紫草素調控Hippo信號通路抑制鼻咽癌細胞株生物學功能及其機制研究

曹華琳，尹昕，梁天嵩

作者單位：1南陽市中心醫院耳鼻喉科，河南 南陽473000；2鄭州大學第一附屬醫院放療科，河南 鄭州450000

鼻咽癌（NPC）是一種罕見的頭頸癌，位于鼻咽部上皮層，居我國頭頸部惡性腫瘤發病率之首［1］，具有典型的地域性和種族分布性，多見于中國南部和東南亞地區［2］。目前，NPC 治療的主要策略為放射療法［3］，但易導致NPC 局部復發及遠處轉移，病人5年生存率也因此不足60%［4］，積極探索NPC 侵襲和轉移的分子機制并開發新型治療藥物，可能是提高病人生存率的有效手段。紫草素廣泛用于治療燒傷、麻疹、癰和黃斑疹［5］，據報道，其可通過多種途徑抑制NPC發展［6］。研究發現，Hippo通路有助于順鉑耐藥誘導的NPC 細胞上皮間質轉化（EMT）進而利于癌癥侵襲和遠處轉移［7］，但關于紫草素是否可通過Hippo 信號通路作用NPC 細胞的相關報道較少，故本研究于2021年1—12月以人鼻咽癌細胞（CNE2細胞）為研究載體并利用不同濃度紫草素加以作用，探討其抗CNE2效果及可能機制，以期為NPC 干預機制及治療藥物選擇提供一定的參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人鼻咽癌細胞株CNE2 購自上海中國科學院細胞庫。

1.1.2 試劑和儀器 紫草素（純度98%）（南京道斯夫生物科技有限公司，批號517-89-5）；Matrigel 基質膠（美國BD公司，批號356234）；AnnexinV-FITC∕PI流式細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技公司，批號KGA106）；胎牛血清（美國Gibco 公司，批號10270）；腫瘤抑制激酶1∕2抗體（LATS1∕2）（武漢艾美捷生物科技有限公司，批號ABP51705）；p-LATSA1∕2 抗體（bs-7913R）及波形蛋白（Vim）抗體（bs-8533R）購自北京博奧森生物科技有限公司；yes相關蛋白1（YAP1）抗體（批號ab52771）、p-YAP1抗體（批號ab76252）、具有PDZ 結合基序的轉錄共激活子（TAZ）抗體（批號ab176396）、N-鈣黏蛋白（N-cad）抗體（批號ab76011）、E-鈣黏蛋白（E-cad）抗體（批號ab227639）購自美國Abcam公司；p-TAZ抗體（批號sc-17610）購自細胞生物科技上海股份有限公司；550型全自動酶標儀購自美國Bio-Rad 公司；FluorChem HD2 化學發光凝膠成像系統購自美國ProteinSimple公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 RPMI 1640 完全培養液（含10%胎牛血清）復蘇CNE2 細胞，以1×105個∕毫升密度接種至25 cm2培養瓶中，于37 ℃、體積分數為5%二氧化碳及飽和濕度環境條件下的培養箱中培養，待細胞生長至80%左右時即進行傳代，傳代2～3次。

1.2.2 CCK8 法檢測紫草素對CNE2 細胞存活率的影響 收集對數期細胞，配制RPMI 1640 條件培養液（含0、2.0、4.0、8.0、16.0 mg∕L 紫草素），分別重懸細胞，并以5×103個∕毫升密度接種200 μL 細胞懸液于96 孔板中，相應濃度各設5 個復孔。培養箱內培養48 h，直接加入20 μL CCK8試劑于培養箱內培養2 h。全自動酶標儀測定450 nm 處的吸光度（OD）值，細胞存活率（%）=實驗組OD 值∕對照組OD 值×100%（實驗組指含有紫草素的實驗孔，對照組不含紫草素的對照孔），重復3次。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 收集對數期細胞，RPMI 1640 條件培養液培養48 h，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次，1 000 r∕min 離心5 min，收集細胞沉淀，70%乙醇-PBS溶液4 ℃固定過夜，PBS洗滌2～3 次，結合緩沖液重懸，5 μL Annexin V-FITC 溶液、5 μL PI溶液避光染色15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，重復3次。

1.2.4 平板克隆形成實驗檢測集落形成能力 收集對數期細胞，RPMI 條件培養液重懸，并以每孔100 個細胞的密度接種在6 孔板中，對應培養14 d，至肉眼可見的細胞克隆后終止培養，冷4%多聚甲醛固定，1%結晶紫染色，顯微鏡下觀察并利用ImageJ計算菌落（超過50個細胞）。

1.2.5 傷口愈合實驗檢測細胞遷移能力 收集對數期細胞，RPMI完全培養液重懸，以2×105個細胞接種于6孔板中。待培養至匯合，10 μL塑料移液槍頭作垂直細胞面劃痕，PBS 洗滌細胞3 次，拍照記錄劃痕；后利用RPMI 1640 條件培養液（不含胎牛血清）培養48 h，拍照記錄劃痕，ImageJ軟件測量劃痕寬度變化，計算劃痕愈合率即（0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度）∕0 h劃痕寬度×100%，重復3次。

1.2.6 Transwell檢測細胞侵襲能力 Matrigel基質膠涂布上腔室，4 ℃下干燥，RPMI 1640條件培養液（不含胎牛血清）重懸的細胞以每孔1×105個接種200 μL至Transwell 24孔板上室，下室加入500 μL含10%胎牛血清的對應條件培養液，48 h后棄去培養液，甲醇固定15 min，0.1%結晶紫染色15 min，擦除過濾器上層細胞，鏡下觀察底部細胞并計數，重復3次。

1.2.7 RT-qPCR 技術檢測YAP1、TAZ mRNA 相對表達水平 收集對數期細胞，RPMI 1640 條件培養液培養48 h，Trizol試劑提取紫草素各濃度下細胞總RNA，檢測其濃度及純度可用后逆轉錄為cDNA。制備RT-PCR反應體系，反應條件為95 ℃ 30 s，95 ℃5 s，60 ℃ 34 s 40 個循環。以β-actin 為內參，2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。Primer Premier 5.0 軟件設計引物，送至華大基因合成。引物序列：YAP1正向5"-ACCCACAGCTCAGCATCTT C-3"，反向引物5"-GCTGTGACGTTCATCTGGGA-3"；TAZ 正 向 5"-ACCCGC GAGTACAACCTTCTT-3"，反向5"-TATCGTCATCCATGGCGAACT-3"；β-actin 正向5"-CCCACACTGTGCCCATCTAC-3"，反 向5"-GGAACCGCTCATT GCCAATG-3"。

1.2.8 蛋白質印跡法技術檢測相關蛋白相對表達情況 收集對數期細胞，RPMI 1640 條件培養液培養48 h，收集細胞沉淀，RIPA 裂解液提取細胞總蛋白并測定蛋白濃度，取約50 μg 總蛋白上樣，10%SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗（均1∶1 000 稀釋）4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3 次，每次10 min，二抗（1∶8 000 稀釋）室溫孵育1 h，洗膜，HRP-ECL 法顯影，化學發光凝膠成像系統曝光，Image J 分析條帶灰度值，以目的蛋白與內參β-actin 灰度值比值表示蛋白相對表達量。

1.3 統計學方法SPSS 26.0 軟件進行數據統計學處理，多組計量資料比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗，計量結果均以±s表示。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 紫草素對CNE2 細胞增殖、集落形成能力及CNE2 細胞凋亡的影響CNE2 細胞存活率隨紫草素濃度增大而降低（P＜0.05），集落形成數隨紫草素作用濃度增大而減少（P＜0.05）。CNE2 細胞凋亡率隨紫草素濃度增大而升高（P＜0.05）。見表1，圖1。

圖1 流式細胞儀檢測紫草素各濃度下CNE2細胞凋亡情況

表1 不同濃度紫草素培養下CNE2細胞存活率比較∕ ± s

表1 不同濃度紫草素培養下CNE2細胞存活率比較∕ ± s

注：①與0 mg∕L紫草素比較，P＜0.05。②與2.0 mg∕L紫草素比較，P＜0.05。③與4.0 mg∕L紫草素比較，P＜0.05。④與8.0 mg∕L紫草素比較，P＜0.05。

紫草素濃度0 mg∕L 2.0 mg∕L 4.0 mg∕L 8.0 mg∕L 16.0 mg∕L F值P值集落形成數∕個514.67±25.81 452.33±22.72①308.33±22.12①②173.67±13.65①②③85.33±13.05①②③④242.50＜0.001重復次數3 3 3 3 3細胞存活率∕%100.00 92.70±5.92①81.75±3.83①②54.93±3.89①②③33.89±2.14①②③④274.49＜0.001細胞凋亡率∕%0.97±0.29 7.97±1.14①19.91±3.21①②42.67±5.27①②③62.31±5.50①②③④138.90＜0.001

2.2 紫草素對CNE2 細胞遷移能力的影響CNE2細胞劃痕愈合率隨紫草素作用濃度增大而降低（P＜0.05）。見圖2，表2。

圖2 各濃度紫草素培養下CNE2細胞遷移情況

表2 不同濃度紫草素培養下CNE2侵襲細胞數比較∕ ± s

表2 不同濃度紫草素培養下CNE2侵襲細胞數比較∕ ± s

注：①與0 mg∕L 紫草素比較，P＜0.05。②與2.0 mg∕L 紫草素比較，P＜0.05。③與4.0 mg∕L 紫草素比較，P＜0.05。④與8.0 mg∕L 紫草素比較，P＜0.05。

劃痕愈合率∕%88.58±3.40 69.91±3.03①53.61±3.21①②30.32±1.68①②③18.31±1.42①②③④341.35＜0.001紫草素濃度0 mg∕L 2.0 mg∕L 4.0 mg∕L 8.0 mg∕L 16.0 mg∕L F值P值重復次數3 3 3 3 3侵襲細胞數∕個233.67±15.01 195.33±18.15①153.33±10.02①②92.67±6.66①②③52.33±6.03①②③④111.05＜0.001

2.3 紫草素對CNE2 細胞侵襲能力的影響CNE2侵襲細胞數隨紫草素作用濃度增大而減少（P＜0.05）。見表2。

2.4 紫草素對CNE2 細胞YAP1、TAZ mRNA 表達的影響CNE2細胞YAP1、TAZ mRNA相對表達水平均隨紫草素作用濃度增大而降低（P＜0.05）。見表3。

表3 不同濃度紫草素培養下CNE2細胞YAP1、TAZ mRNA相對表達水平比較∕ ± s

表3 不同濃度紫草素培養下CNE2細胞YAP1、TAZ mRNA相對表達水平比較∕ ± s

注：YAP1為yes相關蛋白1，TAZ 為具有PDZ 結合基序的轉錄共激活子。①與0 mg∕L紫草素比較，P＜0.05。②與2.0 mg∕L紫草素比較，P＜0.05。③與4.0 mg∕L 紫草素比較，P＜0.05。④與8.0 mg∕L 紫草素比較，P＜0.05。

TAZ 1.00±0.01 0.91±0.05①0.76±0.04①②0.54±0.04①②③0.30±0.02①②③④325.89＜0.001紫草素濃度0 mg∕L 2.0 mg∕L 4.0 mg∕L 8.0 mg∕L 16.0 mg∕L F值P值重復次數3 3 3 3 3 YAP1 1.01±0.02 0.93±0.02①0.81±0.03①②0.65±0.03①②③0.41±0.02①②③④285.60＜0.001

2.5 紫草素對Hippo 信號通路相關蛋白表達的影響YAP1、TAZ、N-cad 及Vim 蛋白相對表達水平隨紫草素作用濃度增大而降低；p-YAP1、p-TAZ 及Ecad 蛋白相對表達水平隨紫草素作用濃度增大而升高。見圖3，表4。

圖3 蛋白質印跡法檢測紫草素培養下CNE2細胞相關蛋白條帶圖

表4 不同濃度紫草素培養下CNE2細胞YAP1等蛋白相對表達水平比較∕ ± s

表4 不同濃度紫草素培養下CNE2細胞YAP1等蛋白相對表達水平比較∕ ± s

注：YAP1為yes相關蛋白1，p-YAP1為磷酸化yes相關蛋白1，TAZ為具有PDZ結合基序的轉錄共激活子，p-TAZ為磷酸化具有PDZ結合基序的轉錄共激活子，N-cad為N-鈣黏蛋白，Vim為波形蛋白，E-cad為E-鈣黏蛋白。①與0 mg∕L紫草素比較，P＜0.05。②與2.0 mg∕L紫草素比較，P＜0.05。③與4.0 mg∕L紫草素比較，P＜0.05。④與8.0 mg∕L紫草素比較，P＜0.05。

E-cad 0.15±0.02 0.28±0.02①0.36±0.02①②0.56±0.03①②③0.71±0.03①②③④249.35＜0.001紫草素濃度0 mg∕L 2.0 mg∕L 4.0 mg∕L 8.0 mg∕L 16.0 mg∕L F值P值重復次數3 3 3 3 3 YAP1 0.68±0.04 0.56±0.03①0.45±0.03①②0.31±0.03①②③0.18±0.02①②③④124.88＜0.001 p-YAP1 0.16±0.02 0.22±0.02①0.29±0.02①②0.36±0.02①②③0.48±0.03①②③④93.12＜0.001 TAZ 0.51±0.03 0.44±0.02①0.30±0.03①②0.24±0.02①②③0.16±0.02①②③④103.00＜0.001 p-TAZ 0.17±0.02 0.23±0.02①0.28±0.03①②0.44±0.03①②③0.52±0.03①②③④92.44＜0.001 N-cad 0.64±0.03 0.53±0.03①0.38±0.02①②0.32±0.02①②③0.23±0.01①②③④150.28＜0.001 Vim 0.50±0.02 0.46±0.01①0.34±0.02①②0.19±0.02①②③0.09±0.01①②③④327.11＜0.001

3 討論

紫草素是一種萘醌色素，為紫草主要生物活性成分之一，對多種類型腫瘤具有抗癌作用［8］。研究發現，其可以時間和劑量依賴性方式顯著抑制結直腸癌細胞的活性并促進其凋亡［9］，并可通過調節細胞增殖、凋亡、遷移及有氧糖酵解途徑發揮抗NPC 作用［6，10］。鼻咽部位隱匿，多數病人在確診時已出現頸淋巴結轉移，預后較差，抗凋亡特性及腫瘤細胞向周圍組織和遠處器官的侵襲與轉移是惡性腫瘤的重要特征［11-12］，本研究發現，紫草素可顯著抑制CNE2細胞的增殖活性、集落形成、遷移及侵襲能力，并可誘導其凋亡，且呈劑量依賴性，提示紫草素可以劑量依賴性方式抑制CNE2 癌細胞的惡性發展，可能是改善NPC復發及轉移等不良預后的潛在藥物。

EMT 已被證明是介導NPC 轉移的關鍵因素，此過程中上皮性腫瘤細胞轉化為間充質表型，細胞形態改變、上皮細胞極性喪失、細胞間黏附中斷、遷移和侵襲能力增強［13］。E-cad 是上皮細胞中的特征性分子標志，位于黏附連接處和基底外側質膜上，Vim 和N-cad 則主要在間充質來源的細胞中表達，與腫瘤細胞侵襲密切相關［14］，抑制NPC 細胞中EMT 可降 低Vim 和N-cad 表達，上調E-cad 水 平并來抑制NPC 細胞侵襲、轉移［15-16］。Mo 等［17］研究發現，紫草素可逆轉EMT，抑制膀胱癌細胞的遷移和侵襲；Li、Zeng［18］研究結果顯示，紫草素可下調EMT標志蛋白N-cad、Vim 水平，上調E-cadherin 蛋白表達，抑制肝細胞癌的惡性生物學行為，包括增殖、抗凋亡、遷移及侵襲。本研究經不同濃度紫草素作用后發現，CNE2 細胞中N-cad 及Vim 蛋白相對表達水平降低，E-cad 蛋白相對表達水平升高，且呈劑量依賴性，提示紫草素可能通過減少上皮細胞向間質細胞形態轉化，促進細胞極性及細胞間黏附能力恢復，抑制EMT 進展，進而抑制CNE2 細胞遷移及侵襲。

Hippo 通路控制組織穩態，包括器官大小、細胞增殖和凋亡，YAP 和TAZ 是該通路中的關鍵蛋白，在許多腫瘤中過度表達［19］。研究發現，癌細胞中增加的YAP 及TAZ 可破壞細胞間連接，促進間充質基因表達，并增強EMT 相關的形態變化［20］，Hippo∕YAP∕TAZ 信號通路可通過調節EMT 促進腫瘤的轉移及侵襲［21］。在沒有活性激酶級聯反應的情況下，YAP1 和TAZ 蛋白以其未磷酸化的形式轉移到細胞核中并充當轉錄輔助因子，并結合TEA 結構域轉錄因子家族的成員并促進促增殖和抗凋亡基因的轉錄［22］；Hippo 激酶存在時，YAP1 和TAZ 被上游信號磷酸化，p-YAP 和p-TAZ 在細胞質中積累并被定向降解［23］。據報道，紫草素可依賴于Hippo 通路的活性，調節癌細胞葡萄糖代謝，發揮腫瘤抑制作用［24］，但關于紫草素介導Hippo信號通路調節EMT過程而發揮抗NPC 作用的相關研究較少。本研究經分子實驗分析紫草素可能通過減少YAP1 及TAZ 的核轉移，降低與TEA 結構域轉錄因子家族的成員結合，促進兩者在細胞質內的積累并通過定向降解，抑制癌細胞惡性生物學相關基因轉錄，進而發揮抗EMT及抗增殖作用。

綜上所述，紫草素可抑制鼻咽癌細胞株CNE2惡性生物學功能，其作用機制可能與抑制Hippo 信號通路中核心下游信號因子YAP1、TAZ蛋白表達并抑制EMT進展有關。