小白鏈霉菌全細胞轉化L-賴氨酸合成ε-聚賴氨酸的體系構建與優化

朱道君,刁文嬌,張佳微,王靚,張宏建,張建華,陳旭升*

1(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)2(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122)

ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是25～35個L-賴氨酸單體通過α—COOH和ε—NH2縮合形成的一種天然抗菌肽[1]。因其具有廣譜抑菌性,在食品防腐領域被廣泛研究和應用[2]。另外,它也同樣活躍于藥物載體、基因載體和新材料等領域,具有廣泛的應用前景[3]。

ε-PL目前通過小白鏈霉菌(Streptomycesalbulus)好氧發酵進行工業化生產。以往研究表明,通過發酵過程優化與調控是提升ε-PL生產效率的有效方法。例如,KAHAR等[4]建立了一種分階段pH值調控策略,在5 L發酵罐的補料分批發酵中實現S.albulusS410的ε-PL產量達到48.30 g/L。REN等[5]提出了一種利用pH沖擊提高ε-PL發酵水平的策略,實現5 L發酵罐ε-PL產量達到54.70 g/L;另外,WANG等[6]利用新選育的高產突變株S.albulusR6,采用pH沖擊工藝,實現ε-PL產量突破70.00 g/L。盡管上述發酵策略實現ε-PL產量大幅提升,但存在底物(葡萄糖或甘油)轉化率低(10%左右)的問題。利用葡萄糖或甘油做碳源從頭合成ε-PL約需要26步胞內生化反應以及眾多支路代謝,這可能是轉化率低的重要原因。L-賴氨酸是ε-PL合成前體[7],若能實現轉化外源L-賴氨酸合成ε-PL將有望解決轉化率低的問題,目前尚未見報道。然而,眾多研究者探究了外源L-賴氨酸添加對ε-PL發酵的影響。例如,HIROHARA等[8]在培養基中添加11 mmol/LL-賴氨酸可使S.lydicusUSE-11的ε-PL產量提升約12.5%,而對Streptomyscessp.USE-51則沒有效果。LIU等[9]在培養基中添加3 mmol/LL-賴氨酸使得StreptomycesahygroscopicusGIM8的ε-PL產量從0.78 g/L 提升到1.16 g/L,但L-賴氨酸消耗較小,僅約為2.0 mmol/L(約0.29 g/L)。LI等[10]也發現在培養基中添加1.00 g/LL-賴氨酸可使Streptomycesdiastatochromogenes6#-7的ε-PL產量提升49.0%。本團隊CHEN等[11]在搖瓶中添加2.00 g/LL-賴氨酸使得S.albulusM-Z18的ε-PL產量提升105%,但L-賴氨酸的消耗僅約為0.9 g/L;在5 L發酵罐的補料分批發酵中,從72 h維持1 g/LL-賴氨酸使得ε-PL產量達到37.60 g/L,較對照提升了6.2%。上述研究結果表明,發酵過程中添加外源L-賴氨酸對大部分的ε-PL生產菌有積極作用,但均存在L-賴氨酸利用量低(<2.0 g/L)或ε-PL產量提升不顯著(<10%)的問題,說明通過在發酵體系中直接添加L-賴氨酸對提升ε-PL生產效率作用有限。

全細胞轉化法是一種利用菌體細胞作為催化劑進行催化的生物合成方法,其本質仍是胞內酶的催化作用。與純酶催化相比,全細胞轉化法生產成本低且擁有完整的酶體系,可在降低生產成本的同時提高催化效率,已被廣泛應用于(R)-檸蘋酸[12]、膽綠素[13]、D-甘露醇[14]等眾多生物制品的生產。基于此,本文以一株ε-PL工業生產菌株S.albulusGS114為研究對象,提出了全細胞轉化法生產ε-PL的新方法,并對轉化培養基和條件進行了系統優化,在最優體系中實現了S.albulusGS114轉化L-賴氨酸大量合成ε-PL。同時,借助合成生物學技術,構建了攜帶L-賴氨酸特異性通透蛋白基因lysp[15]的工程菌,進一步提升了全細胞轉化L-賴氨酸能力和ε-PL生產效率。研究結果一方面說明了通過全細胞轉化L-賴氨酸生產ε-PL是可行的,另一方面為S.albulus轉化大宗氨基酸L-賴氨酸生產高值ε-PL奠定了堅實的技術基礎,具有重要的理論意義和經濟價值。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

本研究所用的菌株和質粒如表1所示。其中S.albulusM-Z18由本實驗室保藏,S.albulusGS114由M-Z18誘變而來[18]。大腸桿菌(Escherichiacoli) DH5α用作克隆宿主,E.coliET12567/pUZ8002在接合轉移中用作穿梭載體。整合型質粒pIB139用于過表達菌株的構建。

表1 本研究所用菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.2 引物

本研究所用引物及其序列如表2所示。

表2 本研究所用引物Table 2 Sequence of primers used in this study

1.3 試劑與儀器

ClonExpress?MultiS One Step Cloning Kit、2×Phanta?Max Master Mix,南京諾唯贊生物科技有限公司;限制性內切酶、基因組提取試劑盒、片段純化試劑盒和質粒提取試劑盒,大連TaKaRa公司;Trizol總RNA抽提試劑盒、卡那霉素(Kana)、安普霉素(Am)、氯霉素(Cm)、萘啶酮酸(Nal)、50×TAE緩沖液,上海生物工程股份有限公司;其他試劑均為國產或進口分析純。

BIOTECH-5BG-7000APCR儀、Gel Doc EZ凝膠成像儀,Bio-Rad公司;DYCP-31DN電泳儀,北京市六一儀器廠;UV-2100微量分光光度計,優尼科儀器有限公司;AB204-N分析天平,瑞士梅特勒公司;GNP-9160恒溫培養箱,上海光都儀器設備有限公司;HYL-C組合式搖床,太倉市強樂設備有限公司;SBA-40C生物傳感分析儀,山東省科學院生物研究所。

1.4 培養基和培養條件

LB培養基(g/L):NaCl 10.0,胰蛋白胨10.0,酵母提取物5.0,瓊脂粉20.0(固體培養基),pH 7.0。此培養基在37 ℃、200 r/min條件下用于大腸桿菌培養。

BTN瓊脂培養基(g/L):葡萄糖10.0,蛋白胨2.0,酵母提取物1.0,瓊脂20,pH 7.5。此培養基用于鏈霉菌孢子的生成。

M3G培養基(g/L):葡萄糖 50.0,酵母提取物5.0,(NH4)2SO410.0,KH2PO41.36,K2HPO4·3H2O 0.8,MgSO4·7H2O 0.5,ZnSO4·7H2O 0.04,FeSO4·7H2O 0.03,pH 6.8。此培養基用于鏈霉菌種子培養與搖瓶發酵。

MS培養基(g/L):甘露醇20.0,黃豆粉20.0,瓊脂20.0。滅菌后加入MgCl2至終濃度10 mmol/L。

2×YT培養基(g/L):胰蛋白胨16.0,酵母提取物10.0,NaCl 5.0,pH 7.0。

菌體生長培養基(g/L):甘油15.0,酵母粉5.0,MgSO4·7H2O 0.5,KH2PO40.13,Na2HPO4·12H2O 0.14,pH 6.8。

轉化培養基(g/L)(未優化):葡萄糖 60.0,檸檬酸10.0,(NH4)2SO410.0,L-賴氨酸8.0,pH 4.5。

轉化培養基(g/L)(優化后):葡萄糖80.0,檸檬酸20.0,(NH4)2SO46.0,L-賴氨酸15.0,pH 4.0。

以上所有培養基在需要時添加Km、Am、Cm和Nal,終質量濃度分別為50.0、50.0、25.0、25.0 μg/mL。

1.5 發酵方法

種子培養:挑取3環孢子接種至裝有80 mL M3G培養基的500 mL錐形瓶,30 ℃、200 r/min,培養24 h。

搖瓶發酵:將種子液以體積分數8%的接種量接入裝有40 mL M3G培養基的250 mL錐形瓶,30 ℃、200 r/min,發酵72 h。

全細胞轉化:參考兩階段培養法[8]并稍作改動。將種子液以體積分數8%的接種量接入裝有80 mL菌體生長培養基的500 mL錐形瓶,30 ℃、200 r/min,培養12 h。5 000 r/min、4 ℃離心8 min收集菌體,棄上清液并用0.85%(質量分數)NaCl溶液等體積清洗菌體1次,相同條件收集菌體并重懸于轉化培養基中,隨后分裝10 mL混合液于25 mL錐形瓶,30 ℃、200 r/min,轉化96 h。

1.6 重組菌株的構建

過表達菌株的構建參考張重陽等[19]的方法。首先,以E.coliBL21全基因組為模板,通過引物lysp-F/R PCR擴增得lysp。目標片段純化后與線性化pIB139(NdeⅠ/EcoRⅠ)質粒連接并轉化入E.coliDH5α擴增重組質粒,提取質粒完成雙酶切驗證并測序。隨后,將驗證正確的重組質粒轉化入E.coliET12567/pUZ8002,通過接合轉移轉入S.albulusGS114得OE-lysp[20]。

1.7 RNA提取和實時熒光定量PCR(quantitative real-time-PCR,qRT-PCR)

參考張重陽等[19]的方法。對于每個樣本中的目的基因,將對照組(S.albulusGS114)中該基因的轉錄水平定義為1,結果顯示為相對于對照組中的變化倍數。相關基因引物設計見表2。

1.8 檢測方法

發酵過程參數測定:ε-PL濃度測定采用甲基橙比色法[21],葡萄糖濃度和L-賴氨酸濃度使用生物傳感分析儀進行測定[22],菌體干重測定參照刁文嬌等[20]的方法。

2 結果與分析

2.1 培養方式對轉化L-賴氨酸合成ε-聚賴氨酸的影響

S.albulusGS114在搖瓶發酵和轉化體系的過程參數如圖1所示。

a-搖瓶發酵體系(無L-賴氨酸)發酵過程參數;b-搖瓶發酵體系(有L-賴氨酸)發酵過程參數;c-兩階段轉化體系(未優化)發酵過程參數; d-搖瓶發酵體系與轉化體系發酵參數對比(FFS:搖瓶發酵體系;WCT:全細胞轉化體系)圖1 不同發酵體系對小白鏈霉菌轉化L-賴氨酸合成ε-PL的影響Fig.1 Effect of different fermentation systems on the transformation of L-lysine to ε-PL synthesis by S.albulus

在搖瓶發酵體系中,隨著發酵的進行,培養基pH值在48 h下降至3.0,此后菌株基本不消耗葡萄糖,ε-PL合成也受到嚴重抑制,最終ε-PL產量為2.71 g/L(圖1-a)。在搖瓶發酵體系中添加L-賴氨酸時,低pH也使得葡萄糖、L-賴氨酸利用受到限制(圖1-b)。而在全細胞轉化體系中,培養基pH值被有效控制在4.00～4.50,最終L-賴氨酸消耗量和ε-PL產量為5.50、10.74 g/L,相較于搖瓶發酵體系分別提升了4.0倍和2.9倍(圖1-c和圖1-d)。以上結果表明,搖瓶發酵體系pH不可控而產生的低pH環境(≤3.0)使得菌株利用L-賴氨酸的能力顯著降低,可能的原因是低pH環境終止了菌株的正常代謝。即便如此,在搖瓶發酵體系中添加的L-賴氨酸仍使得ε-PL產量提升了21.8%,這與LIU等[9]和LI等[10]的結果一致,證明了L-賴氨酸對ε-PL生產具有促進作用。與此同時,全細胞轉化體系解決了搖瓶發酵體系中pH不可控的問題,使得L-賴氨酸利用量和ε-PL產量均得到顯著提升,展現了其在轉化L-賴氨酸合成ε-PL方面的光明前景。

2.2 全細胞轉化L-賴氨酸合成ε-聚賴氨酸體系優化

2.2.1 葡萄糖濃度對轉化的影響

葡萄糖主要維持菌體的生存,同時也為ε-PL的合成提供部分前體,但過量的葡萄糖會產生抑制作用,因此需要確定合適的葡萄糖濃度。控制菌齡12 h,反應溫度30 ℃,L-賴氨酸質量濃度20 g/L,檸檬酸質量濃度20 g/L,初始反應pH 4.5,硫酸銨質量濃度10 g/L,濕菌體量1 600 g/L,在葡萄糖質量濃度分別為60、70、80、90、100 g/L時進行轉化。結果如圖2-a所示,在葡萄糖質量濃度<90 g/L時,未表現出明顯的底物抑制作用,并在80、90 g/L時獲得了較高的ε-PL產量,分別為10.20、10.17 g/L。在100 g/L時,底物抑制作用明顯,產量下降到8.57 g/L。因此,確定80 g/L的葡萄糖濃度為最佳轉化濃度。

2.2.2 菌齡對轉化的影響

不同菌齡的菌體通過控制ε-PL合成酶表達量影響ε-PL生產。控制葡萄糖質量濃度80 g/L,反應溫度30 ℃,L-賴氨酸質量濃度20 g/L,檸檬酸質量濃度20 g/L,初始反應pH 4.5,硫酸銨質量濃度10 g/L,濕菌體量1 600 g/L,分別利用菌齡8 h(對數中期)、12 h(穩定前期)、16 h(穩定后期)的菌體進行全細胞轉化合成ε-PL,結果如圖2-b所示。隨著菌齡增加,ε-PL產量也逐步提升并在12、18 h獲得了較高的ε-PL產量,分別為10.22、10.59 g/L;考慮到18 h較12 h的菌體對ε-PL產量的提升僅為0.36 g/L,故選擇最優轉化菌齡為12 h。

2.2.3 溫度對轉化的影響

溫度通過影響酶促反應的效率而影響ε-PL的合成。控制葡萄糖質量濃度80 g/L,菌齡12 h,L-賴氨酸質量濃度20 g/L,檸檬酸質量濃度20 g/L,初始反應pH 4.5,硫酸銨質量濃度10 g/L,濕菌體量1 600 g/L,分別在25.0、27.0、30.0、32.0、35.0 ℃下進行全細胞轉化合成ε-PL,結果如圖2-c所示。隨著溫度的上升,ε-PL產量呈現先上升后下降的趨勢,并在30 ℃時取得最高產量,達到10.90 g/L;在35 ℃時產量較低,僅為2.2 g/L。因此,確定最優轉化溫度為30 ℃。

2.2.4L-賴氨酸濃度對轉化的影響

L-賴氨酸是ε-PL的直接前體,對ε-PL的合成有著重要影響。控制葡萄糖質量濃度80 g/L,菌齡12 h,反應溫度30 ℃,檸檬酸質量濃度20 g/L,初始反應pH 4.5,硫酸銨質量濃度10 g/L,濕菌體量1 600 g/L,在L-賴氨酸質量濃度分別為6、9、12、15、18 g/L時進行轉化。結果如圖2-d所示,隨著L-賴氨酸質量濃度的提升,ε-PL產量呈現先上升后下降的趨勢,并在質量濃度15 g/L時獲得最高產量,達到13.00 g/L。因此,最佳L-賴氨酸質量濃度為15 g/L。

2.2.5 檸檬酸濃度對轉化的影響

檸檬酸與檸檬酸鈉組成pH緩沖體系,若檸檬酸不足將導致緩沖體系失效,從而影響ε-PL的生產。控制葡萄糖質量濃度80 g/L,菌齡12 h,反應溫度30 ℃,L-賴氨酸質量濃度15 g/L,初始反應 pH 4.5,硫酸銨質量濃度10 g/L,濕菌體量1 600 g/L,在檸檬酸質量濃度分別為 10、15、20、25、30 g/L 時進行轉化。結果如圖2-e所示,低于20 g/L的檸檬酸濃度對ε-PL產量基本無影響,均取得了較高的產量,分別為13.00、13.10、13.20 g/L。當質量濃度大于20 g/L時,ε-PL產量隨檸檬酸濃度的提升而下降,可能的原因是過量的檸檬酸對菌株產生了抑制作用。與此同時,足量的檸檬酸有助于維持緩沖體系穩定性。因此,最終確定最優的檸檬酸質量濃度為20 g/L。

2.2.6 pH對轉化的影響

pH值通過控制ε-PL降解酶和合成酶的活性而影響ε-PL生產。控制葡萄糖質量濃度80 g/L,菌齡12 h,反應溫度30 ℃,L-賴氨酸質量濃度15 g/L,檸檬酸質量濃度15 g/L,硫酸銨質量濃度10 g/L,濕菌體量1 600 g/L,在初始體系pH值分別為 2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0條件下進行轉化合成ε-PL。pH對ε-PL生產的影響結果見圖2-f,當pH值低于3.0時,ε-PL無法合成;當pH≥3.5時,ε-PL產量隨pH的升高呈現先上升后下降的趨勢,并在pH 4.0時產量最高,達到13.40 g/L。因此,最優轉化pH值為4.0。

2.2.7 硫酸銨濃度對轉化的影響

硫酸銨是ε-PL從頭合成的氨基供體。控制葡萄糖質量濃度80 g/L,菌齡12 h,反應溫度30 ℃,L-賴氨酸質量濃度15 g/L,檸檬酸質量濃度15 g/L,初始反應pH 4.0,濕菌體量1 600 g/L,在硫酸銨質量濃度分別為2、6、10、14、18 g/L時進行轉化。結果如圖2-g所示,隨著硫酸銨濃度的提升,ε-PL產量呈現先上升后下降的趨勢,并在6 g/L時ε-PL達到最高產量,為13.70 g/L。因此,最優硫酸銨質量濃度為6 g/L。

2.2.8 濕菌體量對轉化的影響

菌體量直接決定酶的含量。菌體量過小時,酶量低,轉化效率低;菌體量過大,黏稠的發酵體系將降低營養物質傳遞速率,從而降低轉化效率。因此,選擇合適的菌體量對轉化非常關鍵。控制葡萄糖質量濃度80 g/L,菌齡12 h,反應溫度30 ℃,L-賴氨酸質量濃度15 g/L,檸檬酸質量濃度15 g/L,初始反應pH 4.0,硫酸銨質量濃度6 g/L,在濕菌體量分別為1 300、1 600、1 900、2 200、2 500 g/L時進行全細胞轉化合成ε-PL。結果如圖2-h,隨著菌體量的增大,ε-PL產量呈現先上升后下降的趨勢,并在1 900 g/L時獲得最大產量,達到13.8 g/L。確定最優濕菌體量為1 900 g/L。

a-葡萄糖濃度;b-菌齡;c-溫度;d-L-賴氨酸濃度;e-葡萄糖濃度;f-pH;g-硫酸銨濃度;h-濕菌體量圖2 不同條件對全細胞轉化L-賴氨酸合成ε-PL的影響Fig.2 Effect of different conditions on whole-cell transformation of L-lysine to ε-PL synthesis

2.3 全細胞轉化L-賴氨酸合成ε-聚賴氨酸的過程分析

在最優轉化體系中考察了轉化過程參數,結果如圖3-a所示。隨著轉化進行,L-賴氨酸和葡萄糖被穩定消耗直至轉化結束,ε-PL產量從12 h開始穩定增長,96 h達到最高值13.80 g/L。轉化過程中,pH值維持在4.00～4.60,處于ε-PL合成的有效pH范圍。通過比較分析搖瓶發酵、優化前、優化后和優化后(未添加L-賴氨酸)體系的發酵結果(圖3-b),發現優化后轉化體系獲得了最高的ε-PL產量、L-賴氨酸消耗質量濃度和底物轉化率(葡萄糖+L-賴氨酸;消耗的L-賴氨酸等摩爾轉化為葡萄糖;下同)達到13.80、7.30 g/L和38.9%,分別是搖瓶發酵的4.1、6.6、3.2倍,較優化前轉化體系分別提升了28.5%、32.7%和25.9%。值得注意的是,在優化后(未添加L-賴氨酸)轉化體系中,ε-PL的產量和底物轉化率僅分別為5.20 g/L和18.4%,表明轉化體系中L-賴氨酸是影響ε-PL合成的關鍵。

2.4 重組小白鏈霉菌全細胞轉化L-賴氨酸合成ε-聚賴氨酸

為了進一步提升S.albulusGS114轉化能力,異源表達了來自E.coliBL21的L-賴氨酸特異性通透蛋白基因lysp,以進一步提升菌株的L-賴氨酸攝入能力。重組質粒構建流程如圖4-a所示,雙酶切驗證條帶與目標大小相符(圖4-b),表明異源表達質粒構建成功,將測序結果正確的重組質粒通過結合轉移轉入S.albulusGS114中,獲得重組菌OE-lysp。重組菌的qRT-PCR結果如圖4-c所示,lysp的相對表達水平是出發菌S.albulusGS114的152.4倍,表明目的基因成功異源表達。異源表達菌轉化L-賴氨酸合成ε-PL結果如圖4-d所示,OE-lysp的ε-PL產量、L-賴氨酸消耗量和底物轉化率分別達到17.21、9.20 g/L和45.8%,較出發菌分別提升了34.7%、26.0%和17.7%。以上結果表明,異源表達L-賴氨酸特異性通透蛋白能夠進一步提升轉化能力。

a-全細胞轉化體系(優化后)發酵過程參數;b-不同發酵體系轉化 L-賴氨酸合成ε-PL結果[FFS:搖瓶發酵;CWT1:優化前; CWT2:優化后;CWT3:優化后(無L-賴氨酸)]圖3 全細胞轉化L-賴氨酸合成ε-PL的過程分析Fig.3 Process analysis of whole-cell transformation to synthesize ε-PL from L-lysine

a-重組質粒構建示意圖;b-重組質粒雙酶切驗證結果;c-qRT-PCR;d-重組菌在轉化體系中的發酵結果參數圖4 重組小白鏈霉菌全細胞轉化L-賴氨酸合成ε-PLFig.4 Recombinant S.albulus for whole-cell transformation to synthesize ε-PL from L-lysine

3 結論

本文通過比較搖瓶發酵體系和全細胞轉化體系合成ε-PL的結果,發現了pH不可控是導致搖瓶發酵利用外源L-賴氨酸效率低的重要原因;同時,轉化體系表現出較強的L-賴氨酸轉化能力,ε-PL產量達到10.74 g/L,較搖瓶發酵提升了2.9倍。隨后,對轉化培養基和條件進行了系統優化,獲得最優轉化體系:葡萄糖質量濃度80 g/L,菌齡12 h,反應溫度30 ℃,L-賴氨酸質量濃度15 g/L,檸檬酸質量濃度15 g/L,初始反應pH 4.0,硫酸銨質量濃度6 g/L,濕菌體量為1 900 g/L。在最優體系中,ε-PL產量和底物轉化率分別為13.80 g/L和38.9%,較搖瓶發酵分別提高了4.1倍和3.2倍。最后,通過異源表達來自E.coliBL21的L-賴氨酸特異性通透蛋白基因lysp進一步提升ε-PL產量和轉化率分別至17.21 g/L和45.8%,約為搖瓶發酵的6.4倍和3.3倍。本文研究結果,一方面說明了通過全細胞轉化L-賴氨酸生產ε-PL是可行的,另一方面為S.albulus轉化大宗氨基酸L-賴氨酸生產高值ε-PL奠定了堅實的技術基礎,具有重要的理論意義和經濟價值。