巖藻多糖酶產生菌的篩選及其酶解產物的結構表征、抗氧化研究

楊柳,顧秋亞,王聰聰,李熙文,余曉斌

(江南大學 生物工程學院,工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇 無錫,214122)

巖藻多糖也稱褐藻糖膠、巖藻聚糖硫酸酯、褐藻多糖硫酸脂等,是一類來自于褐藻的純天然、陰離子型[1]水溶性雜多糖,主要由含硫酸基的巖藻糖[2]組成,并伴有少量的半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖、糖醛酸[3]等,這種獨特的化學結構賦予其抗腫瘤[4-5]、抗氧化[6]、降血脂[7]、抗炎[8]、抗凝血[9]、促益生菌[10]等生物活性。巖藻多糖作為一種性能優良、功效獨特的海洋源[11]健康產品,其豐富的生理活性能夠有效提高人類健康水平,基于巖藻多糖在生命健康領域中的應用價值,開展研究其功能和應用具有重要的意義。

巖藻多糖作為一種大分子雜多糖,存在分子質量大、溶解性差、不容易被吸收等問題,嚴重制約了其應用。而以巖藻多糖為原料生產的低分子質量巖藻多糖(low molecular weight fucoidan,LMWF)具有黏度低、溶解性好、易吸收等優點,表現出較好的生物利用性。LMWF往往通過化學降解法[12]和生物降解法獲得,其中化學降解反應條件劇烈、活性物質易被破壞、產物分離純化難,限制了其應用和發展。生物降解法主要指酶降解法,目前常用的酶為巖藻多糖酶[13],酶降解條件溫和、催化效率高、分子質量易于控制,不會破壞多糖本身結構,可形成生物相容的活性產物,因此酶水解制備LMWF是當前最理想的制備方法,擁有廣闊的應用前景。

然而酶降解亦存在成本高、工業化生產難度大等缺點,故建立高效的產酶菌株篩選方法,篩選一株低成本、酶活性高的菌株是當前的研究之重。目前常用于巖藻多糖酶產生菌篩選的檢測方法多為還原糖法、碳水化合物-聚丙烯酰胺凝膠電泳[14]以及對羥基苯甲酰肼法[15]。本研究首次利用高效凝膠滲透色譜法(high performance gel permeation chromatography,HPGPC),從茶葉中篩選得到一株具有巖藻多糖酶活性的菌株,豐富了巖藻多糖酶產生菌的來源,為巖藻多糖酶產生菌的篩選提供了新思路。另外制備了低于10 kDa的LMWF,分析了其結構特點,以及分子質量大小與特定的生物活性之間的關系,為LMWF的研究和應用提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

茶葉購自市場,菌株分離自茶葉。

1.1.2 試劑

1.2 儀器與設備

ZHJH-C1115B超凈工作臺,上海智誠分析儀器制造有限公司;高壓滅菌鍋,美國致微儀器有限公司;SPX-250-Z恒溫培養箱,上海躍進醫療器械廠;7GI-16M高速冷凍離心機、ICS-5000離子色譜儀,美國賽默飛世爾科技公司;1260高效液相色譜儀,美國安捷倫科技公司;NEXUS傅里葉變換紅外光譜儀,美國尼高力儀器公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養基配制

改良PDA培養基(g/L):馬鈴薯200、茶葉25、蔗糖40、瓊脂20,pH自然。

篩選培養基(g/L):巖藻多糖10、NH4NO32、MgSO40.05、瓊脂20、青霉素0.05,pH自然。

固態發酵培養基(250 mL搖瓶):麩皮10 g、巖藻多糖0.3 g、UP水8 mL,pH 6.0。

上述培養基均在115 ℃滅菌30 min。

1.3.2 菌株篩選

取10 g黑毛茶溶于100 mL無菌水中,30 ℃搖床振蕩培養4 h。取1 mL培養液進行10倍梯度稀釋,吸取200 μL稀釋液(10-1～10-7)涂布于篩選培養基上,30 ℃培養3～6 d,挑取生長良好、形態不同的單菌落進行分離純化。所得菌株劃線于改良PDA平板,30 ℃培養4 d。使用內含玻璃珠的無菌水將其制備成孢子數量為106個/mL的孢子懸液[16],吸取200 μL接種至固態發酵培養基中,于30 ℃恒溫培養箱中靜置培養4 d。發酵結束后向固態培養基中加入50 mL檸檬酸-檸檬酸鈉(0.1 mol /L、pH 6.0)緩沖液攪拌均勻,4 ℃浸提12 h,浸提后的酶液用紗布過濾,濾液離心(8 000 r/min、15 min)后獲得的上清液即為發酵粗酶液。

使用0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)將粗酶液稀釋至適當濃度,分別取25 mL稀釋后粗酶液與25 mL 1%巖藻多糖溶液(0.1 mol /L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,pH 6.0)混合均勻,50 ℃反應24 h后,沸水浴10 min終止反應。冷卻后向其中添加1/4體積的Sevage[17][V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1]溶液除蛋白,充分振搖30 min后去除有機相,重復操作多次至蛋白完全去除。減壓濃縮去除殘留有機溶液,使用500 Da透析袋低溫透析48 h除鹽,后減壓濃縮至5 mL;取1 mL樣品用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌,通過HPGPC測定其重均分子質量(Mw)。在同一酶解條件下,酶解產物中LMWF相對含量越高證明其酶活力越大。

1.3.3 菌株鑒定

形態特征:將菌株接種于改良PDA培養基上,30 ℃培養4 d,選取生長狀態良好的單菌落觀察形態,并置于光學顯微鏡和電子顯微鏡下觀察孢子形態。

系統發育分析:將培養4 d的含菌平板送至上海生工生物工程有限公司測定其ITS全序列,測序結果于NCBI數據庫進行BLAST比對,比對結果利用MEGA7構建系統發育樹[18],確定其生物學種屬。

1.3.4 LMWF制備

實驗前進行酶解工藝優化[19],分別優化了酶解反應溫度(40、45、50、55、60 ℃);底物質量濃度(5、10、15、20、25 g/L);反應pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0);以及最適反應時間(6、12、24、36、48 h)。在最佳酶解條件(50 ℃、1.5%、pH 6.0、36 h)下擴大反應體系,反應結束后煮沸滅活酶液,并進行除蛋白除鹽操作,后用10 kDa超濾管超濾分級,收集低于10 kDa的組分,減壓濃縮至適宜的體系,過0.22 μm的微孔濾膜除菌,冷凍干燥后存放于真空干燥皿待用。

1.3.5 巖藻多糖和LMWF初級結構表征

1.3.5.1 硫酸基團(SO42-)含量測定

采用BaCl2-明膠比濁法[20]測定硫酸基團含量。分別稱取2種巖藻多糖樣品0.05 g于具塞試管中,加入5 mL HCl(1 mol/L),在121 ℃下水解5 h,取0.1 mL水解液待測。標準曲線:稱取烘干至恒重的K2SO4217.5 mg,以HCl(1 mol/L)溶解并定容至100 mL,搖勻得硫酸根標準液(1.2 mg/mL),硫酸根標準溶液用1 mol/L的HCl溶液稀釋至不同濃度,吸取50 μL于試管中,向其中加入200 μL BaCl2-明膠溶液、750 μL三氯乙酸溶液并混勻,室溫下靜置反應25 min,測定360 nm下的吸光度。

1.3.5.2 單糖組成分析

參考俞所銀等[21]的方法,取5 mg樣品于指定容器中然后加入300 μL 2 mol/L的三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA),于100 ℃金屬浴反應8 h;冷卻至室溫后用氮吹儀吹干,添加300 μL甲醇再次吹干,重復上述步驟多次,直至TFA完全除去。然后加入25 mL超純水溶解殘余物,稀釋10倍后過0.22 μm微孔濾膜除菌,使用離子色譜儀進行色譜分析。分析柱Carbo Pac PA20,流動相:A(超純水)、B(0.25 mol/L NaOH);流速0.5 mL/min;柱溫30 ℃;檢測器為脈沖安培檢測器;進樣體積20 μL。分別檢測樣品和1 mg/mL(巖藻糖、氨基半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸)的單糖標準品。

1.3.5.3 分子質量的測定

使用HPGPC測定樣品重均分子質量,將待測多糖配成10 mg/mL的樣品,過0.22 μm微孔濾膜除菌。色譜柱為UltrahydrogelTMLinear(300 mm×7.8 mm id×2),流動相為0.1 mol/L NaNO3,流速0.9 mL/min,柱溫45 ℃,檢測器為示差檢測器;進樣體積20 μL。標準曲線:將已知分子質量的葡聚糖標準品(DextrantT系列)配為10 mg/mL的標準溶液,經HPGPC檢測后,以保留時間為橫坐標、重均分子質量的對數(lgMw)為縱坐標建立回歸方程。

1.3.5.4 傅里葉變換紅外光譜分析

將待測多糖烘干至恒重,取10 mg左右樣品于傅里葉變換紅外光譜儀[22]進行紅外掃描,采用全反射法,掃描區域為4 000～500 cm-1。

1.3.6 抗氧化活性測定

將待測多糖配制成適宜濃度的樣品溶液,按照測試試劑盒中的說明書分別測定巖藻多糖和LMWF的·OH、DPPH自由基清除能力,以及FRAP。

1.4 數據統計分析

結果報告為平均值±標準偏差(n=3),數據采用Origin 2021繪圖。

2 結果與分析

2.1 巖藻多糖酶產生菌的篩選與鑒定

2.1.1 菌株篩選

以巖藻多糖為唯一碳源,共從茶葉中篩選獲得真菌23株,經過分離純化,選取7株生長較快、形態特征不一的菌株轉接至改良PDA培養基進行固態發酵,30 ℃培養4 d后,利用其粗酶液在50 ℃下酶解巖藻多糖24 h,使用HPGPC法對酶解產物進行檢測。結果如圖1所示,橫坐標為出峰時間,隨著出峰時間的延長分子質量由大變小,因此大分子質量的多糖先被檢測到;縱坐標為電壓響應值,電壓響應值大小與其樣品濃度呈正相關,即樣品中同一聚合度的多糖濃度越高電壓響應值越大。表1中面積百分占比為其相對含量占比。水解前巖藻多糖分子質量為277 kDa,無LMWF存在。如圖1所示,菌株JH-5酶解產物出峰時間最晚,說明其中LMWF占比較多,相對含量為59.4%(表1),除了菌株JH-1酶解產物中未檢測到LMWF,余下菌株酶解產物中LMWF相對含量均在10%左右,說明其中只有少數巖藻多糖被水解,菌株發酵粗酶液酶活力較低。此外,分散系數(Mw/Mn)用來衡量多聚物分子質量分布的分散程度,當分散系數為1時,表明聚合物是由均一分子質量的聚合物組成的,分散系數越大,表明聚合物的分子質量分布范圍越寬。菌株JH-5來源的巖藻多糖酶水解產物分散系數為2.15,表明聚合物LMWF鏈長差距較大,分子質量分布范圍相對較寬。在相同的酶解條件下,菌株JH-5來源的巖藻多糖酶的酶解產物中LMWF相對含量最高,因此確定菌株JH-5為出發菌株進行后續研究。

圖1 菌株發酵粗酶液酶解巖藻多糖的HPGPC分析Fig.1 HPGPC analysis of fucoidan hydrolyzed by crude enzyme solution fermented by strain

表1 產物中LMWF的分子質量及占比Table 1 Molecular weight and proportion of LMWF in products

2.1.2 菌株鑒定

如圖2-a所示,菌株JH-5于改良PDA固體培養基上生長4 d后,觀察到其菌落呈現為橢圓形,表面粉末狀,顏色有數環;菌落隨生長時間的增加,從內向外依次呈綠色、黃色,邊緣為新生菌落,呈白色絲絨狀,產孢囊孢子。通過光學顯微鏡可以觀察到多個傘狀孢囊孢子(圖2-b);通過掃描電子顯微鏡(圖2-c)可以觀察到,菌株JH-5的分生孢子頂部膨大成孢囊,分生孢子呈輻射狀孢子鏈,孢子鏈有隔。根據其形態特征,初步鑒定為曲霉屬(Aspergillussp.)。

a-菌落形態;b-光學顯微鏡下孢囊孢子形態; c-電子顯微鏡下孢囊孢子形態圖2 JH-5的菌落及顯微鏡下的孢子形態Fig.2 Colony and microscopic spore morphology of JH-5

系統發育分析:將培養4 d的含菌平板送至上海生工生物工程有限公司進行ITS測序,測序結果在NCBI 數據庫中進行BLAST比對,將對比結果通過MEGA7軟件構建系統發育樹(圖3)。綜合形態學和分子生物學的鑒定結果,菌株JH-5被鑒定為Aspergillusamstelodami。

圖3 菌株JH-5的系統發育進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain JH-5

2.2 巖藻多糖和LMWF的初級結構表征

2.2.1 硫酸基團含量測定

巖藻多糖主要是由含有硫酸基的巖藻糖構成的水溶性多糖,其分子結構的主要成分是L-巖藻糖和硫酸基,ZAYED等[23]研究發現硫酸基結構和含量與其活性密切相關,因此有必要檢測產物的硫酸基變化。水解前巖藻多糖硫酸基團含量為(33.0±0.3)%,水解后的LMWF硫酸基團含量為(32.4±0.9)%,表明在水解過程中硫酸基損失較小,來源于菌株JH-5的巖藻多糖酶可以溫和地降解巖藻多糖,水解后的產物LMWF不會因為硫酸基變化而影響其生物活性。

2.2.2 單糖組成分析

利用離子色譜測定F、LMWF的單糖組成。結果如表2所示,F主要由巖藻糖和半乳糖組成,此外還含有少量的木糖和葡萄糖醛酸,表明巖藻多糖是由多種單糖組成的非均一性雜多糖[24],其單糖組成符合裙帶菜來源的巖藻多糖成分特征[25]。對酶解產物LMWF的單糖組成進行檢測,其中的巖藻糖的摩爾百分含量相較于F略有下降,半乳糖和葡萄糖醛酸的摩爾百分含量略有升高,木糖的摩爾百分含量無明顯變化,表明水解產物的單糖組成和含量相對穩定,不會因為組分的變化而過多的影響其生物活性。

表2 F和LMWF的單糖摩爾百分比Table 2 Molar percentage of monosaccharide in F and LMWF

2.2.3 分子質量的測定

使用HPGPC法測定F、LMWF的分子質量。結果如圖4所示,F的分子質量為277 kDa,LMWF的分子質量為2 997 Da,分散系數為2.7(表3),表明該聚合物中LMWF鏈長差距大,分子質量分布范圍相對較寬,表明酶解產物LMWF是非均一性的多糖。

圖4 F和LMWF的HPGPC分析Fig.4 HPGPC analysis of F and LMWF

表3 F和LMWF的分子質量Table 3 Molecular weight of F and LMWF

2.2.4 傅里葉變換紅外光譜分析

如圖5所示,F在3 391 cm-1處的吸收峰是—OH的伸縮振動,在2 934 cm-1附近有小吸收峰,是由C—H 的伸縮振動引起的,1 633 cm-1處的吸收峰表明存在羧基的C—O鍵振動,1 376 cm-1吸收峰屬于δ-CH2的彎曲振動,1 217 cm-1處的吸收峰是C—O—C的伸縮振動引起的,1 017 cm-1處的峰表明存在吡喃糖環,826 cm-1處是α-糖苷鍵的吸收峰。LMWF在3 405 cm-1的寬吸收峰是—OH的伸縮振動引起的,2 935 cm-1處的吸收峰是由于C—H的伸縮振動,1 637 cm-1的吸收峰由于羧基的C—O鍵存在引起的,1 372 cm-1處的吸收峰屬于δ-CH2的彎曲振動,1 225 cm-1和1 148 cm-1處的吸收峰歸因于C—O—C的伸縮振動,1 019 cm-1屬于吡喃糖環的吸收峰,824 cm-1處是α-糖苷鍵的吸收峰。2種多糖在890 cm-1處均沒有特征吸收峰,說明不存在β-糖苷鍵,2種多糖均以α-糖苷鍵為主,符合巖藻多糖糖苷鍵的結構類型。圖中顯示樣品在1 550 cm-1附近沒有吸收峰,不存在酰胺鍵(—CO—NH—C—),表示樣品中的蛋白質去除比較徹底。

圖5 F和LMWF的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.5 FTIR patterns of F and LMWF

2.3 抗氧化活性測定

如圖6所示,各樣品隨著濃度上升其抗氧化能力呈現不斷上升的趨勢,并表現出一定的濃度依賴性。當樣品濃度較低時,F和LMWF清除活性差異較小;隨著濃度的增加,LMWF抗氧化活性快速增長,與F的差距逐漸加大,優勢變得明顯。LMWF具有明顯優于未水解巖藻多糖的抗氧化活性,表明抗氧化活性受巖藻多糖分子質量影響較大,其分子質量與生物活性功能之間存在著一定的關系。

a-·OH清除能力;b-DPPH自由基清除能力;c-FRAP圖6 F和LMWF的抗氧化活性Fig.6 Antioxidant activity of F and LMWF

3 結果與討論

利用HPGPC檢測酶解產物分子質量的變化,建立了一種新的巖藻多糖酶產生菌篩選的檢測方法,為后續巖藻多糖酶產生菌的篩選提供了新的方向。對發酵粗酶液酶解制備的LMWF結構解析表明,該酶可以溫和穩定地水解巖藻多糖,不會破壞產物的結構以及有效活性成分。對水解前后巖藻多糖的抗氧化研究結果顯示,LMWF對于清除·OH、DPPH自由基,以及FRAP明顯高于巖藻多糖,并隨著濃度的增加差異逐漸增大,表明其抗氧化活性受分子質量影響巨大,突出了LMWF的應用潛力,未來可用于具有抗氧化功能的保健品以及食品加工生產中的功能性成分。后續對巖藻多糖的研究,應繼續探究其結構與生物活性之間的關系,闡明其作用機制,為巖藻多糖的開發和利用提供更多的理論依據。