不同生長年限與采收期對懷牛膝化學成分與質量的影響

高巖

作者單位：盤錦檢驗檢測中心，遼寧 盤錦124010

牛膝主要藥用部位為干燥根，分布于河北、河南、山西等地區，產于河南的（懷牛膝）藥用價值上乘，具有補肝腎、強筋骨、活血通絡等功效［1-2］。現代藥理研究表明，牛膝含有植物甾酮、多糖、皂苷等多種成分，具有免疫調節、抗腫瘤、抗炎、鎮痛等多種功效［3-4］。合理的采收期不僅能保證藥材產量、時間成本，還能穩定藥材質量［5］。關于懷牛膝采收時期中不同生長年限與采收期對中藥牛膝化學成分影響的文獻研究報道較少，而采收時期中生長年限的不統一可影響道地藥材的臨床使用和資源開發。因此，本研究以河南省武陟縣牛膝種植基地作為依托，測定生長年限2、3、4、5、6年以及采集月份9、10、11、12 月中旬的懷牛膝樣品中β-蛻皮甾酮、25R∕S-牛膝甾酮、齊墩果酸的含量，以期獲得懷牛膝適宜采收期，為懷牛膝的栽培及生產提供參考。

1 儀器與材料

高效液相色譜儀、DAD 檢測器購自于Waters 公司；萬分之一天平（北京斯多利斯科學儀器有限公司，型號BSA124S-CW）；Milli-QAcademicA10超純水機（美國Millipore）；25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮購自于四川成都思克生物；齊墩果酸購、β-蛻皮甾酮購自于成都艾博克生物科技有限公司。乙腈、甲醇來源于德國默克公司；正丁醇、三氯甲烷、磷酸來源于北京化工廠有限責任公司。

研究時間為2015 年4 月至2021 年12 月，牛膝樣品來源于河南省武陟縣牛膝種植基地，生長年限2、3、4、5、6年，采集月份分別為9、10、11、12月，均為每月中旬；每個采收日期收集3 個樣品，共60 份樣品，所有樣品經河南中醫藥大學藥學院鑒定為莧科植物牛膝干燥根。

2 方法

2.1 有機化學成分含量測定有機化學成分包括β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、齊墩果酸。

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱定齊墩果酸4.25 mg，β-蛻皮甾酮4.64 mg，25R-牛膝甾酮3.85 mg，25S-牛膝甾酮4.88 mg，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，輕輕搖勻至完全溶解，對照品溶液對應濃度為0.425、0.464、0.385、0.488 g∕L。

甾酮類混合對照品溶液配制：分別精密量取2 mL β-蛻皮甾酮（0.464 g∕L）、25R-牛膝甾酮（0.385 g∕L）、25S-牛膝甾酮（0.488 g∕L）對照品溶液，置于10 mL容量瓶中，混勻即可。

2.1.2 供試品溶液的制備 甾酮類供試品溶液的制備：取牛膝粉末（過三號篩）2 g，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶中，加入50 mL水飽和正丁醇，浸泡過夜。超聲處理30 min，冷卻，補足重量，過濾。精密量取25 mL 濾液，蒸干，殘渣加甲醇溶解并定容至5 mL即可。

齊墩果酸供試品溶液的制備：取牛膝粉末（過三號篩）1 g，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶中，加入25 mL鹽酸溶液（2 mol∕L），浸泡過夜。100 ℃水浴回流提取3 h，冷卻，補足重量，過濾，濾渣用蒸餾水沖洗3 次，將濾渣放入60 ℃烘箱內烘干，轉移至錐形瓶中。精密加入25 mL 三氯甲烷，加熱回流提30 min（提取兩次），濾過，合并濾液，蒸干，甲醇溶解殘渣并定容至25 mL即可。

2.1.3 色譜條件 色譜柱：Waters XB Ridge C18（4.6×250 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；進樣量10 μL。齊墩果酸：流動相：乙腈-水-冰乙酸（90∶10∶0.1）；流速：1mL∕min；檢測波長為205 nm。甾酮：流動相：乙腈-水-甲酸（15∶85∶0.1）；流速：1 mL∕min；檢測波長為250 nm。對照品、混合對照品及樣品溶液見圖1。

圖1 HPLC圖譜：齊墩果酸對照品（A）、齊墩果酸樣品（B）、甾酮類對照品（C）、甾酮類樣品（D）

2.1.4 方法學考察 以對照品質量濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y），采用線性回歸繪制標準曲線，回歸方程及相關系數（r）見表1，4 種成分的線性關系良好，相關系數r值＞0.999。精密吸取“2.1.2”項下的供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣6 次，β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、齊墩果酸峰面積相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別為0.25%、0.22%、0.26%、0.20%，表明本試驗儀器精密度良好。按“2.1.3”項平行制備6 份供試品溶液，按“2.1.3”項條件進行測樣，β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、齊墩果酸的平均質量分數RSD 分別為2.04%、2.12%、2.42%、1.84%，表明該方法重復性良好。精密吸取“2.1.2”項下的供試品溶液，放置2、4、8、12 h，進樣分析，β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、齊墩果酸峰面積RSD 分別為2.14%、1.88%、2.26%、1.68%，表明供試品溶液在制備后12 h 內穩定性良好。取同一批次已知含量的粉末約0.5 g，平行6份，分別加入定量對照品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下條件進行測驗，計算β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、齊墩果酸的平均回收率在98%～104%范圍內，RSD 均低于2.00%，表明加樣回收率良好，見表2。

表1 4種成分的線性方程及范圍

表2 牛膝藥材中4種成分加樣回收率結果（n=6）

2.2 統計學方法所有數據采用SPSS 22.0 統計軟件進行分析，計量資料的采用±s表示，多組間的比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，采用重復測量設計方差分析進行不同時間點的組間比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 樣品測定同一生長年限中，4種化學成分（β-蛻皮甾酮、25R∕S-牛膝甾酮、齊墩果酸）在不同月份采收的含量存在差異，其中10、11月含量相對較高，而9、12 月含量相對偏低。同一采收月份中，齊墩果酸、β-蛻皮甾酮生長4 年的含量高于其他年份（P＜0.05）；25S-牛膝甾酮生長3 年的含量高于其他年份（P＜0.05），而25R-牛膝甾酮生長5 年含量高于其他年份（P＜0.05）。結果見表3。

表3 不同生長年限、采收時間牛膝樣品中β-蛻皮甾酮、25R∕S-牛膝甾酮、齊墩果酸的含量（n=3）∕（‰， ± s）

表3 不同生長年限、采收時間牛膝樣品中β-蛻皮甾酮、25R∕S-牛膝甾酮、齊墩果酸的含量（n=3）∕（‰， ± s）

生長年限2年2年2年2年3年3年3年3年4年4年4年4年5年5年5年5年6年6年6年6年采收時間9月10月11月12月9月10月11月12月9月10月11月12月9月10月11月12月9月10月11月12月β-蛻皮甾酮齊墩果酸1.133±0.158 1.235±0.135 1.224±0.148 1.065±0.163 1.235±0.127 1.327±0.208 1.384±0.194 1.225±0.206 1.431±0.162 1.524±0.205 1.571±0.174 1.375±0.215 1.302±0.185 1.446±0.197 1.454±0.202 1.232±0.174 1.337±0.298 1.322±0.278 1.393±0.195 1.227±0.168 25R-牛膝甾酮0.234±0.018 0.225±0.022 0.235±0.026 0.218±0.019 0.215±0.024 0.234±0.024 0.241±0.016 0.220±0.021 0.221±0.024 0.235±0.018 0.242±0.029 0.226±0.019 0.236±0.023 0.249±0.022 0.243±0.025 0.228±0.018 0.214±0.025 0.245±0.022 0.236±0.023 0.222±0.025 25S-牛膝甾酮0.344±0.038 0.352±0.043 0.359±0.035 0.338±0.039 0.346±0.033 0.364±0.038 0.351±0.030 0.342±0.031 0.351±0.038 0.356±0.033 0.342±0.034 0.346±0.031 0.346±0.034 0.359±0.045 0.343±0.035 0.338±0.028 0.334±0.036 0.345±0.033 0.346±0.035 0.342±0.031 17.32±1.70 16.58±1.88 16.47±1.87 14.23±1.54 17.93±1.88 17.35±2.01 16.94±2.09 16.56±1.82 18.33±2.13 20.25±2.29 19.97±2.36 16.23±2.06 18.03±1.95 19.32±2.16 18.54±2.18 15.36±1.85 15.33±2.00 16.25±1.97 14.97±2.09 13.23±1.84

3.2 主成分分析采用SPSS 20.0 對牛膝樣品中的4 個有機化學成分進行主成分分析，綜合評價函數為F=0.472F1+0.254F2+0.142F3+0.088F4，其中F 值越大則綜合品質越好，F1～F4為各因子得分，總得分排序見表4。牛膝在生長年限為4 年，并于11 月份采收的樣品F 值最高，其次為生長年限為4 年，10 月份采收，生長年限為3 年、5 年，10、11 月份采收的質量接近。

表4 不同生長年限、采收期的牛膝主成分因子及綜合分析得分

4 討論

不同類型的中藥材均有特定采收時期，如根莖類多在初春、秋冬季節采收，花類一般在含苞待放時期采收，而葉類、全草類則在生長旺盛時期采收［6-7］。2015年版《中國藥典》規定，如全草類的魚腥草可全年采收，莖木類的大血藤為秋、冬季采收，花類的金銀花為夏初花開放前采收。盡管藥典已對各類中藥材的采收季節作出規定，但生長年限、采收月份尚未作出明確要求，而生長年限、采收月份均可能影響植物藥材中活性成分含量，從而影響藥材藥用價值，因此此次研究通過探索生長年限、采收月份對于懷牛膝活性成分的影響，以期為優化其的采收時期提供理論依據。

懷牛膝是我國知名的傳統中藥材，具有祛風濕、活血消癓、補益肝腎、通經、止痛等功效［8］。《本草綱目》中記載“滋補之功，如牛之力”，臨床常用于治療寒濕、腰膝酸軟、屈膝障礙、跌打損傷、經血不調等癥狀［9-10］。懷牛膝為多年生草本植物，安全性高，藥用價值明確，藥用部位為干燥根，秋冬季或初春時采收較好，該時期植株地下根含有的活性成分種類、含量最為豐富［11］。蛻皮甾酮是牛膝甾酮中最重要的藥效成分，其中2020年版《中國藥典》已明確規定β-蛻皮甾酮是評估牛膝質量的重要指標性成分［12］。甾酮類還包括25R∕S-牛膝甾酮、杯莧甾酮、5-表杯莧甾酮等10 余種，現代藥理實驗研究表明甾酮類可促進血液微循環，以及誘導成骨樣細胞增殖等藥理活性，與懷牛膝中醫作用（強筋骨、補肝腎）相吻合［13］。既往報道認為［14］，牛膝在10 月底至11月中旬時的蛻皮甾酮含量相對最高，隨著生長時間的推移，蛻皮甾酮含量呈逐漸降低趨勢，直至12 月底降至較低水平。本研究還發現，生長年限為2～6年中，β-蛻皮甾酮均在不同月份采收的含量存在明顯差異，其中10、11 月含量相對較高，而9、12 月含量相對偏低。另外，本次研究也發現，25R∕S-牛膝甾酮、齊墩果酸含量與β-蛻皮甾酮具有一致的變化趨勢，即11 月左右采收時含相對最高。有研究［15-17］也證實，不同采收期牛膝4 種有機成分和無機元素（鉛、砷、鎘、汞、銅等17種元素）均呈現動態變化，11月中旬采收的牛膝藥材質量最佳，結合本次研究結果進一步證實10 月底至11 月中旬為牛膝最佳采收期。

不同生長年限的懷牛膝藥用價值存在差異，有研究以川牛膝根部葛根素、杯莧甾酮含量為評價指標，結果顯示3年生入藥為佳，為川牛膝的采收給予一定指導，但研究中活性成分指標較少，而川牛膝的實際為1～6年，且其中杯莧甾酮含量與生長年限的之間的關系并不明確，存在一定的局限性［18-19］。本研究以2～6年生懷牛膝為對象，結果發現生長期從2 年開始，有機成分含量逐年增加，于4 年達到最高點，隨后逐步降低。同時，采用SPSS 20.0 對4 個有機化學成分進行主成分分析，結果顯示牛膝生長年限為4 年并于11 月份采收時，綜合得分最高，其次為生長年限為4 年生10 月中旬采收，生長年限為3、5年，10、11月中旬采收的質量接近。本研究通過綜合分析懷牛膝中主要藥效成分含量變化情況，從而確定了牛膝的最佳采收期，為確定牛膝藥材生長年限、采收時間提供了理論依據，但僅通過藥用活性成分含量變化情況評價懷牛膝質量，接下來將結合藥效學實驗進一步研究懷牛膝的適宜采收期。

綜上所述，以β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、齊墩果酸為懷牛膝藥材質量的考核指標，建議4年生11月中旬為牛膝的最佳采收期。