藏紅花素通過跨膜受體蛋白/發狀分裂相關增強子1信號通路對缺氧誘導的視網膜神經節細胞凋亡的影響

王玉風，付珂，王洪亮

作者單位：南陽醫學高等?？茖W校第一附屬醫院眼科，河南 南陽473000

視網膜組織的缺氧性病變是引起常見眼部疾病如青光眼、糖尿病視網膜病和視網膜中央動脈阻塞的原因之一［1］。視網膜神經節細胞（retinal ganglion cells， RGCs）逐漸凋亡和視野缺損是視力障礙和失明的主要病理特征［2］。RGCs 位于視網膜內層，在視覺功能正常運行中起著重要作用，缺氧所致的視網膜損傷可以誘發RGCs 凋亡，嚴重時可導致病人失明［3］。藏紅花素提取自鳶尾科植物藏紅花柱頭的有效活性成分，具有活血化瘀、抗腫瘤和抗氧化等多種藥理作用［4］。發狀分裂相關增強子1（Hes-1）是細胞跨膜受體蛋白（Notch1）信號通路的靶基因，與神經元受損后修復有著密切關系。研究發現，藏紅花素可能通過調節Notch1∕Hes-1 信號通路對RGCs有神經保護作用，但其對RGCs 凋亡的影響研究較少［5］。本研究于2021年1月至2022年1月通過氯化鈷處理RGCs 建立缺氧模型，探討藏紅花素對缺氧誘導的RGCs細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料SD 大鼠視網膜神經節細胞系RGC-5 購于美國ATCC 公司。藏紅花素（陜西浩洋生物科技有限公司，貨號HY-798）；跨膜受體蛋白信號通路抑制劑（DAPT）（上海易恩化學技術有限公司，貨號A01906）；抗壞血酸（上海西格瑪奧德里奇貿易有限公司，貨號W210901）；β-肌動蛋白（β-actin）、B 細胞淋巴瘤因子2（Bcl-2）、Bcl-2 相關蛋白（Bax）和鈣依賴性蛋白酶家族1（Calpain1）多克隆抗體、山羊抗兔二抗IgG（美國Cell Signaling 公司）。FACS Verse 型流式細胞儀（美國Becton，Dickinson and Company）；DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 MTT 檢測細胞存活情況 采用MTT 實驗檢測不同濃度藏紅花素對RGC-5 細胞活力的影響，取對數生長期RGC-5 細胞200 μL，接種于96 孔板中，細胞濃度為1×104個∕毫升。分別給予0、5、10、25、50和100 μmol∕L 的藏紅花素處理細胞，細胞貼壁生長后，每孔加入10 μL MTT 溶液（5 g∕L），繼續培養4 h，加入二甲基亞砜溶液100 μL 振蕩10 min。酶標儀檢測各孔吸光值，計算細胞存活率。

1.2.2 缺氧模型建立 將RGC-5 細胞常規培養傳代，取第3 代對數生長期細胞用于實驗。參考文獻［6］用量，使用氯化鈷（COCl2）400 mmol∕L處理RGC-5細胞建立缺氧模型，MTT法檢測細胞存活率，細胞存活率約為50%，即接近半數致死濃度，模型建立成功。

1.2.3 細胞分組 缺氧模型建立成功的細胞分為缺氧組、藏紅花素組、陽性對照（抗壞血酸）組和藏紅花素+Notch1 信號通路抑制劑（DAPT）組，另設對照組。另提前配制好實驗所需的藏紅花素溶液和抗壞血酸溶液，備用。藏紅花素組在氯化鈷處理24 h 前使用含有25 μmol∕L 藏紅花素溶液的細胞培養液進行預處理，參考文獻［7-8］用量，陽性對照組在氯化鈷處理24 h 前使用20 μmol∕L 抗壞血酸溶液的細胞培養液進行預處理，藏紅花素+DAPT 組在氯化鈷處理24 h 前使用25 μmol∕L 藏紅花素和10 μmol∕L DAPT溶液的細胞培養液進行預處理，對照組為等量完全培養基。

1.2.4 MTT 法檢測細胞存活情況 將對數生長期RGC-5 細胞使用胰蛋白酶消化重懸，接種于96 孔板中，每孔約1×104個細胞，按“1.2.2”所述進行藥物干預，參照“1.2.1”的方法檢測細胞存活率。

1.2.5 細胞凋亡率檢測 胰蛋白酶消化RGC-5 細胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗2 次，重懸細胞制備細胞懸液，濃度調整為5×105個∕毫升，細胞接種于6 孔板中，按“1.2.2”所述進行藥物干預。離心收集細胞于離心管中，PBS溶液清洗，每孔加入異硫氰酸熒光素標記的膜粘連蛋白液5 μL和碘化丙啶染液5 μL，混勻，避光孵育15 min，上機檢測。

1.2.6 Flou-4染色檢測細胞鈣離子水平 將RGC-5細胞制成單細胞懸液，密度為1×106個∕毫升，以每孔200 μL 的量接種于6 孔板中，按照“1.2.1”所述給藥后，常規培養24 h 后。取適量鈣熒光探針Fuo-4AM母液用PBS配制成5 μmol的工作液，取出6孔板，每孔加入稀釋后的Fuo-4AM工作液2 mL，于37 ℃孵育30 min，棄去上清液，預冷PBS洗滌細胞2次，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7 RT-PCR 檢測mRNA 表達 取按照“1.2.2”所述進行藥物干預后的各組RGC-5 細胞，通過Trizol一步沉淀法提取總RNA，檢測各組細胞跨膜受體蛋白（Notch1）、發狀分裂相關增強子1（hairy division related enhancer 1，Hes-1）mRNA 表達情況。使用逆轉錄試劑盒獲得cDNA。配制PCR 反應體系進行擴增，設置PCR 反應條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火55 s，72 ℃延伸50 s，共進行40次循環，根據2-ΔΔCt法計算目的基因與內參基因的相對表達量。引物設計：Notch1 正向5′GATGGCCTCAATGGGTACAAG3′，反向5′TCGTTGTTGTTGATGTCACAGT3′；Hes-1 正向5′TCAACACGACACCGGACAAAC3′，反向5′ATGCCGGGAGCTATCTTTCTT 3′；β-actin 正 向5′GTGACGTTGACATCCGTAAAGA3′，反向5′GCCGGACTCATCGTACTCC3′。

1.2.8 蛋白質印跡法檢測蛋白表達 取按照“1.2.2”所述進行藥物干預后的各組RGC-5 細胞，裂解提取總蛋白，BCA 檢測盒測定蛋白濃度。取40 μg蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，并將分離膠上的蛋白濕轉至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST 溶液清洗。ECL 法顯色，凝膠成像系統顯影，Image J 分析蛋白條帶灰度值，計算各組相對蛋白表達量。

1.3 統計學方法SPSS 23.0軟件進行數據分析，細胞活力、細胞凋亡率、細胞內鈣離子水平、Notch1 和Hes-1mRNA 表達水平以及Bcl-2、Bax 和Calpain1 蛋白表達水平相關數據以±s表示，多樣本間比較采用One-way ANOVA 進行分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 藏紅花素對細胞活力的影響與0 μmol∕L 藏紅花素組比較，5、10、25、50 和100 μmol∕L 藏紅花素組細胞存活率明顯降低（P＜0.001）。藏紅花素濃度小于25 μmol∕L 時對RGC-5 細胞無明顯毒性，后續實驗藏紅花素選擇25 μmol∕L 作為統一給藥濃度。見表1。

表1 各組培養的SD大鼠視網膜神經節細胞存活情況比較∕（%， ± s）

表1 各組培養的SD大鼠視網膜神經節細胞存活情況比較∕（%， ± s）

注：①與0 μmol∕L藏紅花素組比，P＜0.05。②與5 μmol∕L藏紅花素組比，P＜0.05。③與10 μmol∕L藏紅花素組比，P＜0.05。④與25 μmol∕L藏紅花素組比，P＜0.05。⑤與50 μmol∕L藏紅花素組比，P＜0.05。

細胞存活率100.00±0.00 98.72±0.88 93.67±1.26①②82.55±1.75①②③70.13±3.45①②③④55.94±3.78①②③④⑤144.70＜0.001組別0 μmol∕L藏紅花素組5 μmol∕L藏紅花素組10 μmol∕L藏紅花素組25 μmol∕L藏紅花素組50 μmol∕L藏紅花素組100 μmol∕L藏紅花素組F值P值鼠數3 3 3 3 3 3

2.2 各組細胞存活、凋亡情況及細胞鈣離子水平比較與對照組比較，缺氧組細胞存活量明顯降低（P＜0.001）。與缺氧組比較，藏紅花素組細胞存活量升高（P=0.002）。與藏紅花素組比較，藏紅花素+DAPT組細胞存活量降低（P=0.005）。與陽性對照組比較，藏紅花素組細胞存活量差異無統計學意義（P=0.512）。

與對照組比較，缺氧組細胞凋亡率明顯升高（P＜0.001）。與缺氧組比較，藏紅花素組細胞凋亡率降低（P＜0.001）。與藏紅花素組比較，藏紅花素+DAPT組細胞凋亡率升高（P=0.001）。與陽性對照組比較，藏紅花素組細胞凋亡率差異無統計學意義（P=0.141）。

與對照組比較，缺氧組細胞鈣離子水平明顯升高（P＜0.001）。與缺氧組比較，藏紅花素組細胞鈣離子水平降低（P＜0.001）。與藏紅花素組比較，藏紅花素+DAPT 組細胞鈣離子水平升高（P=0.001）。與陽性對照組比較，藏紅花素組細胞鈣離子水平差異無統計學意義（P=0.463）。見表2；圖1，2。

圖1 流式細胞儀檢測各組培養的SD大鼠視網膜神經節細胞凋亡情況圖2 Flou-4檢測培養的SD大鼠視網膜神經節細胞鈣離子水平（Flou-4 AM×200）

表2 各組培養的SD大鼠視網膜神經節細胞活力比較∕ ± s

表2 各組培養的SD大鼠視網膜神經節細胞活力比較∕ ± s

注：①與對照組比，P＜0.05。②與缺氧組比，P＜0.05。③與藏紅花素組比，P＜0.05。

光密度值∕［D（λ）］1.00±0.00 0.45±0.04①0.83±0.08②0.50±0.06③0.88±0.09 45.05＜0.001細胞凋亡率∕%4.32±0.42 51.82±5.36①17.92±1.21②36.50±3.50③15.36±2.10 113.39＜0.001熒光強度0.23±0.03 0.76±0.05①0.27±0.04②0.65±0.05③0.24±0.05 97.12＜0.001組別對照組缺氧組藏紅花素組藏紅花素+DAPT組陽性對照組F值P值鼠數3 3 3 3 3

2.3 Notch1/Hes-1 通路mRNA 水平比較與對照組比較，缺氧組細胞Notch1、Hes-1mRNA 表達水平明顯升高（均P＜0.001）。與缺氧組比較，藏紅花素組細胞Notch1、Hes-1mRNA 表達水平降低（均P＜0.001）。與藏紅花素組比較，藏紅花素+DAPT 組細胞Notch1、Hes-1mRNA 表 達 水 平升 高（P=0.013，0.001）。與陽性對照組比較，藏紅花素組細胞Notch1、Hes-1 mRNA表達水平差異無統計學意義（P=0.425，0.248）。見表3。

表3 各組培養的SD大鼠視網膜神經節細胞Notch1∕Hes-1通路mRNA水平比較∕ ± s

表3 各組培養的SD大鼠視網膜神經節細胞Notch1∕Hes-1通路mRNA水平比較∕ ± s

注：Notch1為跨膜受體蛋白，Hes-1為發狀分裂相關增強子1。①與對照組比，P＜0.05。②與缺氧組比，P＜0.05。③與藏紅花素組比，P＜0.05。

Hes-1 0.35±0.03 0.91±0.09①0.39±0.04②0.76±0.07③0.34±0.05組別對照組缺氧組藏紅花素組藏紅花素+DAPT組陽性對照組例數3 3 3 3 3 Notch1 0.40±0.04 0.82±0.08①0.44±0.06②0.65±0.06③0.40±0.05 59.04 P值 ＜0.001＜0.001 F值29.59

2.4 凋亡蛋白與鈣依賴性蛋白水平比較與對照組比較，缺氧組細胞Bcl-2 蛋白表達水平降低（P＜0.001），Bax 和Calpain1 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.001，P＜0.001）。與缺氧組比較，藏紅花素組細胞Bcl-2 蛋白表達水平升高（P＜0.001），Bax 和Calpain1蛋白表達水平明顯降低（P＜0.001，P＜0.001）。與藏紅花素組比較，藏紅花素+DAPT 組細胞Bcl-2 蛋白表達水平降低（P=0.005），Bax 和Calpain1 蛋白表達水平明顯升高（P=0.004，P=0.004）。與陽性對照組比較，藏紅花素組細胞Bcl-2、Bax 和Calpain1 蛋白表達水平差異無統計學意義（P=0.533，P=0.800，P=0.617）。見表4，圖3。

圖3 各組培養的SD大鼠視網膜神經節細胞凋亡蛋白表達水平檢測

表4 各組培養的SD大鼠視網膜神經節細胞蛋白水平比較∕ ± s

表4 各組培養的SD大鼠視網膜神經節細胞蛋白水平比較∕ ± s

注：Bcl-2 為B 細胞淋巴瘤因子2，Bax 為Bcl-2 相關X 蛋白，Calpain1為鈣依賴性蛋白酶家族1。①與對照組比，P＜0.05。②與缺氧組比，P＜0.05。③與藏紅花素組比，P＜0.05。

Calpain1 0.26±0.03 0.69±0.04①0.30±0.05②0.55±0.05③0.32±0.04 57.58＜0.001組別對照組缺氧組藏紅花素組藏紅花素+DAPT組陽性對照組F值P值例數3 3 3 3 3 Bcl-2 0.67±0.07 0.28±0.03①0.56±0.07②0.32±0.03③0.53±0.03 33.08＜0.001 Bax 0.35±0.02 0.89±0.09①0.43±0.04②0.71±0.07③0.42±0.05 45.43＜0.001

3 討論

RGCs 細胞是視網膜重要結構之一，對氧環境十分敏感，而在缺氧微環境下，RGCs 細胞易發生凋亡［8］。研究表明，缺氧是導致RGCs細胞凋亡的主要原因之一［9］。近年來，部分研究表明，導致RGCs 凋亡的因素多是通過信號傳導影響RGCs 細胞凋亡信號通路控制凋亡相關基因表達實現的［10］。因此，研究RGCs 細胞凋亡機制，不斷開發新型藥物，尋找作用靶點對視功能恢復臨床治療有著重大意義。

藏紅花又名西紅花、番紅花，是傳統中藥材之一，具有涼血解毒、清肝明目和利尿等功效［11-12］。據報道，藏紅花素能夠抑制缺氧誘導的視網膜色素上皮細胞異常增殖，具有保護視力的藥理作用［13］。另有研究發現，藏紅花素可降低炎性因子水平保護視網膜缺血再灌注小鼠的RGC［14］。本研究結果顯示，在MTT 實驗中，采用不同濃度的藏紅花素（0、5、10、25、50 和100 μmol∕L）作用于RGC-5 細胞后，各組細胞活性均明顯降低，且呈現濃度依賴性。當藏紅花素濃度 小 于25 μmol∕L 時對RGC-5 細 胞 無 明顯毒性，因此后續實驗選擇25 μmol∕L作為藏紅花素統一給藥濃度。藏紅花素組與缺氧組比較，細胞活力明顯增加，且細胞凋亡率呈下降趨勢，但這一趨勢又在添加了DAPT 后受到影響。提示藏紅花素能夠抑制缺氧的RGC-5 細胞凋亡，對RGC-5 細胞具有保護作用，且藏紅花素對RGC-5 細胞的保護作用會受到Notch1 信號通路抑制劑的影響。研究發現，藏紅花素對谷氨酸鹽誘導的RGC-5 細胞凋亡也具有明顯的抑制作用［15］，進一步證實藏紅花素對RGC-5 細胞的保護作用。

在本研究中，與缺氧組比較，藏紅花素組RGC-5細胞Notch1、Hes-1 基因表達水平降低，且抑凋亡蛋白Bcl-2 表達水平明顯升高，促凋亡蛋白Bax 蛋白表達降低，且細胞內鈣離子水平與鈣依賴性Calpain1蛋白表達均呈降低趨勢。Notch1∕Hes-1 信號通路是典型的鈣依賴性細胞凋亡信號通路之一，Notch1 是Notch 家族成員之一，參與著神經元生長與發育，在神經受損后的修復再生過程中起著重要作用［16-17］。Notch1 信號激活主要通過位于胞膜的受體與Notch配體結合，當Notch1 上調時，可促進其下游基因Hes-1表達，同時抑凋亡蛋白Bcl-2表達下調，促凋亡蛋白Bax 蛋白水平升高，誘導細胞凋亡［18］。當細胞外大量鈣離子內流，胞內鈣離子水平異常升高，鈣依賴性蛋白酶表達升高，鈣依賴性凋亡信號通路Notch1∕Hes-1被激活，促使RGC-5細胞凋亡［19-20］。在本研究中，藏紅花素組細胞鈣離子水平明顯降低，且鈣依賴性Calpain1蛋白表達下調，而添加了DAPT后，鈣離子水平與鈣依賴性Calpain1 蛋白表達又逐漸上升。說明藏紅花素可能是通過抑制鈣離子內流，阻滯了Notch1∕Hes-1信號通路，上調抑凋亡蛋白Bcl-2表達水平，抑制RGC-5細胞凋亡。

綜上所述，藏紅花素對體外培養的缺氧RGC-5細胞凋亡有一定的抑制作用，可能是通過抑制鈣離子內流，阻滯Notch1∕Hes-1通路，提高細胞內抑凋亡蛋白Bcl-2 表達水平發揮作用。本研究屬于RGCs凋亡機制的基礎研究，雖然很多證據顯示Notch1∕Hes-1 信號通路對神經節細胞存活起到調節作用，但實驗仍存在許多局限性和不足之處。首先本研究僅以細胞作為研究對象，缺乏動物實驗數據的佐證。其次對于信號通路的研究過于淺顯，需要繼續深入探討Notch1∕Hes-1 信號通路在RGCs 凋亡中的作用，因此本研究需要進一步補充和完善。

（本文圖1，2見插圖1-3）