+2.38×10-2B+9.3×10-3C+5×10-5AB+2.5×10-5AC-5×10-5BC-1.6×10-4A2-2.6×10-4B2-7.7×10-5C2。

從表5 中的P 值可以看出，各種因素對五種黃芪黃酮總得率的影響是不同的。 該模型F 值為28.56（P < 0.01），說明該模型極顯著且方案可行。決定系數R2=0.9735，校正決定系數R2Adj=0.9394，說明此模型方程能具有較好的反應響應值。此外，一次項（A、B 和C）和二次項（A2、B2和C2）被認為對黃酮總得率有極顯著的影響（P < 0.01），交互項BC 被認為對黃酮總得率有顯著的影響 （P <0.05）。回歸方程各項方差分析中的F 值可以判斷自變量對因變量的影響， 由此得到各因素對五種黃酮總得率影響的主次順序為B=C＞A，即超聲溫度和DESs 的含水量對黃酮總得率的影響一致，其次是超聲時間。

2.4.2 各因素交互作用分析 為了研究這三個參數及其相互作用對黃芪中五種黃酮總得率的影響， 分別將黃酮的總得率與兩個試驗變量進行比較，另一變量固定在零水平，依次來考察交互作用對黃酮總得率的影響。 各影響因素的交互作用對五種黃酮總得率的影響如圖8 所示。

圖8 各影響因素的交互作用對五種黃酮總得率的影響結果

圖8a 描述了將DESs 的含水量固定在零水平時， 超聲時間和超聲溫度對黃酮總得率的交互作用。隨著超聲時間和超聲溫度的增加，黃酮總得率顯著增加， 而隨著超聲時間和超聲溫度的進一步增加，總得率呈降低趨勢，與羅蓉等（2022）的研究結果一致。 固定超聲溫度為零水平的含水量與超聲時間相互作用的三維響應面如圖8b 所示。含水量的增加可增強溶液體系中氫鍵的相互作用，但是含水量超過某個值后， 可能會得到不含DESs的水溶液，導致總得率下降，這與Cui 等（2018）的研究結果一致。圖8c 表示在固定超聲時間條件下的含水量和超聲溫度的相互作用的響應面結果，從圖8c 可以看出該響應面坡度非常陡峭。通常響應面坡度越陡峭， 表明該響應值對于條件的改變越敏感，該因素對黃酮總得率的影響就越大；反之坡度越平緩則表明該因素對總得率的影響越小（張秀芬等，2022）。 此外，橢圓形的等高線越密集代表這兩個因素之間的交互作用越強（閆旭宇等，2021）， 比較該等高線圖可以發現， 超聲溫度和DESs 含水量之間的等高線最密集，也就是說這兩個因素之間的交互作用對五種黃酮的總得率的影響最為顯著，這與方差分析的結果一致。

2.4.3 驗證試驗 通過Design-Expert 13.0 軟件對回歸擬合方程進行分析，得出最優提取條件為：超聲時間42.80 min， 超聲溫度43.63 ℃， 含水量54.50%。 考慮到實際操作的可行性，將以上條件調整為超聲時間43 min，超聲溫度44 ℃，含水量54%。并在上述條件下進行了三次驗證試驗，總黃酮的平均得率為1.70 mg/g， 接近理論值1.71 mg/g，相對誤差為0.58%，證明優化結果可靠。

3 討論與結論

與傳統提取溶劑甲醇相比， 本方法使用的低共熔溶劑具有不揮發、綠色安全等諸多優點。但同時研究者們也發現DESs 具有黏度高的特性，與植物組分僅通過浸泡等方式難以均勻高效的傳質， 因此需要一些物理強化方式以及向其中加入一定量的水來降低黏度。 此外，隨著更多的DESs體系被發現，其優點與局限性也進一步被放大。本研究所選用的氯化膽堿與草酸形成的低共熔溶劑具有凝固點高的特性， 雖然其提取率高于其他溶劑，但是此溶劑具有在室溫下操作困難的缺點。本研究在試驗中發現， 超聲提取所產生的機械熱效應可以顯著改善低共熔溶劑這一特性， 為這一類低共熔溶劑在中草藥成分提取領域的局限性提供了解決思路。

本研究使用超聲強化技術輔助低共熔溶劑提取黃芪中的五種黃酮類化合物， 以五種黃酮的總得率為指標， 從10 種DESs 中篩選出了氯化膽堿-草酸（1：2）為最佳提取溶劑。 通過單因素試驗考察了超聲溫度、超聲時間、料液比、含水量和超聲功率對這五種黃酮總得率的影響， 并使用響應面優化法對提取工藝進行了優化。 優化后的最佳提取條件為：超聲時間43 min，超聲溫度44 ℃，含水量54%。此時，黃酮的得率可達到1.70 mg/g，得率高于傳統的甲醇提取法。 表明試驗工藝具有可行性和合理性，可以為開發黃芪資源提供參考。