LncRNA MIAT靶向miR-204對氧糖剝奪/復氧誘導PC12細胞損傷的保護作用

劉美苓，安影丹

作者單位：廊坊市第四人民醫院神經內科，河北 廊坊065700

中風是最常見的腦血管疾病類型之一，由于其高發病率、致殘率和病死率［1］，已成為世界范圍內的主要神經系統問題。缺血性腦卒中（IS）是腦卒中的主要亞型，被認為是全球成年人發病和死亡的主要原因［2］，僅在2016 年就造成約550 萬人死亡［3］。IS的主要癥狀包括面部麻木、記憶力減退、說話困難和部分癱瘓［4］。在過去的幾年里，IS 的發病率不斷上升，這可能是由多種因素造成的，例如高膽固醇血癥、高血壓、肥胖和糖尿病［5］。雖然包括溶栓治療、經皮血管內介入治療和藥物治療在內的傳統臨床治療已取得一定作用，但不理想的后續效果促使尋求新的緩解IS策略。

IS 本質上是由恢復到缺血區域的血流引起的腦損傷，這會促進進一步的缺血性器官損傷。雖然腦血再灌注可以減輕葡萄糖和氧氣剝奪，但再灌注過程會加劇炎癥反應、氧化應激和細胞凋亡，從而進一步加劇再灌注引起的腦損傷進展［6］。炎癥和細胞凋亡是參與缺血性卒中進展的關鍵，據報道，抑制炎癥可在一定程度上減少神經組織損傷［7］。因此，抑制炎癥和細胞凋亡可能是治療腦缺血∕再灌注損傷的有效策略［8］。長鏈非編碼RNA（LncRNA）是一類長度大于200 個核苷酸的非編碼RNA，可以在轉錄前、轉錄中和轉錄后水平調節蛋白質編碼基因的表達。LncRNAs 是近年來的研究熱點，之前的大量研究報道LncRNAs 可能與心臟、大腦、肝臟、腎臟和血管內皮組織等幾個重要器官的IRI 的病理過程有關［9］。LncRNA MIAT（心肌梗死相關轉錄本），也稱為RNCR2（視網膜非編碼RNA2），是一種參與多種疾病的LncRNA，如心肌梗死、糖尿病并發癥、缺血性卒中和癌癥［10-11］。曾有研究報道心肌梗死相關轉錄本（MIAT）通過海綿化微RNA-330-5p（miR-330-5p）并激活下游腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）∕核因子-κB（NF-κB）信號傳導來增強膿毒癥誘導的心臟損傷中的炎癥和氧化應激［12］。因此，可以推測MIAT 可能是介導缺血∕再灌注（I∕R）損傷的關鍵LncRNA。

2021 年6—12 月進行本研究，旨在探究LncRNA MIAT 在氧糖剝奪∕復氧（OGD∕R）誘導PC12 細胞損傷的分子調控機制，為緩解IS提供治療策略。

1 材料與方法

1.1 細胞培養與模型建立PC12 細胞購自ATCC（USA），并在含有10%胎牛血清的Dulbecco 氏改良eagle 培養基（Invitrogen，Grand Island，NY，USA）中培養。為了建立缺血樣條件，暴露于缺氧條件的無葡萄糖培養基中的細胞：1%氧氣，5%二氧化碳和94%的氮氣4 h。然后將細胞與含有4.5 g∕L 葡萄糖的正常培養基一起孵育，并復氧24 h。

1.2 PC12 細胞處理LncRNA MIAT 過表達載體（pcDNA3.1-LncRNA MIAT）及其陰性對照pcDNA3.1-NC、miR-204 mimic 及其陰性對照mimic-NC均購自上海吉瑪制藥技術有限公司（上海，中國），通過Lipofectamine 2000（Invitrogen，Carlsbad， CA）以50 nmol作為終濃度轉染至PC12細胞中，命名為：過表達MIAT（oe-MIAT）和相應的陰性對照（oe-NC），以及miR-124模擬物（miR-124 mimic）和相應的陰性對照（mimic NC），測定轉染效率，24 h 后進行后續實驗。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）利用Bio-Rad 軟件（California，USA）確定最佳引物對，并委托上海生工合成。用Promega 公司（USA）的RNA 提取試劑盒從各組細胞中提取總RNA。用PrimerScript RT Master Mix（Takara，Dalian，China）將1 μg RNA 反轉錄為cDNA。根據說明書用SYBR Premix Ex Taq（Takara， Dalian， China）在ABI 7500（ABI，American）上進行qRT-PCR，以GAPDH 為內參，檢測MIAT 的相對表達水平，以U6 為內參檢測miR-204 的相對表達水平。通過2-ΔΔCt法［13］分別計算基因的相對表達量。PCR引物如表1。

表1 引物序列

1.4 CCK-8將細胞接種到96 孔板中（每孔3 000個細胞）并在37 ℃下培養。分別培養0、24、48 和72 h 后，向每個孔中加入10 μL CCK-8 反應試劑（上海碧云天生物技術有限公司）。37 ℃孵育4 h 后，檢測450 nm處的吸光度（OD450），繪制細胞增殖曲線。

1.5 流式細胞術使用凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）檢測細胞凋亡率。簡而言之，用500 μL 結合緩沖液（含鎂、鈣、0.5%NaN3和1%FBS 的培養基）將細胞混懸。向細胞中加入Annexin V（5 μL）和PI（10 μL），并在室溫下避光孵育10 min。使用流式細胞儀（Attune NxT； Thermo Fisher Scientific， Inc）和ModFiLT 軟件（4.1，Verity Software House）檢測并計算凋亡細胞百分比。

1.6 Elisa 檢測使用Elisa 試劑盒（Abcam，UK）檢測炎癥相關因子IL-6、IL-1β、IL-10 的含量。簡而言之，使用試劑盒中裂解緩沖液重懸細胞，于4 ℃、1 500×g離心15 min，取上清液，保存于-70 ℃。根據樣品和標準品在450 nm的吸光度測定濃度。

1.7 RNA 下拉實驗生物素（biotin）標記的miR-204 和陰性對照（上海生工）分別命名為biotin-miR-204 和biotin-NC，并分別與PC12 細胞裂解物孵育。然后添加鏈霉親和素涂層磁珠（Life Technologies，Rockville，MD，USA）。使用生物素偶聯RNA 復合物（Pierce Biotechnology，USA）進行下拉實驗，通過qRT-PCR檢測MIAT的表達。

1.8 雙螢光素酶報告實驗通過Starbase 網站（http：∕∕starbase.sysu.edu.cn∕）分析MIAT 和miR-204的靶向結合位點，通過將結合序列及突變的序列分別克隆至螢光素酶載體pGL3 （Pro-mega， Madison，WI，USA）中來建立野生型（MIAT-WT）和突變型（MIAT-MUT）螢光素酶質粒。將PC12 細胞接種在6孔板中（2×105細胞∕孔）。孵育24 h，按照說明書使用LiPofectamine 2000 （11668-019，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）將構建好的螢光素酶載體與mimic NC 或miR-204 mimic （Shanghai Genechem Co.，Ltd.，Shanghai，China）（miRNA-mimic 30nmol）同時轉染到PC12 細胞中。24 h 后，用Dual-Lucy Assay Kit （Solarbio）對螢光素酶活性進行評估。

1.9 統計學方法所有數據均采用SPSS 21.0（SPSS，Inc，Chicago，IL，USA）統計學軟件進行處理，計量資料采用±s的形式表示。兩組間數據采用獨立樣本t檢驗。多組間比較采用one-way ANOVA單因素方差分析，事后檢驗采用Tukey"s多重比較檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MIAT 對OGD/R 誘導的PC12 損傷起保護作用建立PC12 細胞OGD∕R 模型，通過qRT-PCR 檢測OGD∕R 后MIAT 的表達變化，觀察到OGD∕R 下調了MIAT 的表達（P＜0.01）。進一步，通過CCK-8、流式細胞術檢測OGD∕R誘導對細胞活力及凋亡的影響，觀察到OGD∕R降低了PC12的細胞活力，增加了細胞的凋亡率（P＜0.01）。最后通過Elisa試劑盒檢測OGD∕R誘導上調了炎性因子白細胞介素（IL）-6、IL-1β的含量，下調了抗炎性因子IL-10的含量（均P＜0.01）。在OGD∕R 誘導的PC12 細胞中轉染pcDNA3.1-MIAT 上調其表達后（P＜0.01），上述細胞生物學改變均得到不同程度的逆轉（均P＜0.01）。提示MIAT 對OGD∕R 誘導的PC12細胞起保護作用。見表2，3。

表2 各組MIAT表達和細胞活力的比較∕ ± s

表2 各組MIAT表達和細胞活力的比較∕ ± s

注：Blank為空白對照，OGD∕R為氧糖剝奪∕復氧，MIAT為心肌梗死相關轉錄本，OD450為450 nm處的吸光度，oe-NC為過表達載體陰性對照，oe-MIAT為MIAT過表達載體。

組別Blank OGD∕R t，P值OGD∕R+oe-NC OGD∕R+oe-MIAT t，P值重復次數OD450值MIAT表達（倍數變化）1.011±0.113 0.362±0.085 7.95，0.001 0.374±0.072 0.763±0.116 4.94，0.008 24 h 0.742±0.132 0.654±0.114 0.87，0.431 0.648±0.116 0.673±0.113 0.27，0.802 12 h 0.636±0.107 0.627±0.112 0.10，0.925 0.619±0.098 0.631±0.094 0.15，0.886 48 h 1.263±0.286 0.684±0.115 3.25，0.031 0.697±0.121 0.987±0.113 3.03，0.039 72 h 1.473±0.224 0.806±0.115 4.59，0.010 0.811±0.117 1.137±0.116 3.43，0.027 3 3 3 3 0 h 0.487±0.061 0.479±0.057 0.17，0.876 0.484±0.068 0.476±0.076 0.14，0.989

表3 各組細胞凋亡和炎性因子水平的比較∕ ± s

表3 各組細胞凋亡和炎性因子水平的比較∕ ± s

注：Blank 為空白對照，OGD∕R 為氧糖剝奪∕復氧，MIAT 為心肌梗死相關轉錄本，oe-NC 為過表達載體陰性對照，oe-MIAT 為MIAT 過表達載體，IL-6為白細胞介素-6，IL-1β為白細胞介素-1β，IL-10為白細胞介素-10。

IL-10∕（ng∕L）39.45±1.45 14.33±2.36 15.71，＜0.001 14.12±2.11 31.87±4.34 6.37，0.003組別Blank OGD∕R t，P值OGD∕R+oe-NC OGD∕R+oe-MIAT t，P值重復次數3 3 3 3細胞凋亡率∕%8.16±0.84 28.25±4.13 8.26，0.001 27.62±4.62 18.13±2.88 3.02，0.039 IL-6∕（ng∕L）96.75±6.73 525.19±15.62 43.63，＜0.001 511.37±18.75 318.95±10.34 15.56，＜0.001 IL-1β∕（ng∕L）46.28±2.84 292.54±19.54 21.60，＜0.001 286.84±16.85 103.58±12.73 15.03，＜0.001

2.2 MIAT 可以靶向結合miR-204 抑制其表達通過miRcode（http：∕∕ www.mircode.org∕）預測了LncRNA MIAT 下游靶向結合miRNA，在這之中，有研究表明miR-204可以促進神經細胞的損傷［14］。首先使用生物素化的miR-204 探針來下拉LncRNA MIAT，與對照組（1.001±0.003）相比，MIAT 特異性富集在生物素標記的miR-204（14.984±4.762）探針上（t=5.09，P=0.007）。進一步通過雙螢光素酶報告實驗檢測LncRNA MIAT 與miR-204 的靶向結合，與NC組相比，轉染miR-204 mimic 后，MIAT-WT 組的螢光素酶活性顯著降低；而MIAT-MUT 組的螢光素酶活性沒有變化（表4）。最后qRT-PCR 檢測了前述實驗各組PC12細胞中的miR-204的表達，發現OGD∕R 上調了miR-204 的表達，但轉染pcDNA3.1-MIAT 后，miR-204 表達顯著降低（表5）。提示LncRNA MIAT可以靶向miR-204抑制其表達。

表4 雙螢光素酶報告實驗∕ ± s

表4 雙螢光素酶報告實驗∕ ± s

注：MIAT 為心肌梗死相關轉錄本，MIAT-wt 為野生型MIAT，MIAT-mut 為突變型MIAT，mimi-NC 為模擬物陰性對照，miR-204 mimic為miR-204模擬物。

組別MIAT-wt MIAT-mut t，P值重復次數螢光素酶活性mimi-NC 1.001±0.003 0.488±0.053 16.74，＜0.001 miR-204 mimic 1.002±0.044 0.997±0.036 0.15，0.886 3 3

表5 各組細胞中miR-204表達的比較∕ ± s

表5 各組細胞中miR-204表達的比較∕ ± s

注：Blank為空白對照，OGD∕R為氧糖剝奪∕復氧，MIAT為心肌梗死相關轉錄本，oe-NC 為過表達載體陰性對照，oe-MIAT 為MIAT 過表達載體。

miR-204表達（倍數變化）1.001±0.002 2.234±0.306 6.98，0.002 2.198±0.324 1.373±0.268 3.40，0.027組別Blank OGD∕R t，P值OGD∕R+oe-NC OGD∕R+oe-MIAT t，P值重復次數3 3 3 3

2.3 上調miR-204 可以部分逆轉高表達MIAT 對OGD/R 誘導的PC12 損傷保護在轉染了pcDNA3.1-MIAT 且OGD∕R 誘導的PC12 細胞中 共 轉染了miR-204 mimic，qRT-PCR 檢測了轉染效率（P＜0.01）。通過CCK-8、流式細胞術檢測miR-204 對細胞活力及凋亡的影響，觀察到上調miR-204 降低了PC12 的細胞活力，增加了細胞的凋亡率（P＜0.01）。最后通過Elisa 試劑盒檢測觀察到高表達miR-204上調了炎性因子IL-6、IL-1β 的含量，下調了抗炎性因子IL-10 的含量（均P＜0.01）。提示上調miR-204的表達可以部分逆轉高表達MIAT 對OGD∕R 誘導的PC12損傷保護。見表6，7。

表6 各組miR-204表達和450 nm處的吸光度（OD450值）的比較∕ ± s

表6 各組miR-204表達和450 nm處的吸光度（OD450值）的比較∕ ± s

注：OGD∕R為氧糖剝奪∕復氧，MIAT為心肌梗死相關轉錄本，mimic-NC為模擬物陰性對照，miR-204 mimic為miR-204模擬物。

組別OGD∕R+MIAT+mimic-NC OGD∕R+MIAT+miR-204 mimic重復次數OD450值miR-204表達1.475±0.115 2.087±0.121 24 h 0.703±0.068 0.692±0.074 72 h 1.134±0.104 0.879±0.096 12 h 0.507±0.043 0.508±0.057 0 h 0.486±0.062 0.488±0.058 48 h 0.989±0.105 0.735±0.110 3 3 t，P值6.35，0.003 0.19，0.859 3.12，0.036 0.02，0.982 0.04，0.969 2.89，0.044

表7 各組細胞凋亡率和炎性因子水平的比較∕ ± s

表7 各組細胞凋亡率和炎性因子水平的比較∕ ± s

注：OGD∕R 為氧糖剝奪∕復氧，MIAT 為心肌梗死相關轉錄本，mimic-NC 為模擬物陰性對照，miR-204 mimic 為miR-204 模擬物，IL-6 為白細胞介素-6，IL-1β為白細胞介素-1β，IL-10為白細胞介素-10。

IL-10∕（ng∕L）30.854±4.669 18.936±3.212 3.64，0.022組別OGD∕R+MIAT+mimic-NC OGD∕R+MIAT+miR-204 mimic t，P值重復次數3 3細胞凋亡率∕%19.956±2.62 28.103±3.18 3.42，0.027 IL-6∕（ng∕L）324.871±10.36 459.653±11.43 15.13，＜0.001 IL-1β∕（ng∕L）115.765±13.750 223.654±18.896 8.00，0.001

3 討論

缺血性卒中是臨床常見的腦血管疾病，每年約有15 萬人遭受中風傷害，并且近500 萬人死于中風傷害［15］。在缺血條件下，大腦不能獲得足夠的能量供應，包括血液和氧氣，用于生物合成、細胞膜結構的維持和酶的正常功能，從而導致神經損傷［16］。迄今為止，恢復缺血腦組織的血液和氧氣供應被認為是缺血性卒中臨床治療中的首要問題［15］。然而，血液和氧氣供應可能導致缺血組織的病理損傷，導致不可逆的腦缺血∕再灌注損傷［17］。因此，保護神經細胞免受I∕R 誘導的損傷可能有益于中風的治療［18］。腦缺血∕再灌注損傷的基本機制尚未完全闡明。研究表明，再灌注后大量自由基產生和自由基清除能力下降導致的氧化應激是腦缺血再灌注損傷的關鍵調節因素，過度的氧化應激可導致脂質過氧化、蛋白質硝化、核酸損傷以及神經細胞膜和細胞器的嚴重炎癥［19］。因此，防止氧化應激和炎癥反應的有效策略顯示出抑制腦I∕R損傷的有益效果。

最近，LncRNA 的作用逐漸引起人們的廣泛關注［20］，本研究的主要發現是確認LncRNA MIAT 在缺血性卒中中的重要性并闡明其潛在機制。LncRNA廣泛存在于中樞神經系統中，在腦功能和神經系統疾病中發揮著重要作用。以往的研究表明，LncRNA MIAT 在神經損傷疾病中異常表達，例如，LncRNA MIAT 通過miRNA-379 的競爭性結合調節視神經損傷，促進神經血管重塑［21］和調節心臟休克蛋白5（HSPA5）［22］；LncRNA MIAT 的 過 表 達 通 過RAD21 激活血管內皮生長因子A 促進急性脊髓損傷的神經損傷修復［23］，Xu 等［24］研究也發現MIAT 能夠通過調miR-132∕SIRT1 軸來抑制1-甲基-4-苯基吡啶鎓（MPP+）誘導的氧化應激損傷。在本研究發現MIAT 在由OGD∕R 誘導的PC12 細胞中高表達，還發現LncRNA MIAT的過表達對OGD∕R誘導的PC12損傷具有保護作用，而進一步的機制研究表明，PC12細胞中LncRNA MIAT 的過表達通過抑制miR-204表達，上調細胞活力及降低細胞凋亡率，還減輕了細胞的炎癥，從而減輕PC12細胞損傷。

多項報道揭示miRNA 在調節神經發育中發揮重要作用。2015 年，研究人員首次提出miR-27a 上調可減弱缺血再灌注誘導的血-脊髓屏障炎性損傷的證據［25］。之后，Li 等［26］發現抑制miR-124-3p 可減弱脊髓缺血后的神經損傷。Li 等［27］證實了SCII 大鼠中4 個差異表達的microRNA（miR-22-3p、miR-743b-3p、miR-201-5p 和miR144-5p）及其共同靶基因，其中miR-22-3p 上調，miR-743b-3p、miR-201-5p和miR-144-5p 下調。2006 年，miR-204 首次在胰腺內分泌和腺泡腫瘤中被發現，然后，它被證明是一種廣泛表達的miRNA，在甲狀腺癌等細胞中異常表達［28］。既往報道證明缺氧刺激神經元細胞表達miR-204［29］，而本研究也發現miR-204在OGD∕R誘導后高表達，且促進了PC12細胞的損傷。

總而言之，本研究探究了OGD∕R 誘導的PC12損傷的分子調控機制，為其治療提供了新的思路，未來也將會在動物模型中對分子機制進行進一步的驗證。