電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定鹽酸溴己新葡萄糖注射液中29種元素雜質(zhì)含量

趙馮，張杞柳，陳輝，張磊

作者單位：徐州市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江蘇 徐州221000

鹽酸溴己新葡萄糖注射液有效成分鹽酸溴己新為鴨嘴花堿的衍生物，是臨床上常用的大容量靜脈注射劑。其具有多重祛痰機(jī)制，臨床主要用于急慢性支氣管炎、肺炎、慢性阻塞性肺疾病及其他呼吸道疾病如哮喘、支氣管擴(kuò)的治療［1-4］。近年來(lái)，新冠疫情在全球范圍內(nèi)暴發(fā)，有研究表明溴己新可以通過(guò)與肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞表達(dá)的絲氨酸蛋白酶（TMPRSS2）相結(jié)合抑制病毒進(jìn)入TMPRSS2 表達(dá)的細(xì)胞，阻斷新冠病毒入侵機(jī)體［5］；通過(guò)增加溶酶體活性來(lái)降低痰液黏度以降低新冠病毒感染者肺部產(chǎn)生致命性黏液的可能性［6］；通過(guò)與螺內(nèi)酯等藥物聯(lián)用降低病毒載量防止感染進(jìn)展［7］；其多重治療機(jī)制能有效阻止病情惡化，在重癥新冠肺炎治療中具有巨大的臨床應(yīng)用潛力［8］。

我國(guó)大容量注射劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有害元素雜質(zhì)的檢查多為重金屬檢查法［9］，是利用金屬雜質(zhì)與硫代乙酰胺或硫化鈉反應(yīng)顯色，與標(biāo)準(zhǔn)鉛在相同條件下的反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行比較。該方法準(zhǔn)確度低，對(duì)反應(yīng)元素做籠統(tǒng)處理，無(wú)法量值化，局限性很大，已被美國(guó)藥典和歐洲藥典棄用。本制劑的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中重金屬檢查項(xiàng)也是采用此法［10］。

目前測(cè)定元素含量的方法有原子熒光分光光譜法，原子吸收分光光譜法、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法［11］、電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）等。其中ICP-MS法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，可多元素同時(shí)在線分析，為美國(guó)藥典的推薦元素分析方法之一。本研究自2022年9—10月建立了ICP-MS方法，參考ICH Q3D［國(guó)際藥典委員會(huì)（ICH）發(fā)布的《Guideline for elemental impurities Q3D》］［12］標(biāo)準(zhǔn)對(duì)鹽溴己新葡萄糖注射液酸中鉛、鎘、汞、砷、硼、鋁等29種元素雜質(zhì)進(jìn)行分析。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent 7900 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（Agilent公司）。

1.2 試藥硝酸（國(guó)藥沃凱，批號(hào)20211215）；鹽酸（西隴科學(xué)，批號(hào)2101291）；異丙醇（Merck，批號(hào)K53060340107）；水為超純水。注射藥物元素混標(biāo)class1&2A（Inorganic Ventures，批號(hào)S2-MEB709074，含砷15 mg∕L，鎘2 mg∕L，鈷5 mg∕L，鉛5 mg∕L，汞3 mg∕L，鎳20 mg∕L，釩10 mg∕L），注射 藥 物 元 素混 標(biāo)class2B（Inorganic Ventures，批號(hào)S2-MEB709076，含金100 mg∕L，銥10 mg∕L、鋨10 mg∕L、鈀10 mg∕L、鉑10 mg∕L、銠10 mg∕L、釕10 mg∕L、硒80 mg∕L、銀10 mg∕L、鉈8 mg∕L），注射藥物混標(biāo)class3（Inorganic Ventures，批號(hào)S2-MEB709070，含銻9 mg∕L、鋇70 mg∕L、鉻110 mg∕L、銅30 mg∕L、鋰25 mg∕L、鉬150 mg∕L、錫60 mg∕L），金 單 元 素 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液（Aglient，批 號(hào)0111978523，1 000 mg∕L），多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心，批號(hào)22D20042，含鈦、鎂、鋁、硼、錳100 mg∕L），質(zhì)譜調(diào)諧液（Aglient，批號(hào)38-45GSX2 含鈰、鈷、鋰、鎂、鉈、釔1 μg∕L），內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液［Aglient，批號(hào)0011332062，含鈧、釔、鋰（6Li）、銦、鋱、鉍均為100 mg∕L］，鹽酸溴己新葡萄糖注射液搜集自同一企業(yè)（鹽酸溴己新4 mg 與葡萄糖5 g，批號(hào)B21121402、B21121003、B22020203、B22081001），最大日劑量為300 mL。

2 方法

2.1 質(zhì)譜參數(shù)RF Power 1 550 W，Plasma Gas 15.0 L∕min，Nebulizer Gas 1.05 L∕min，Makeup Gas 0 L∕min，Auxiliary Gas 0.90 L∕min，采集深度8 mm，檢測(cè)模式為KED 模式，全定量分析，碰撞氣（He）流量5.0 L∕min，S∕C Temp 2.0 ℃，鎳采樣錐。

2.2 溶液的制備

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的制備 配制硝酸和鹽酸各2%混合溶液為稀釋液。取注射藥物元素混標(biāo)class1&2A Ⅰ100 μL，注 射 藥 物 元 素 混 標(biāo)class2B 100 μL，金單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，注射藥物混標(biāo)class3 1.00 mL，多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，用稀釋液稀釋并定容至30.00 mL，作為多元素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0、0.30、0.50、1.00、1.50、2.00 mL，用稀釋液稀釋定容至10.00 mL，制備成限度J 0～2 倍范圍線性溶液。J 值由元素限度、日最大劑量和樣品溶液稀釋倍數(shù)計(jì)算獲得。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 取內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液0.5 mL，用稀釋液稀釋并定容至50.00 mL，其中加入異丙醇2.5 mL，作為對(duì)樣品的基質(zhì)匹配。

2.2.3 樣品溶液的制備 精密量取鹽酸溴己新葡萄糖注射液1 mL，用稀釋液稀釋至10.00 mL。

2.3 測(cè)定方法和內(nèi)標(biāo)元素的選擇依次測(cè)定背景水溶液，標(biāo)曲空白溶液，標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液和樣品溶液，在線引入內(nèi)標(biāo)液。標(biāo)曲橫坐標(biāo)為濃度，縱坐標(biāo)為響應(yīng)值和內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值的比值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算樣品含量。內(nèi)標(biāo)元素的選擇按照質(zhì)量數(shù)和電離能相近的原則，待測(cè)元素采集質(zhì)量數(shù)和內(nèi)標(biāo)元素見(jiàn)表1。

表1 各元素采集質(zhì)量數(shù)與內(nèi)標(biāo)元素

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性 取標(biāo)準(zhǔn)系列混合溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，得到各元素線性方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)，見(jiàn)表2，結(jié)果表明本方法各元素線性良好。

表2 元素雜質(zhì)回歸方程、線性范圍、PDE值（ICH）、J值

2.4.2 檢測(cè)限與定量限 取空白溶液（稀釋劑）連續(xù)測(cè)定11 次，計(jì)算11 次空白溶液縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）。按照3SD∕斜率和10SD∕斜率計(jì)算檢出限和定量限。見(jiàn)表3，各元素檢測(cè)限均低于標(biāo)準(zhǔn)曲線低點(diǎn)10倍以下，表明方法靈敏度良好，能夠滿足檢測(cè)需要。

表3 元素雜質(zhì)檢測(cè)限和定量限結(jié)果（n=11）

2.4.3 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 取注射液樣品（批號(hào)為B21121402）1.0 mL，用稀釋液稀釋至10.00 mL 作為空白，另取樣品1.0 mL 9 份，置10 mL 量瓶中，分別加入元素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.5、1.0、1.5 mL，各3 份，用稀釋液稀釋至刻度，作為低、中、高濃度加標(biāo)供試溶液。按“2.1”項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，要求加樣回收率在70%～150%［13］。結(jié)果見(jiàn)表4，表明本方法回收率良好。

表4 回收率、中間精密度和穩(wěn)定性結(jié)果

2.4.4 重復(fù)性與中間精密度 按“2.4.3”項(xiàng)下的中濃度的加標(biāo)供試溶液的配制方法平行配制6 份，進(jìn)樣分析，計(jì)算6次測(cè)定結(jié)果的RSD，作為重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，要求RSD 不超過(guò)20%［13］。由不同人員在不同時(shí)間同法配制6份中濃度加標(biāo)供試溶液，依法測(cè)定，計(jì)算12 份數(shù)據(jù)的RSD，作為中間精密度結(jié)果，要求RSD 不超過(guò)25%［13］。見(jiàn)表4，結(jié)果表明本方法重復(fù)性和精密度良好。

2.4.5 穩(wěn)定性考察 取重復(fù)性項(xiàng)下的供試溶液，放置24 h 后測(cè)定，與臨用新制比較，考察各元素測(cè)定結(jié)果的穩(wěn)定性，見(jiàn)表4，結(jié)果表明本方法配制的溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3 結(jié)果

取同一家企業(yè)4個(gè)批次鹽酸溴己新葡萄糖注射液各2份，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法配制樣品溶液，采用上述方法進(jìn)樣分析，計(jì)算樣品中各元素雜質(zhì)含量，見(jiàn)表5。

表5 樣品中元素雜質(zhì)含量和限度

4 討論

4.1 元素選擇國(guó)際人用藥物注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)的元素雜質(zhì)指導(dǎo)原則（ICHQ3D）中給出PDE 值的元素共24 個(gè)?？紤]到本制劑在生產(chǎn)工藝第一步還原反應(yīng)的反應(yīng)物為3，5-二溴-2-氨基苯甲醛和硼氫化鉀，可能殘留硼元素雜質(zhì)［14］。另外，注射液密封件鹵化丁基膠塞中可能帶來(lái)鎂、鋁、錳、鈦等金屬元素離子。故本研究結(jié)合生產(chǎn)工藝和國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)，采用ICP-MS 法對(duì)上述29 種元素含量進(jìn)行考察。

4.2 降低高有機(jī)物含量樣品的基質(zhì)干擾

4.2.1 前處理方法 本品為澄清溶液，含5%有機(jī)成分，直接進(jìn)樣時(shí)含量較高的有機(jī)物成分會(huì)通過(guò)影響霧化效應(yīng)和等離子體能量而加強(qiáng)高電離能元素的信號(hào)，造成嚴(yán)重的基體效應(yīng)，使內(nèi)標(biāo)回收率超出儀器范圍，并且會(huì)在錐孔處產(chǎn)生積碳。本研究采用直接稀釋法，但是過(guò)大的稀釋倍數(shù)可能造成樣品中的元素雜質(zhì)不能被檢測(cè)出。考察不同稀釋倍數(shù)樣品的基質(zhì)效應(yīng)后，確定將樣品溶液進(jìn)行10倍稀釋，可以很好地保證各內(nèi)標(biāo)元素回收率波動(dòng)范圍為80%～120%。

Q3D中2B類元素較不穩(wěn)定，用含2%硝酸與2%鹽酸的混合酸溶液作為稀釋劑，可以提高這些元素的24 h穩(wěn)定性。

4.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的選擇 ICP-MS 分析法的基質(zhì)效應(yīng)較強(qiáng)，是建立分析方法時(shí)最需要解決的問(wèn)題。因?yàn)楸緲悠啡芤河袡C(jī)物含量較高，基體和標(biāo)準(zhǔn)溶液不完全一致，容易受到霧化、氣溶膠傳輸?shù)任锢硇愿蓴_和等離子體電離效應(yīng)、空間電荷效應(yīng)等基體性干擾［15-16］，不適合不用內(nèi)標(biāo)的分析方法。本方法采用T型三通在線加入內(nèi)標(biāo)溶液，可以較好地校正儀器響應(yīng)信號(hào)的漂移，并且對(duì)內(nèi)標(biāo)回收率進(jìn)行監(jiān)控，使測(cè)定更為準(zhǔn)確。本方法選擇較高的內(nèi)標(biāo)液濃度（1 mg∕L），同時(shí)在內(nèi)標(biāo)溶液中加入一定濃度異丙醇進(jìn)行基質(zhì)匹配，使各內(nèi)標(biāo)元素的內(nèi)標(biāo)回收率穩(wěn)定在80%～120%。

4.3 結(jié)果分析本制劑原料藥鹽酸溴己新生產(chǎn)工藝的第一步為還原反應(yīng)，3，5-二溴-2-氨基苯甲醛和硼氫化鉀為反應(yīng)物，在無(wú)水乙醇溶劑中反應(yīng)生成中間體3，5-二溴-2-氨基苯甲醇。硼元素為本制劑中可能存在的殘留元素，4 批樣品的硼殘留量為4.758、5.845 、5.719、6.675 μg∕L。

鋁是地球上儲(chǔ)量最豐富的元素之一，研究顯示，攝入過(guò)多鋁元素會(huì)在組織中蓄積并引起毒性反應(yīng)，對(duì)人體健康造成危害［17-18］。特別是經(jīng)高風(fēng)險(xiǎn)的注射途徑進(jìn)入人體，可造成健康危害的允許攝入量更低。目前我國(guó)藥典2020年版四部中注射劑通則和該制劑現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)［10］對(duì)鋁元素的限度并未進(jìn)行控制，美國(guó)FDA 21CFR201.323 文件規(guī)定在全靜脈營(yíng)養(yǎng)液中，鋁的含量應(yīng)≤25 μg∕L［19］。參考FDA 的限度進(jìn)行判斷，4 個(gè)批號(hào)的樣品中，有一批鋁離子含量超出限度，另外三批結(jié)果均超過(guò)限度值的30%，存在鋁元素含量偏高的問(wèn)題，有一定風(fēng)險(xiǎn)性。因此，建立該制劑鋁元素的含量測(cè)定方法來(lái)進(jìn)行質(zhì)控非常必要。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中看出，4 批樣品中ICHQ3D 給出PDE 值的24 種元素含量，均符合ICH 的要求，并低于限度的30%，風(fēng)險(xiǎn)較低。硼、鎂、錳、鈦離子，這些元素由于毒性相對(duì)較低或區(qū)域監(jiān)管的差異，未被確定PDE值，但4批樣品中均檢測(cè)到一定濃度的殘留，對(duì)其風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控也是十分必要的。

當(dāng)前，新型冠狀病毒感染疫情肆虐蔓延，鹽酸溴己新葡萄糖注射液作為緩解新型冠狀病毒感染的輔助藥物，在治療的同時(shí)，首先應(yīng)當(dāng)保證藥物本身的安全性。本研究建立了ICP-MS 直接測(cè)定鹽酸溴己新葡萄糖注射液中29 種元素雜質(zhì)含量的方法并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，對(duì)同一廠家共4 批樣品進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明方法靈敏度高，準(zhǔn)確性好，有利于企業(yè)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估和控制，提高產(chǎn)品質(zhì)量，可為鹽酸溴己新葡萄糖注射液及其他大容量注射劑的質(zhì)量控制提供參考。