沙棘提取物促進大鼠肛周膿腫術后創面愈合效果及對p38/MK2通路的影響

童偲辰

作者單位：北京市和平里醫院普外科，北京100000

肛周膿腫是一種因細菌感染導致的急性或慢性化膿感染性疾病，其臨床表現為肛周疼痛和高熱［1］。目前治療的主要方式為手術切除膿腫及引流［2-3］。由于膿腫位置的特殊性，使創面反復感染的風險增加，從而加劇病人疼痛，延緩康復時間［4］。因此，找到一種有效的治療方式，加快手術創口的愈合，對于疾病的治療具有重要意義。p38∕絲裂原活化蛋白激酶2（MK2）信號通路是與炎癥性疾病密切相關的傳導通路，p38∕MK2 信號通路的激活可引起機體炎癥反應加劇，相關炎性因子的水平升高［5］。有研究顯示，當p38∕MK2 信號通路相關蛋白過表達時，可引起機體創面的愈合速度降低，不利于創面修復［6］。因此，本研究致力于找到一種藥物來抑制p38∕MK2 信號通路蛋白的表達，從而加速肛周膿腫術后的愈合。近年來中醫成為了各種疾病治療方式的研究熱點。基于對傷口涂抹沙棘提取物有利于加速創面的愈合［7-8］及其增強免疫力等作用為基礎，于2021 年6—12 月進行本研究，觀察其對肛周膿腫術后創面愈合的作用，并探討其作用機制，以期為臨床肛周膿腫術后的相關治療提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 6周齡SPF級SD大鼠，購自重慶陸軍軍醫大學，體質量范圍200～220 g，動物生產許可號SCXK（渝）2019-0009；動物使用許可號SYXK（渝）2019-0069；動物合格證號20191254，所有大鼠均飼養于SPF級動物房，動物房內室溫：20～25 ℃，濕度40%～60%，動物房光照晝夜交替（12 h∕12 h），動物自由飲水飲食。本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1.1.2 試劑 沙棘提取物（南京建成生物工程研究所，純度99.99%）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-1β 和IL-6 酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海優寧維生物有限公司）；RT-qPCR 試劑盒（上海優寧維生物有限公司）；蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術研究所）；p38、MK2、β-肌動蛋白（β-actin）蛋白抗體（美國，abcam公司）。

1.1.3 儀器 BX53 顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；全自動酶標儀（美國伯樂公司）；電泳儀（美國Thermo 公司）；伯樂Mini-PRO 熒光定量PCR 儀（美國伯樂公司）；LAS 4000 成像系統（美國GE Healthcare 公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組、建模和干預 選取SD 大鼠60 只，采用隨機數字表法將大鼠隨機分成假手術組、模型組、陽性對照組（左氧氟沙星，63 mg∕kg）、沙棘提取物低（5 g∕kg）、中（10 g∕kg）、高（20 g∕kg）劑量組，每組10 只。配置1%戊巴比妥鈉溶液，以1 mL∕kg 劑量腹腔注射麻醉大鼠，大鼠背部備皮并消毒皮膚，手術刀作直徑2 cm圓形切口，在切口處滴加1 mL糞便上清液（糞便上清液制作方法：在5 mL 生理鹽水中加入10 g人新鮮糞便，混勻后半徑10 cm、3 000 r∕min 離心15 min，取上清液備用），用紗布覆蓋創口，并上頸環避免大鼠舔舐傷口，假手術組除不滴加糞便上清液其余步驟相同。48 h 后創面發現膿性分泌物，并伴有糞臭味，提示建模成功。建模成功后手術清除大鼠膿腫并進行清洗，然后紗布覆蓋48 h后進行后續實驗［9-10］。48 h后沙棘提取物各劑量組和陽性對照組灌胃相應的藥物，模型組和假手術組灌胃相同體積的生理鹽水，持續14 d。

1.2.2 檢測指標和方法

1.2.2.1 大鼠創面形態學觀察 大鼠建模成功后，選擇兩名不參與本次實驗，但具有動物實驗經驗的實驗室人員對各組大鼠0 d和觀察期（7 d和14 d）的創面大小進行測量，并根據公式計算大鼠創面的愈合率。愈合率=（0 d創面面積-觀察期創面面積）∕建模成功時的創面面積×100%。

1.2.2.2 大鼠創面組織病理結構觀察 實驗末期，采用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后大鼠固定在解剖板上取大鼠創面組織，并用0.9%生理鹽水清洗組織表面血漬，然后放于福爾馬林溶液中固定48 h，最后制作HE 染色切片并在顯微鏡下觀察組織毛細血管和成纖維細胞變化情況。

1.2.2.3 大鼠 血 清TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平檢測 實驗末期，采用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，采用非抗凝管取大鼠全血3 mL，4 ℃，2 500 r∕min 離心15 min，取上清液于一支新的離心管中，置于-80 ℃保存，備用。采用ELISA 法檢測血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的水平，根據ELISA 試劑盒說明書，對血清樣本進行處理后，采用全自動酶標儀在450 nm 波長處檢測樣本吸光度，并根據標準曲線來計算樣品中TNF-α、IL-1β和IL-6的濃度。

1.2.2.4 總RNA 提取及RT-qPCR 法檢測p38、MK2 mRNA表達水平 根據RNA提取試劑盒提取60只大鼠創面組織中總RNA，并利用反轉錄試劑盒得到cDNA 保存至-80 ℃備用。RT-qPCR 體系：SYBR Green qPCR SuperMix 16.25 μL，特異性引物2.0 μL，模板cDNA3.25 μL，加入DEPC 水，使反應體系為30 μL。擴增條件：94 ℃，12 min；94 ℃，15 s；62 ℃，40 s；72 ℃，30 s；共40個循環。設置3個復孔，以GAPDH為內參，根據公式（2-ΔΔCt法）計算、分析p38、MK2mRNA 表達。引物序列：p38 正向5"-GCTACGTGCGTAGCTAGTA-3"，反向5"-CGGCATGCTACGATGC-3"；MK2 正向5"-TTCGATGTAGTAATTACGCG-3"，反 向5"-GCATTGCGTGTAGCA-3"；GADPH 正向5"-AGCGATTTAGCTAGC-3"，反向5"-CCCGAGTCAGTAAAT-3"。

1.2.2.5 大鼠p38、MK2蛋白水平檢測 處死大鼠步驟同上，取1 g大鼠創面組織放入玻璃研磨器中，加入1 mL RIPA 溶液充分研磨，3 000 r∕min離心10 min后取上清液，檢測蛋白濃度，調節蛋白濃度使其為3 mg∕L，每孔上樣量為10 μL后進行電泳，將凝膠上的蛋白轉移至硝化纖維素膜，5%脫脂奶粉溶液對硝化纖維素膜封閉2 h后，將特異性抗體p38、MK2和β-actin一抗1∶5 000稀釋，4 ℃條件下一抗搖晃孵育12 h，孵育后的硝化纖維素膜使用1%吐溫20清洗3次，每次5 min，清洗后二抗（1∶1 000）孵育2 h，孵育后清洗步驟同上，最后使用顯影劑后在凝膠成像系統上顯影。

1.3 統計學方法本實驗數據采用SPSS 23.0 進行統計分析，正態定量數據用±s描述，多組比較采用單因素方差分析，多重比較為SNK-q檢驗；重復測量數據（創傷愈合率）比較使用重復測量方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 沙棘提取物對大鼠創面愈合率的影響與假手術組比較，模型組大鼠創面愈合率顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組和沙棘提取物各劑量組大鼠創面愈合率顯著升高，且沙棘提取物各劑量組大鼠創面愈合率呈劑量依賴性（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠創面愈合率比較∕（%， ± s）

表1 各組大鼠創面愈合率比較∕（%， ± s）

注：①與假手術組比，P＜0.001。②與模型組比，P＜0.001。③與陽性對照組比，P＜0.001。④與沙棘提取物低劑量組比，P＜0.001。⑤與沙棘提取物中劑量組比，P＜0.001。

創面處理后14 d 72.68±3.79 52.72±3.15①92.61±4.62②60.33±3.29②③71.18±5.66②③④89.75±5.11②④⑤10.22＜0.001組別假手術組模型組陽性對照組沙棘提取物低劑量組沙棘提取物中劑量組沙棘提取物高劑量組F值P值鼠數10 10 10 10 10 10創面處理后7 d 49.86±3.64 14.96±1.30①72.39±4.99②40.25±3.70②③50.26±4.10②③④69.75±4.16②④⑤24.04＜0.001

2.2 大鼠創面組織學變化大鼠創面組織病理結果顯示，模型組大鼠創面組織生長狀態不佳，表皮厚度最薄，細胞邊界模糊，細胞排列紊亂；陽性對照組和沙棘提取物各劑量組表皮厚度明顯增加，且隨著沙棘提取物劑量的增加表皮厚度逐漸增厚；假手術組恢復情況與沙棘提取物中劑量組類似，見圖1。

圖1 各組大鼠肛周膿腫術后創面組織病理變化情況（HE染色×200）

2.3 沙棘提取物對大鼠血清TNF-α、IL-1β 和IL-6的影響與假手術組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β 和IL-6 顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組和沙棘提取物各劑量組大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6顯著降低，且沙棘提取物各劑量組效應呈劑量依賴性（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6比較∕（ng∕L， ± s）

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6比較∕（ng∕L， ± s）

注：TNF-α為腫瘤壞死因子，IL為白細胞介素。①與假手術組比，P＜0.001。②與模型組比，P＜0.001。③與陽性對照組比，P＜0.001。④與沙棘提取物低劑量組比，P＜0.001。⑤與沙棘提取物中劑量組比，P＜0.001。

IL-6 82.63±5.28 136.54±10.75①62.60±6.57②109.22±9.79②③85.38±8.07②③④64.78±6.23②④⑤30.12＜0.001組別假手術組模型組鼠數10 10陽性對照組10沙棘提取物低劑量組10沙棘提取物中劑量組10沙棘提取物高劑量組F值P值10 TNF-α 31.59±4.15 104.88±10.37①20.16±1.19②58.74±4.87②③30.92±3.05②③④21.35±3.11②④⑤39.06＜0.001 IL-1β 0.62±0.05 2.02±0.13①0.42±0.03②1.13±0.07②③0.65±0.05②③④0.47±0.05②④⑤18.22＜0.001

2.4 沙棘提取物對大鼠創面p38、MK2mRNA 表達的影響與假手術組比較，模型組大鼠創面p38、MK2 mRNA 顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組和沙棘提取物各劑量組大鼠創面p38、MK2 mRNA 顯著降低，且沙棘提取物各劑量組效應呈劑量依賴性（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠p38、MK2 mRNA表達水平比較∕ ± s

表3 各組大鼠p38、MK2 mRNA表達水平比較∕ ± s

注：MK2為絲裂原活化蛋白激酶2。①與假手術組比，P＜0.001。②與模型組比，P＜0.001。③與陽性對照組比，P＜0.001。④與沙棘提取物低劑量組比，P＜0.001。⑤與沙棘提取物中劑量組比，P＜0.001。

MK2 mRNA表達1.00±0.03 1.70±0.14①0.61±0.08②1.30±0.11②③0.98±0.06②③④0.66±0.07②④⑤20.18＜0.001組別假手術組模型組陽性對照組沙棘提取物低劑量組沙棘提取物中劑量組沙棘提取物高劑量組F值P值鼠數10 10 10 10 10 10 p38 mRNA表達1.00±0.02 1.82±0.12①0.69±0.07②1.35±0.10②③0.96±0.09②③④0.75±0.09②④⑤29.96＜0.001

2.5 沙棘提取物對大鼠創面p38、MK2蛋白表達的影響與假手術組比較，模型組大鼠創面p38、MK2蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組和沙棘提取物各劑量組大鼠創面p38、MK2 蛋白表達顯著降低，且沙棘提取物各劑量組效應呈劑量依賴性（P＜0.05），見表4，圖2。

圖2 各組大鼠p38、MK2蛋白表達情況

表4 各組大鼠創面p38、MK2蛋白表達水平比較∕ ± s

表4 各組大鼠創面p38、MK2蛋白表達水平比較∕ ± s

注：MK2為絲裂原活化蛋白激酶2。①與假手術組比，P＜0.001。②與模型組比，P＜0.001。③與陽性對照組比，P＜0.001。④與沙棘提取物低劑量組比，P＜0.001。⑤與沙棘提取物中劑量組比，P＜0.001。

MK2蛋白表達0.63±0.07 0.92±0.10①0.33±0.04②0.80±0.09②③0.59±0.07②③④0.36±0.06②④⑤13.14＜0.001組別假手術組模型組陽性對照組沙棘提取物低劑量組沙棘提取物中劑量組沙棘提取物高劑量組F值P值鼠數10 10 10 10 10 10 p38蛋白表達0.61±0.07 0.89±0.08①0.29±0.03②0.75±0.09②③0.56±0.08②③④0.32±0.04②④⑤10.09＜0.001

3 討論

肛周膿腫是一種由大腸桿菌、葡萄球菌和鏈球菌等感染引起的肛門直腸科疾病［11］。手術治療是目前臨床上最常用的治療方式，大多數病人在術后即可痊愈，但由于肛周特殊的解剖結構和發病部位，術后傷口極易引發感染，減緩創面愈合［12］。創面組織毛細血管的生成和成纖維細胞產生是影響創面愈合的重要因素之一，同時機體內血清相關炎性因子的水平有效地反應了機體炎癥反應的情況，對于創面的愈合也具有一定的影響［13］。因此，有效抑制機體炎癥反應、促進創面組織毛細血管和成纖維細胞的生成對于肛周膿腫術后創面的愈合有重要影響。沙棘是一種廣泛存在于我國各地區的落葉小灌木，其果實和籽油已被多項研究證實具有較高的藥用價值［14］。在本研究中，我們模擬了肛周膿腫術后大鼠模型，同時采用沙棘提取物對其進行治療，通過對比各組大鼠創面部位的愈合情況，發現當對大鼠進行沙棘提取物治療后，可有效提高大鼠的創面愈合速度，且隨著沙棘提取物治療劑量的增加，大鼠創面的愈合率顯著增加。提示沙棘提取物可有效加速肛周膿腫術后大鼠創面的愈合，這可能與沙棘提取物的抗炎功效有關。

創面的愈合主要分為炎癥反應、組織修復與組織改建三個時期［15］。炎癥反應是創面愈合早期的主要影響因素，因此本研究檢測了各組大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-1β 和IL-6。TNF-α 是體內一種重要的促炎細胞因子，在多種生理反應中起著至關重要的作用，如炎癥介質的合成和釋放、中性粒細胞在肺部的積聚和補體激活［16］。IL-6 是活化T 細胞和成纖維細胞產生的關鍵細胞因子，可催化和放大炎癥反應，其表達水平可有效反映組織細胞損傷的嚴重程度，可作為急慢性炎癥臨床診斷的有效指標［17］。IL-1β 是一種重要的炎性因子，可誘導產生和釋放多種炎性因子［18］。本研究結果顯示，當大鼠發生肛周膿腫，其血清TNF-α、IL-1β 和IL-6 均顯著升高，在給予沙棘提取物治療后，血清TNF-α、IL-1β和IL-6 均顯著降低，同時結合各組大鼠病理結果，發現沙棘提取物各劑量組表皮細胞恢復良好，厚度增加，表明沙棘提取物可通過降低機體血清TNF-α、IL-1β 和IL-6 表達水平，減緩炎癥反應，同時促進毛細血管和成纖維細胞生成，從而達到加速創面愈合的功效。

既往有研究表明，p38∕MK2 信號通路在機體創面組織的修復過程中起到重要作用，當機體創傷發生時，p38∕MK2信號通路被激活，同時刺激機體血清TNF-α、IL-1β 和IL-6 表達增加，導致炎癥反應加劇［19］。本研究在進行沙棘提取物治療后，結果顯示p38、MK2 mRNA 和蛋白表達水平降低，提示沙棘提取物的治療抑制了p38∕MK2 信號通路，進而降低了機體炎癥反應，對肛周膿腫大鼠術后創面的愈合起到了促進作用。

綜上所述，本研究表明沙棘提取物可有效加速肛周膿腫大鼠術后創面的愈合，其機制可能是通過抑制機體p38∕MK2 信號通路，以及降低血清促炎因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 表達，從而逆轉機體的炎癥反應，達到加速愈合的效果。

（本文圖1見插圖1-1）