微RNA-124-3p在潰瘍性結(jié)腸炎病人外周血中的表達(dá)及意義

吳春燕，汪曉燕，李炎

作者單位：武漢市蔡甸區(qū)人民醫(yī)院，a消化內(nèi)科，b內(nèi)分泌科，湖北 武漢430100

目前為止，潰瘍性結(jié)腸炎（UC）確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚［1-2］。因此，早期診斷UC疾病及其嚴(yán)重程度對(duì)及時(shí)有效地進(jìn)行治療至關(guān)重要［3］。微RNA（miRNA）是一種長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸的單鏈非編碼內(nèi)源性RNA 分子，其主要功能是負(fù)調(diào)控編碼蛋白靶基因的mRNA穩(wěn)定性，不僅影響癌癥的發(fā)生發(fā)展，而且在其他疾病的進(jìn)展中也具有一些特殊的調(diào)控功能［4］。近年來(lái)證據(jù)表明，miRNA 在UC 中廣泛失調(diào)，可能參與UC 的發(fā)病機(jī)制，并在其診斷和治療方面發(fā)揮作用［5-6］。微RNA-124（miR-124）最初在小鼠中發(fā)現(xiàn)，后來(lái)被證明是一個(gè)高度保守的miRNA。微RNA-124-3p（miR-124-3p）是miR124 成員之一，位于染色體20q13.33，此前主要被表述為一個(gè)腫瘤抑制因子，隨后發(fā)現(xiàn)其在免疫功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，并參與調(diào)節(jié)各種炎癥反應(yīng)［7］。miR-124-3p 的研究主要集中在癌癥發(fā)生與發(fā)展中的潛在影響方面，而對(duì)于UC的臨床研究了解較少。因此，本研究檢測(cè)了miR-124-3p 在UC病人外周血中的表達(dá)，旨在闡述miR-124-3p表達(dá)在UC 方面的臨床意義，為進(jìn)一步理解UC 發(fā)病機(jī)制和開(kāi)發(fā)新的治療手段開(kāi)辟了一個(gè)新的方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究為前瞻性研究，選擇121 例UC病人（UC組）和60例健康體檢者（對(duì)照組）作為研究對(duì)象。UC 組來(lái)源于2019 年8 月至2021 年8 月武漢市蔡甸區(qū)人民醫(yī)院消化科住院治療的病人，其中男性63例，女性58例；年齡范圍為20～78歲，中位年齡40歲；病情緩解期43例，活動(dòng)期78例；病變?yōu)橹蹦c的30例，左半結(jié)腸36例，廣泛結(jié)腸55例。所有UC病人均進(jìn)行了臨床常規(guī)檢查、結(jié)腸鏡檢查及組織病理學(xué)評(píng)估，符合《炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(jiàn)（2018年·北京）》［8］中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，就診前未接受過(guò)其他治療，臨床資料完善；排除合并其他炎性疾病和惡性腫瘤的病人及有肝腎功能障礙的病人。對(duì)照組來(lái)源于同期于我院進(jìn)行健康體檢的個(gè)體，男性35例，女性25例，年齡范圍為27～76歲。兩組病人性別、年齡相比，均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.64，P=0.426；t=1.15，P=0.253）。病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 方法

1.2.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞分離及總RNA 提取 抽取所有研究對(duì)象清晨空腹?fàn)顟B(tài)下的靜脈血5 mL，收集在肝素抗凝管中，使用淋巴細(xì)胞分離液分離純化外周血單個(gè)核細(xì)胞，保存待測(cè)。使用TRIzol試劑（賽默飛世爾科技有限公司，貨號(hào)10296028）按照說(shuō)明書(shū)的步驟提取UC 病人和健康體檢者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的總RNA，RNA 樣品的濃度和純度使用電泳和分光光度法測(cè)定，OD值1.8～2.0為合格。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)miR-124-3p 表達(dá)水平 取檢測(cè)合格的RNA 樣品，使用miScript 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海聯(lián)碩寶為生物科技有限公司，貨號(hào)218161）進(jìn)行cDNA 制備，然后使用miScript SYBR Green PCR Kit（上海賓智生物科技有限公司，貨號(hào)218075）在ABI 7900HT 熒光定量PCR系統(tǒng)上（美國(guó)ABI 公司）檢測(cè)miR-124-3p 的表達(dá)水平。qRT-PCR 反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，共40 個(gè)循環(huán)。以U6 作為內(nèi)參基因，引物序列如下：miR-124-3p 正 向5"-CGGGTAGCAGGCTTCTGAGT-3"，miR-124-3p 反 向5"-AAACCCCTCTCTGTCGGTAGCT-3"；U6 正 向5"-CTTTGCCGCACGGCACA-3"，U6 反向5"-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3"，引物干粉由上海生工生物公司合成。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，最后使用2-ΔΔCt公式計(jì)算miR-124-3p的表達(dá)水平。

1.2.3 C-反應(yīng)蛋白（CRP）水平檢測(cè) CRP 水平檢測(cè)使用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法，嚴(yán)格按照試劑盒（北京，貨號(hào)SEKH-0138）說(shuō)明書(shū)的操作方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 UC病人嚴(yán)重程度分組 根據(jù)UC內(nèi)鏡嚴(yán)重指數(shù)（UCEIS）對(duì)UC 病人受累腸段嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分［9］，根據(jù)血管紋理、出血情況及糜爛潰瘍這3 個(gè)方面計(jì)算UCEIS 評(píng)分，血管正常為0分，血管紋理部分消失為1分，全部消失為2分；無(wú)出血為0分，黏膜出血為1分，腔內(nèi)少量新鮮出血為2分，腔內(nèi)多量出血，沖洗后滲血，黏膜新鮮滲血為3分；正常黏膜，無(wú)潰瘍?yōu)? 分，糜爛（黏膜表面黃白色平坦邊緣≤5 mm 小缺損）為1 分，淺潰瘍（＞5 mm 黏膜破損，或散在表淺潰瘍）為2分，深潰瘍（深鑿樣黏膜缺損，周邊輕度隆起）為3分。UC緩解期病人UCEIS評(píng)分為0～1分，活動(dòng)期為2～8 分。根據(jù)改良梅奧（Mayo）評(píng)分對(duì)UC 病人臨床活動(dòng)度進(jìn)行評(píng)價(jià)［10］，癥狀緩解及輕度、中度、重度活動(dòng)分別為0～2分、3～5分、6～10分、11～12分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本研究數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 22.0版本統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件完成分析。計(jì)量資料用±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，三組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；UC活動(dòng)期病人外周血miR-124-3p表達(dá)水平與CRP水平的相關(guān)性采用Pearson法，與UCEIS 評(píng)分、改良Mayo 評(píng)分的相關(guān)性分析采用Spearman法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-124-3p 及CRP 在UC 組和對(duì)照組外周血中的表達(dá)水平與對(duì)照組相比，UC組病人外周血中miR-124-3p 的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），CRP 水平顯著升高（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 潰瘍性結(jié)腸炎（UC）病人121例和健康體檢者60例miR-124-3p、CRP表達(dá)水平的比較∕ ± s

表1 潰瘍性結(jié)腸炎（UC）病人121例和健康體檢者60例miR-124-3p、CRP表達(dá)水平的比較∕ ± s

注：miR-124-3p為微RNA-124-3p，CRP為C-反應(yīng)蛋白。

組別對(duì)照組UC組t值P值CRP∕（mg∕L）7.08±2.52 9.83±2.91 6.25＜0.001例數(shù)60 121 miR-124-3p 0.84±0.22 0.52±0.17 10.78＜0.001

2.2 miR-124-3p 及CRP 在UC 緩解期和活動(dòng)期病人外周血中的表達(dá)水平與UC緩解期病人相比，活動(dòng)期病人外周血中miR-124-3p的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），CRP水平顯著升高（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 潰瘍性結(jié)腸炎（UC）病人121例緩解期和活動(dòng)期miR-124-3p、CRP表達(dá)水平的比較∕ ± s

表2 潰瘍性結(jié)腸炎（UC）病人121例緩解期和活動(dòng)期miR-124-3p、CRP表達(dá)水平的比較∕ ± s

注：miR-124-3p為微RNA-124-3p，CRP為C-反應(yīng)蛋白。

病情程度緩解期活動(dòng)期t值P值CRP∕（mg∕L）9.06±2.85 10.25±2.94 2.15 0.033例數(shù)43 78 miR-124-3p 0.67±0.22 0.44±0.14 7.02＜0.001

2.3 miR-124-3p 及CRP 在UC 不同病變范圍病人外周血中的表達(dá)水平UC 不同病變范圍病人miR-124-3p、CRP 表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 潰瘍性結(jié)腸炎（UC）病人121例不同病變范圍miR-124-3p、CRP表達(dá)水平的比較∕ ± s

表3 潰瘍性結(jié)腸炎（UC）病人121例不同病變范圍miR-124-3p、CRP表達(dá)水平的比較∕ ± s

注：miR-124-3p為微RNA-124-3p，CRP為C-反應(yīng)蛋白。

病變范圍直腸左半結(jié)腸廣泛結(jié)腸F值P值CRP∕（mg∕L）10.85±3.08 9.24±2.63 9.65±2.99 2.69 0.072例數(shù)30 36 55 miR-124-3p 0.46±0.14 0.52±0.17 0.55±0.18 2.79 0.066

2.4 UC 不同臨床活動(dòng)度病人外周血miR-124-3p、CRP 表達(dá)水平及UCEIS 評(píng)分、改良Mayo 評(píng)分的比較與UC 輕度活動(dòng)病人相比，中度和重度活動(dòng)病人外周血中miR-124-3p 的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），CRP 水平、UCEIS 評(píng)分及改良Mayo 評(píng)分顯著升高（P＜0.05）；與UC 中度活動(dòng)病人相比，重度活動(dòng)病人外周血中miR-124-3p 的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），CRP 水平、UCEIS 評(píng)分及改良Mayo 評(píng)分顯著升高（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 潰瘍性結(jié)腸炎（UC）不同活動(dòng)期78例miR-124-3p、CRP表達(dá)水平及UCEIS評(píng)分、改良Mayo評(píng)分的比較∕ ± s

表4 潰瘍性結(jié)腸炎（UC）不同活動(dòng)期78例miR-124-3p、CRP表達(dá)水平及UCEIS評(píng)分、改良Mayo評(píng)分的比較∕ ± s

注：miR-124-3p為微RNA-124-3p，CRP為C-反應(yīng)蛋白，UCEIS評(píng)分為潰瘍性結(jié)腸炎內(nèi)鏡嚴(yán)重指數(shù)評(píng)分，改良Mayo評(píng)分為改良梅奧評(píng)分。①與輕度相比，P＜0.05。②與中度相比，P＜0.05。

臨床活動(dòng)度輕度中度重度F值P值改良Mayo評(píng)分∕分3.98±0.95 7.70±1.64①11.53±0.46①②240.04＜0.001例數(shù)27 30 21 miR-124-3p 0.53±0.16 0.45±0.13①0.30±0.09①②16.01＜0.001 CRP∕（mg∕L）8.74±2.83 10.35±2.79①12.03±3.02①②7.43 0.001 UCEIS評(píng)分∕分3.03±0.90 4.82±1.51①5.97±1.82①②26.10＜0.001

2.5 UC 活動(dòng)期病人外周血miR-124-3p 與CRP、UCEIS評(píng)分及改良Mayo評(píng)分的相關(guān)性相關(guān)性分析結(jié)果顯示，UC活動(dòng)期78例外周血miR-124-3p表達(dá)水平與CRP、UCEIS評(píng)分及改良Mayo評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.57，P＜0.05；r=-0.44，P＜0.05；r=-0.59，P＜0.05）。

3 討論

在過(guò)去的20 年里，對(duì)UC 復(fù)雜發(fā)病機(jī)制的更多了解引發(fā)了藥物開(kāi)發(fā)的進(jìn)步，如幾種生物制劑和小分子療法的開(kāi)發(fā)，盡管治療選擇的增加是積極的，但對(duì)臨床UC 的療效有限，一旦確診難以治愈，并且與結(jié)直腸癌的高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)［11］。目前仍需要尋找UC潛在的治療靶點(diǎn)，以利于臨床早期評(píng)估病情嚴(yán)重程度，確定有效的治療方式。

先前的研究已經(jīng)證明miRNA 在UC 病人中差異表達(dá)，并且在UC 的病理過(guò)程中具有重要作用。例如，miR-155 改善UC 病人的活動(dòng)期腸道炎癥，miR-21 可緩解UC 腸道屏障功能受損［12］。UC 是一個(gè)嚴(yán)重的炎癥過(guò)程，不同的miRNA 在UC 的炎癥過(guò)程中發(fā)揮著不同的調(diào)節(jié)作用。miR-206 在UC 中的表達(dá)量顯著上調(diào)，在炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮促炎因子的作用［13］。miR-505在UC中的表達(dá)量下調(diào)，其低表達(dá)與病人的病情嚴(yán)重程度和預(yù)后不良有關(guān)［14］。miR-219-5p在UC 小鼠結(jié)腸黏膜組織中下調(diào)，注射其慢病毒過(guò)表達(dá)載體可抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，減輕UC 小鼠的結(jié)腸損傷［15］。越來(lái)越多的證據(jù)表明，miR-124-3p 的表達(dá)異常與各種類(lèi)型癌癥的惡性進(jìn)展、耐藥甚至預(yù)后生存相關(guān)，對(duì)于某些疾病的早期診斷、治療和預(yù)后有重要價(jià)值［5］。前人關(guān)于miR-124-3p的研究主要集中在癌癥領(lǐng)域，例如，Wang 等［16］報(bào)道了miR-124-3p 在肝細(xì)胞癌中表達(dá)下調(diào)，與肝細(xì)胞癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。而最近幾年研究表明，miR-124-3p 在免疫功能中發(fā)揮作用，并參與調(diào)節(jié)各種炎癥反應(yīng)。Liang 等［17］在心肌缺血再灌注損傷的大鼠模型和H∕R 處理的人心肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miR-124-3p 顯著下調(diào)，可能調(diào)節(jié)H∕R 誘導(dǎo)的炎癥和細(xì)胞凋亡。Luo等［18］的研究中報(bào)道了miR-124-3p 與UC 相關(guān)，miR-124-3p 通過(guò)靶向調(diào)控LPS 誘導(dǎo)的結(jié)腸細(xì)胞中的STAT3 發(fā)揮作用，增強(qiáng)miR-124-3p 的表達(dá)可減少炎癥過(guò)程中細(xì)胞凋亡和ROS 的產(chǎn)生。基于以上文獻(xiàn)，我們的研究檢測(cè)了UC 病人和對(duì)照組外周血miR-124-3p的表達(dá)水平，研究顯示，與對(duì)照組相比，UC病人中miR-124-3p 的表達(dá)水平顯著降低，說(shuō)明miR-124-3p 表達(dá)水平可能對(duì)UC 的發(fā)生過(guò)程產(chǎn)生一定的影響。

本研究中，UC 活動(dòng)期病人外周血miR-124-3p表達(dá)水平較緩解期低，且UC 不同臨床活動(dòng)度病人外周血miR-124-3p 表達(dá)水平由高至低依次為輕度、中度、重度，說(shuō)明miR-124-3p 表達(dá)水平可能與UC 病人病情變化有關(guān)。大量研究證實(shí)，UCEIS評(píng)分、改良Mayo 評(píng)分是臨床常用評(píng)估UC 嚴(yán)重程度的工具，而CRP 是一種臨床常用的炎癥標(biāo)志物，在各種其他疾病狀態(tài)下均可迅速升高，對(duì)于評(píng)估UC 病情嚴(yán)重程度具有較高的靈敏度，在預(yù)測(cè)是否需要結(jié)腸切除術(shù)方面具有重要作用。對(duì)于UC 病人來(lái)說(shuō)，UCEIS 評(píng)分、改良Mayo評(píng)分和CRP水平在總體嚴(yán)重程度評(píng)分中擁有較高的權(quán)重［19-20］。本研究中CRP 水平在UC病人中水平升高，UC 活動(dòng)期病人CRP 水平較緩解期高，UC 不同臨床活動(dòng)度病人CRP 表達(dá)水平及UCEIS 評(píng)分、改良Mayo 評(píng)分由高至低依次為重度、中度、輕度，且相關(guān)分析結(jié)果顯示UC 活動(dòng)期病人外周血miR-124-3p 表達(dá)水平與CRP、UCEIS 評(píng)分及改良Mayo評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步說(shuō)明miR-124-3p表達(dá)可能與UC 病變活動(dòng)和嚴(yán)重程度有一定關(guān)系，且可能參與UC 的炎癥反應(yīng)。此外，本研究通過(guò)分析UC 不同病變范圍病人miR-124-3p、CRP 表達(dá)水平，結(jié)果顯示miR-124-3p、CRP表達(dá)在UC不同病變范圍中的變化較小，提示檢測(cè)miR-124-3p、CRP水平對(duì)區(qū)分UC的發(fā)病部位幫助較小。

綜上所述，UC 病人外周血miR-124-3p 表達(dá)水平較低，miR-124-3p 表達(dá)水平與UC 病人CRP、UCEIS 評(píng)分及改良Mayo 評(píng)分密切相關(guān)，可能成為反映UC 病人病情的指標(biāo)之一。但本研究存在一些局限性，樣本規(guī)模相對(duì)較小，使得在數(shù)據(jù)選擇和分析中容易產(chǎn)生偏倚，需要進(jìn)一步加大規(guī)模驗(yàn)證。