重癥肺炎64例外周血微RNA-34a、沉默信息調節因子1的表達

甘平，藍軍

作者單位：武警重慶總隊醫院呼吸與危重癥醫學科，重慶400061

重癥肺炎是臨床常見的呼吸系統危重癥之一，除引發呼吸衰竭外，還可引發神經、心血管系統功能障礙，具有病情進展急驟、救治難度大、病死率高等特點。全身炎癥反應激活是重癥肺炎重要的病理生理特征，持續激活的炎癥反應會造成全身多個臟器功能損害、嚴重者發展為多器官功能障礙綜合征并造成死亡［1］。因此，深入認識炎癥反應的調控機制是目前研究重癥肺炎發病機制、評估及防治手段的重要靶點。微RNA（miR）是具有廣泛生物學活性的小分子RNA，參與包括炎癥反應在內多種病理生理過程的調控，也能釋放進入外周血并作為評估病情的標志物［2-3］。沉默信息調節因子1（Sirt1）是去乙酰化酶sirtuin家族的一員，可提高細胞對凋亡及炎癥反應的抗性，其高表達與機體炎癥反應的減輕關系密切［4］。一項動物實驗表明，重癥肺炎大鼠肺組織中miR-34a的表達顯著增加、Sirt1 的表達顯著降低，抑制miR-34a 通過上調Sirt1的表達減輕重癥肺炎大鼠的肺損害［5］。但miR-34a 及其靶向調控的Sirt1 在重癥肺炎病人體內的變化、相關性及其對病人預后是否存在評估價值尚不清楚。因此，本研究對重癥肺炎病人miR-34a、Sirt1表達水平及其在重癥肺炎預后評估中的應用價值，旨在為臨床重癥肺炎的診療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2017 年10 月至2020 年4 月武警重慶總隊醫院收治的64 例重癥肺炎病人作為研究的重癥肺炎組，同期收治的80例普通肺炎病人作為普通肺炎組，納入標準：（1）參照《中國成人社區獲得性肺炎診斷和治療指南（2016 年版）》［6］中疾病的診斷標準，符合重癥肺炎或普通肺炎的診斷；（2）病人性別不限，年齡≥18 歲；（3）入組前未接受免疫抑制劑或激素治療。排除標準：（1）合并肺結核、支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病等其他呼吸系統疾病；（2）合并惡性腫瘤、結締組織病；（3）存在嚴重肝腎功能障礙病人。另取同期進行健康體檢的70 例健康志愿者作為對照組。一般資料比較見表1。本研究病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

表1 重癥肺炎64例、普通肺炎80例與健康志愿者70例一般資料的比較

1.2 研究方法

1.2.1 肺炎病情嚴重程度評估 參照《中國成人社區獲得性肺炎診斷和治療指南（2016年版）》［6］采用肺炎嚴重指數（PSI）進行肺炎病情的評估，Ⅰ級和Ⅱ級為低危病人、Ⅲ級和Ⅳ級為中危病人、Ⅴ級為高危病人。

1.2.2 外周血miR-34a表達水平檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈（qRT-PCR）法檢測miR-34a 的表達水平。①總RNA提取：取重癥肺炎組、普通肺炎組病人入院后次日晨起空腹靜脈血5 mL，對照組體檢當日空腹靜脈血5 mL，2 500 r∕min離心5 min，分離血清后，低溫保藏待測；應用miRNeasy Mini Kit 試劑盒（德國QIAGEN 公司）提取血清總RNA，紫外分光光度計（美國貝克曼庫爾特有限公司，DU800 型）測定RNA 濃度及純度。②cDNA 反轉錄：總RNA 經凝膠電泳分離、純化，采用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，-20 ℃保存備用。③qRT-PCR 檢測：以cDNA 為模板，應用miRcute miRNA 熒光定量檢測試劑盒（天根生化科技有限公司）檢測miR-34a表達水平，引物序列為：正向5"-TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT-3"，反向3"-GCCATTCAGGCTAGCAGC-5"；反應體系（20 μL）包括：2×miRcute miRNA Premix 10 μL、上下游引物各0.4 μL（10 μmol∕L），6.8 μL DEPCtreated water。循環參數：95 ℃預變性30 s，95 ℃ 10 s、63 ℃ 31 s（40 cycles）。以U6 為內參，miRNA 表達結果采用2-ΔΔCt計算，每個樣本檢測3 次，取平均值。以中位值2-ΔΔCt=1.45 為截斷值，2-ΔΔCt≥1.45 為miR-34a高表達，2-ΔΔCt＜1.45為miR-34a為低表達。

1.2.3 血清Sirt1 水平檢測 取病人血清樣本，使用全自動生化分析儀（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司，邁瑞BS280）采用酶聯免疫吸附法檢測血清Sirt1水平。相關試劑盒由上海酶聯公司提供，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。以中位值Sirt1表達水平=7.15 μg∕L為截斷值，Sirt1表達水平≥7.15 μg∕L為Sirt1高表達，Sirt1表達水平＜7.15 μg∕L為Sirt1低表達。

1.2.4 血清炎性細胞因子水平檢測 取病人血清樣本，采用酶聯免疫吸附法檢測血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）、白細胞介素（IL）-6 和高遷移率族蛋白B-1（HMGB1）水平。相關試劑盒由上海酶聯公司提供，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.5 預后評估 采用電話或門診復查的方式對病人進行隨訪，隨訪時間為入院后30 d，記錄病人30 d累積生存率。生存時間定義為入院當日至隨訪截止時或病人死亡時；因肺炎以外原因死亡的為截尾數據。

1.3 統計學方法采用SPSS 22.0 軟件進行統計學處理，計量資料（均服從正態分布）以±s表示，兩組間比較行獨立樣本t檢驗；三組間及不同病情嚴重程度病人各指標比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t比較；采用Pearson 檢驗分析重癥肺炎組miR-34a表達水平與血清Sirt1含量的相關性；采用Kaplan-Meier 生存分析研究miR-34a 與Sirt1 表達水平與重癥肺炎組病人預后的關系，Log rank 檢驗比較組間差異；影響重癥肺炎病人預后的因素采用Cox回歸分析。檢驗水準：α=0.05。

2 結果

2.1 重癥肺炎組、普通肺炎組、對照組miR-34a、Sirt1表達水平的比較重癥肺炎組、普通肺炎組病人miR-34a 表達水平高于對照組，Sirt1 表達水平低于對照組（P＜0.05）；重癥肺炎組病人miR-34a 的表達水平高于普通肺炎組，Sirt1 表達水平低于普通肺炎組（P＜0.05）。見表2。

表2 重癥肺炎64例、普通肺炎80例與健康志愿者70例外周血miR-34a表達水平、血清Sirt1含量的比較∕ ± s

表2 重癥肺炎64例、普通肺炎80例與健康志愿者70例外周血miR-34a表達水平、血清Sirt1含量的比較∕ ± s

注：miR-34a為微RNA-34a，Sirt1為沉默信息調節因子1。①與對照組比較，P＜0.05。②與普通肺炎組比較，P＜0.05。

組別對照組普通肺炎組重癥肺炎組F值P值Sirt1∕（μg∕L）12.11±1.77 8.94±1.62①6.83±1.59①②26.58＜0.001例數70 80 64 miR-34a 1.00±0.25 1.32±0.33①1.65±0.28①②19.39＜0.001

2.2 重癥肺炎組miR-34a 表達水平與血清Sirt1 含量的相關性重癥肺炎組病人miR-34a 表達水平與Sirt1表達水平存在明顯負相關（r=-0.31，P＜0.001）。

2.3 重癥肺炎組中不同病情嚴重程度病人miR-34a、Sirt1 表達水平的比較高危病人、中危病人miR-34a 表達水平高于低危病人，Sirt1 表達水平低于低危病人（P＜0.05），高危病人miR-34a 表達水平高于中危病人，Sirt1 表達水平低于中危病人（P＜0.05）。見表3。

表3 重癥肺炎64例不同病情嚴重程度病人miR-34a、Sirt1表達水平的比較∕ ± s

表3 重癥肺炎64例不同病情嚴重程度病人miR-34a、Sirt1表達水平的比較∕ ± s

注：miR-34a為微RNA-34a，Sirt1為沉默信息調節因子1。①與低危病人比較，P＜0.05。②與中危病人比較，P＜0.05。

組別低危中危高危F值P值Sirt1∕（μg∕L）7.85±1.70 6.78±1.60①5.49±1.41①②9.63＜0.001例數21 28 15 miR-34a 1.41±0.25 1.63±0.27①2.03±0.32①②22.20＜0.001

2.4 重癥肺炎組中不同外周血miR-34a表達水平病人血清炎性細胞因子的比較重癥肺炎組中miR-34a高表達病人的血清TNF-α、ICAM-1、IL-6、HMGB1 含量高于miR-34a低表達病人（P＜0.05）。見表4。

表4 重癥肺炎64例外周血miR-34a不同表達水平病人血清炎性細胞因子的比較∕ ± s

表4 重癥肺炎64例外周血miR-34a不同表達水平病人血清炎性細胞因子的比較∕ ± s

注：TNF-α為腫瘤壞死因子-α，ICAM-1為細胞間黏附分子-1，IL-6為白細胞介素-6，HMGB1為高遷移率族蛋白B-1。

HMGB1∕（ng∕L）109.39±22.51 83.52±16.59 5.40＜0.001類別高表達低表達t值P值例數32 32 TNF-α∕（μg∕L）13.22±3.22 10.71±2.94 3.37 0.001 ICAM-1∕（μg∕L）513.25±73.59 409.39±66.47 6.10＜0.001 IL-6∕（ng∕L）212.56±36.59 169.51±31.29 5.21＜0.001

2.5 重癥肺炎組中不同血清Sirt1 含量病人血清炎癥細胞因子含量的比較重癥肺炎組中Sirt1 高含量病人的血清TNF-α、ICAM-1、IL-6、HMGB1 含量低于miR-34a低含量病人（P＜0.05）。見表5。

表5 重癥肺炎64例血清Sirt1含量不同病人血清炎癥細胞因子的比較∕ ± s

表5 重癥肺炎64例血清Sirt1含量不同病人血清炎癥細胞因子的比較∕ ± s

注：TNF-α為腫瘤壞死因子-α，ICAM-1為細胞間黏附分子-1，IL-6為白細胞介素-6，HMGB1為高遷移率族蛋白B-1。

HMGB1 81.52±17.11 111.39±21.99 6.06＜0.001組別高含量低含量t值P值例數32 32 TNF-α 10.92±2.77 13.02±3.39 2.71 0.009 ICAM-1 412.54±68.12 510.10±71.94 5.57＜0.001 IL-6 171.44±31.91 210.63±35.97 4.61＜0.001

2.6 重癥肺炎組中不同外周血miR-34a 表達水平及血清Sirt1 含量病人預后的比較重癥肺炎組中miR-34a 高表達病人的30 d 累積生存率22 例（68.75%）低于miR-34a 低表達病人29 例（90.63%），差異有統計學意義（χ2=4.73，P=0.030）。Sirt1 高含量病人的30 d 累積生存率30 例（93.75%）高于Sirt1低含量病人21例（65.63%），差異有統計學意義（χ2=7.82，P=0.005）。

2.7 影響重癥肺炎病人預后的Cox回歸分析多因素分析結果顯示，ICAM-1、miR-34a及Sirt1均是影響重癥肺炎病人預后的獨立危險因素（P＜0.05）。見表6。

表6 重癥肺炎64例預后的影響因素Cox回歸分析

3 討論

重癥肺炎的病情危重且進展迅速，早期準確評估病情有助于及時進行危險分層及個體化防治，對改善預后、降低死亡率具有重要意義［7-9］。目前，重癥肺炎的發病機制尚不十分清楚，尋找炎癥反應關鍵的上游調控機制不僅有助于認識重癥肺炎的發病機制，也有助于發現重癥肺炎新的防治靶點及病情評估的標志物。

miR 能夠在轉錄后水平調節基因的表達，進而實現對多種生物學過程的調控，以miR 為切入點進行研究，不僅能夠為認識疾病的發病機制提供依據，還能為疾病的評估提供新的標志物［10-11］。已有研究證實，在重癥肺炎的發病過程中，病人外周血中存在多種miRs 表達的變化，提示miRs 可能是用于重癥肺炎病情評估的潛在分子［12-13］。吳舒懋等［5］的動物實驗提示miR-34a 的高表達參與重癥肺炎的發生及病情的加重。

本研究以外周血miR-34a 表達的變化為切入點，對重癥肺炎發病及病情的評估進行分析。在重癥肺炎及普通肺炎病人的外周血中miR-34a 均呈高表達，且重癥肺炎病人外周血miR-34a 的表達水平高于普通肺炎，提示在肺炎的發病過程中存在miR-34a 的表達增加且隨著病情從普通肺炎進展到重癥肺炎、miR-34a 的表達水平進一步增加。在重癥肺炎病人中進一步按照PSI 評估病情，隨著病情從低危發展至高危，病人外周血中miR-34a 的表達水平也呈增加趨勢，以上結果表明在重癥肺炎發生及病情加重的過程中存在miR-34a 的高表達，與重癥肺炎動物實驗中miR-34a表達變化的結果吻合。

既往研究表明，miR-34a 造成肺損傷的機制與靶向抑制Sirt1有關，其在干細胞衰老、T細胞免疫調節和非酒精性脂肪肝的發生過程中也對Sirt1 的表達具有靶向抑制作用［14-16］。Sirt1 是一種去乙酰化酶，在多種組織臟器損害的過程中通過抑制炎癥反應的激活起到保護作用［17］。本研究結果表明Sirt1含量降低與重癥肺炎的發生及病情加重有關。進一步進行相關性分析可知：重癥肺炎病人外周血miR-34a 的表達水平及血清中Sirt1 的含量具有負相關，提示在重癥肺炎發病的過程中miR-34a 可能靶向Sirt1發揮生物學作用。

在重癥肺炎的發病過程中，炎癥反應的級聯放大激活是重要的病理生理特征，涉及TNF-α、ICAM-1、IL-6、HMGB1等多種炎癥細胞因子的大量釋放［18-19］。本研究對不同miR-34a表達水平及Sirt1含量的重癥肺炎病人體內炎癥細胞因子進行了分析，結果表明miR-34a 表達增加及Sirt1 含量降低與重癥肺炎發病過程中多種炎癥細胞因子釋放增加有關。

重癥肺炎發病后炎癥反應的持續激活是造成預后不佳、病死率高的重要原因［7，20］。本研究對入組的64例重癥肺炎病人的預后進行了評估，入院后30 d死亡15例、累計死亡率23.44%。經分析可知：隨著miR-34a表達增加、Sirt1含量降低，重癥肺炎病人的30 d累積死亡率呈升高趨勢，表明miR-34a表達增加及Sirt1含量降低不僅與重癥肺炎病人的病情加重、炎癥反應激活有關，還與病人的預后有關，miR-34a及Sirt1的變化會造成30 d的累積死亡率增加。此外，危險因素分析顯示，ICAM-1、miR-34a及Sirt1均是影響重癥肺炎病人預后的獨立危險因素，進一步提示miR-34a 及Sirt1的變化與重癥肺炎病人30 d的預后有一定關系，二者均可作為反映預后的有效指標。

綜上所述，重癥肺炎病人外周血中miR-34a 表達增加與血清中Sirt1含量降低具有相關性，且miR-34a、Sirt1 的變化與病情加重、炎癥反應激活、預后惡化有關。今后，miR-34a 靶向Sirt1 有望成為研究重癥肺炎發病機制、防治及評估手段的新靶點。