復合酵素的貯藏穩定性及貨架期研究

劉恒,范柳萍*,張濤,潘牧

1(江南大學 食品學院,江蘇 無錫,214122)2(貴州省農業科學院生物技術研究所,貴州 貴陽,550006)

中華人民共和國輕工行業標準QB/T 5323—2018《植物酵素》中規定食用植物酵素是指以可用于食品加工的植物為主要原料,添加或不添加輔料,經微生物發酵制得的含有特定生物活性成分可供人類食用的酵素產品。其中,復合酵素指的是以兩種及以上原料或菌類做成的一類產品,它相對于單一酵素,具有更優異的品質。植物性原料經微生物發酵后,不僅保留了其本身的營養成分,還產生了一些新的活性物質[如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、γ-氨基丁酸等]和香氣化合物,使得原料的功能性和風味均有所提升[1]?！吨参锝退亍分袑κ秤弥参锝退氐母泄倨焚|和理化指標給出了明確的要求,其中感官品質要求復合酵素具有其產品應有的氣滋味和色澤,無正常視力可見外來雜質;理化指標包括一般性理化指標和特征性理化指標,其中對pH值、多酚和乙醇含量、微生物細胞數等做出了明確的規定。此外,復合酵素的貨架期是反映其質量安全的重要指標。

在工業應用中,為了快速且準確的完成對食品貨架期的預測,通常會引入加速保質期實驗和Arrhenius方程。其中,加速保質期實驗的原理是將食品暴露在高溫下,以提高食品的老化速度,縮短保質期測試時間[2]。Arrhenius方程描述了食品的貨架期指標變化的反應速率與溫度之間的關系,常用于預測食品的貨架期[3]。目前越來越多的研究人員通過構建貨架期模型來預測酵素產品的貨架期,然而,現有的研究多是針對單原料或者單菌種制備酵素的貨架期預測,且并未對零級、一級動力學反應進行適配度選擇。白琳[4]將殺菌后的藍莓酵素置于8、25、37 ℃下恒溫貯藏,測定了藍莓酵素的感官品質和理化指標在貯藏過程中的變化,同時引入Arrhenius方程和一級動力學方程構建了藍莓酵素保質期預測模型,最終得到結論:以SOD活力為評價指標時,藍莓酵素在常溫下的貨架期為283 d。曾光[5]將接菌發酵和自然發酵的2種酵素產品分別放置在4、25、37 ℃下恒溫貯藏,測定了2種酵素的感官評分、色澤、多酚、黃酮等指標的變化,結合Arrhenius方程以及權重模糊法,建立了酵素相應品質參數的貨架期預測模型和品質綜合評價計算方法,其中,品質綜合評價=感官評分×30%+pH×25%+色差×30%+總酚含量×15%。

本研究通過將巴氏殺菌后的復合酵素放置在不同溫度下貯藏,測定了其貯藏過程中感官品質、理化指標、活性成分的變化,根據Arrhenius方程對零級或一級動力學反應進行適配度選擇,在此基礎上建立貨架期模型,并以SOD活力為指標預測復合酵素的貨架期,之后在通過實驗進行驗證,可為復合酵素的工業化應用提供理論依據與技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

香蕉、西蘭花、枸杞,江蘇無錫濱湖區華潤萬家超市;克魯弗畢赤酵母菌 XT110,中國典型微生物菌種保藏中心;植物乳植桿菌CICC 21796,中國工業微生物菌種保藏管理中心;纖維素酶、果膠酶、淀粉酶,均為食品級,河南萬邦化工科技有限公司;Na2SO3, K2HPO4,均為食品級,鄭州優寶嘉食品旗艦店。

1.2 儀器與設備

JM-L50膠體磨,強忠機械科技有限公司;MQD-S2R振蕩培養箱,上海旻泉儀器有限公司;ZHJH-C1209C超凈工作臺,上海智城分析儀器制造有限公司;FE-20型pH計,梅特勒-托利多儀器有限公司;L8紫外可見分光光度計,上海儀電分析儀器有限公司;LC-20A液相色譜分析儀,日本島津公司;UltraScan Pro 1166色差儀, Hunterlab。

1.3 復合酵素的制備

將香蕉、西蘭花、枸杞和去離子水以質量比1∶1∶1∶10混合,用膠體磨打漿處理后加入纖維素酶、果膠酶和淀粉酶各0.04%(質量分數)酶解并過濾,之后將濾液pH值和可溶性固形物含量(soluble solid content,SSC)分別調節到5.0和15%;在無菌條件下加入0.02%(質量分數)的食品級Na2SO3,并放置在25 ℃下2 h進行滅菌處理;之后在超凈工作臺中接種6.00 lg CFU/mL的克魯弗畢赤酵母菌,發酵24 h后在將發酵液的pH值和SSC分別調節為6.5和18%,并接種7.00 lg CFU/mL植物乳植桿菌開始7 d的共發酵。

將發酵結束后的復合酵素進行65 ℃、30 min的巴氏殺菌處理,并分別放置在4、25、37 ℃下恒溫貯藏,每隔1周進行取樣,用于測定其品質的變化。

1.4 復合酵素在貯藏期間顏色參數的變化

1.4.1 復合酵素色差的測定

用色差儀來測定復合酵素在貯藏期間的色澤變化,用CIE-L*a*b*系統表示,其中L*代表亮度值,a*代表紅色/綠色值;b*代表黃色/藍色值。樣品的總色差變化(ΔE)根據公式(1)計算[6]:

(1)

復合酵素在貯藏期間的色度(C*)和色調(h*)根據公式(2)、公式(3)計算[7]:

(2)

(3)

1.4.2 復合酵素褐變指數的測定

參照WANG等[8]的方法并略有修改。取2 mL復合酵素液與95%(體積分數)的乙醇等體積混合,在4 000 r/min離心15 min后取上清液,在420 nm處測定吸光值即為其褐變指數。試驗以95%乙醇為空白對照。

1.5 復合酵素感官評價

基于ZHANG等[9]的方法并略有修改。從江南大學本科生和研究生中挑選了24名評審員(男12名,女12名),年齡18～35歲。在進行感官分析之前,對評審員進行了評級方法、術語、屬性和感官特征的培訓。將不同貯藏條件的復合酵素(50 mL)隨機放入透明玻璃瓶中,瓶內隨機3位數編碼,無特殊含義。評審員根據表1中的評分標準對復合酵素進行評分,將其分為4個部分:色澤、組織狀態、口感和氣味。感官得分是各部分得分的總和。

表1 感官評分標準Table 1 Sensory scoring criteria

1.6 復合酵素在貯藏期間pH和總酸的變化

使用pH計測定pH值;總酸含量采用GB 12456—2021《食品中總酸的測定 酸堿指示劑滴定法》進行測定。

1.7 復合酵素在貯藏期間SSC和糖酸比的變化

SSC通過阿貝折光儀來進行測定。復合酵素的糖酸比根據公式(4)測得:

(4)

1.8 復合酵素在貯藏期間總酚含量的變化

采用福林酚法來測定總酚含量,具體操作參照文獻[1]并略有修改。稱取0.100 g沒食子酸標準品,加少量水溶解,轉移至1 000 mL容量瓶中,定容并搖勻,得到1 mg/mL的沒食子酸標準溶液。分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL標準溶液于比色管中,先加入0.5 mL的福林酚試劑,混合均勻后再加入2 mL的7.5%(質量分數)Na2CO3溶液,并將比色管置于70 ℃水浴中加熱30 min,冷卻后用去離子水將溶液定容至10 mL,并在750 nm處測定其吸光值。以濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標建立標準曲線。同時,取適量樣液按照上述操作測定吸光值,通過標準曲線即可得到樣品中的總酚含量。

1.9 復合酵素在貯藏期間SOD活力和抗壞血酸的變化

采用鄰苯三酚自氧化法來測定SOD活力,具體操作參照GB/T 5009.171—2003《保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定》。采用配備有Waters Atlantis C18反相柱(150 mm,4.6 mm×3 μm)高效液相色譜儀來分析復合酵素中抗壞血酸的含量,具體操作參照文獻[10]并略有修改?？偟膩碚f,選擇0.01%(體積分數)硫酸溶液作為流動相并等梯度洗脫,流速0.7 mL/min。柱溫25 ℃,檢測波長245 nm。將樣品通過0.22 μm的水膜過濾以用于測定,進樣量10 μL。用外標法進行定量分析,從而得到樣品中的抗壞血酸含量。

1.10 復合酵素貨架期模型的構建

貨架期模型的建立基于數學建模的思想[8],以復合酵素為研究對象,根據其在貯藏期間的理化指標、生物活性物質和感官品質的變化,將零級和一級反應動力學結合Arrhenius方程,建立貨架期模型,對該復合酵素的貨架期進行預測。如公式(5)～公式(9)所示:

零級反應動力學模型:C=C0+kt

(5)

一級反應動力學模型:C=C0ekt

(6)

(7)

(8)

(9)

式中:C0,特征指數的初值;C,td后的特征指標值;k和k0,反應速率常數;Ea,活化能,J/mol;R,摩爾氣體常數,8.314 4 J/(K·mol);T,絕對溫度,K;t,復合酵素飲料的儲存時間,d。

1.11 數據分析

各組實驗重復3次,采用SPSS 26.0進行統計分析,P<0.05表示結果差異顯著;Origin 2021軟件進行作圖處理。

2 結果與分析

2.1 不同溫度下貯藏時間對復合酵素感官品質的影響

2.1.1 顏色參數在貯藏期間的變化

除了水果飲料的營養價值之外,顏色是影響消費者偏好的最重要因素之一。復合酵素在貯藏期間(4、25、37 ℃)的L*、a*、b*、ΔE、C*、h*值如圖1所示,L*和a*值呈現降低的趨勢,而b*、ΔE、C*、h*值則逐漸增加。說明在貯藏過程中,復合酵素的亮度變暗,而黃色略有加深。這可能是由于復合酵素在貯藏過程中的褐變現象所引起的。

ΔE值是衡量色值差異的量度,如圖1-d所示,復合酵素在4 ℃保存時,其顏色變化不大,但溫度越高,顏色變化越明顯(P<0.05)。復合酵素的C*和h*值也隨溫度和時間的延長有著顯著的增高(P<0.05),這也為描述復合酵素的顏色變化提供參考。C*值是某種顏色的強度,當此變量取值接近0時,有中性色(灰色),當它逐漸增大時,代表其顏色強度變大[11],而h*值增加則表明復合酵素的黃色有增加的趨勢,這與b*值的結果相對應。可以看出,復合酵素的穩定性在儲存過程中逐漸降低,溫度對ΔE值有著顯著的影響。可能的原因是高溫增加了色素沉積,導致可見的顏色變化[12],這表明高溫不利于復合酵素的貯藏。綜上,在低溫下貯藏可以延緩復合酵素的顏色變化,減緩其品質的下降。

2.1.2 褐變指數在貯藏期間的變化

果蔬汁飲料在貯藏過程中通常會發生褐變反應,這會直接影響飲料的品質。如圖2所示,隨著貯藏時間的延長,4、25、37 ℃貯藏的復合酵素的褐變指數均呈上升趨勢,褐變指數由最初的0.833±0.016分別上升至0.913±0.019、0.948±0.018和1.107±0.017。表明褐變指數與溫度和時間存在著正相關關系。

復合酵素中的褐變主要分為酶褐變和非酶褐變,而該復合酵素中褐變的主要原因是非酶褐變,主要是由其中美拉德反應等造成的[13]。此外,抗壞血酸和多酚的降解也會導致褐變[14]。37 ℃貯藏飲料的褐變指數顯著高于其他溫度下的褐變指數(P<0.05)。這是因為高溫會加速復合酵素中抗壞血酸的降解和酚類的氧化聚合,導致褐變程度增加[15]。所以,我們猜測前期褐變指數增加緩慢可能是由于多酚和抗壞血酸的大量存在,而隨著后面兩者的降低,褐變指數也迅速升高。

a-L*;b-a*;c-b*;d-ΔE;e-C*;f-h*圖1 不同貯藏溫度下復合酵素的顏色參數L*、a*、b*、ΔE、C*、h*的變化Fig.1 Change of color parameters L*, a*, b*, ΔE, C*,and h* of complex Jiaosu at different storage temperatures

圖2 不同貯藏溫度下復合酵素的褐變指數的變化Fig.2 Change of browning index of complex Jiaosu at different storage temperatures

2.1.3 復合酵素在貯藏期間的感官分析

通過數字化評分的方式描述了復合酵素在貯藏期間感官品質的變化。從表2可以看出,無論復合酵素在何種溫度下貯藏,隨著時間的延長,復合酵素的感官品質均呈現出不同程度的下降趨勢。在較高的溫度(37 ℃)下,復合酵素的感官品質劣化加速并導致感官評分迅速下降,而在4、25 ℃下感官品質變化較慢,尤其是4 ℃時復合酵素的感官評分由最初的100.00±0.00緩慢下降至85.44±0.56,相較于其他溫度,穩定性較好,說明低溫貯藏條件有利于保持復合酵素的感官品質。

表2 復合酵素在貯藏期間感官評分的變化 單位:分

2.2 不同溫度下貯藏時間對復合酵素理化品質的影響

2.2.1 pH和總酸的分析

復合酵素的pH值和總酸是評價其體系的重要指標,他們的變化可以很大程度上影響復合酵素的品質。在3種不同的貯藏溫度下測得的pH值和總酸如圖3所示。不同溫度下貯藏的復合酵素pH值隨著貯藏時間的延長呈下降的趨勢,pH值在貯藏56 d后由最初的3.96逐漸穩定至3.27～3.48。而總酸隨著貯藏時間的延長而逐漸增長,且溫度越高增長幅度越大。總酸在貯藏56 d后由最初的0.46%逐漸穩定至0.58%～0.76%。復合酵素pH值下降的主要原因是有機物分解產生乙酸和乳酸等酸性物質[16]。并且,隨著儲存溫度的升高,pH值下降速度加快。這可能是因為高溫會更大程度的破壞體系穩定性,從而加速其中大分子物質的降解。抗壞血酸在貯藏過程中的氧化降解也會導致飲料pH的降低和總酸的增長[17]。IHSAN MABOOD[18]用胡蘿卜、檸檬和生姜制備的飲料,在儲存期間pH值從3.91降低到3.37。PUREWAL等[17]研究了儲存時間對即食Kinnow-Amla飲料的總酸的影響,結果發現,隨著溫度和時間的延長,pH值和總酸分別出現下降和上升的趨勢,這也與我們的研究一致。

圖3 不同貯藏溫度下復合酵素的pH值和總酸的變化Fig.3 Change of pH and total acids of complex Jiaosu at different storage temperatures

2.2.2 SSC和糖酸比的分析

SSC是以果蔬汁為基質的飲料的一個特性指標,與飲料的品質息息相關。如圖4-a所示,4、25、37 ℃下貯藏的復合酵素的SSC均呈現顯著降低的趨勢(P<0.05)。在3個溫度下的貯藏期達56 d時,復合酵素的SSC與貯藏前(9.86%)相比,分別降低至9.17%、8.61%、8.28%。這種現象可能是由于復合酵素中某些物質之間發生了美拉德反應[19],使得其中的一些可溶性化合物變為不溶性物質,降低了復合酵素的穩定性。此外,復合酵素中的一些營養成分在貯藏過程中會發生分解,這也會在一定程度上導致SSC含量的下降,從而降低了體系的營養和穩定性[8]。并且,溫度的升高在一定程度上會加速這些轉化,所以,將復合酵素放置在4 ℃下貯藏,可以最大限度地保留SSC的含量。

糖酸比可以影響復合酵素的口味,而食品生產中常通過調節該比值來控制其口感。糖酸比還會影響復合酵素的品質和保質期等。如圖4-b所示,在貯藏過程中,復合酵素的糖酸比呈現降低的趨勢,在貯藏期達56 d時,4、25、37 ℃貯藏的復合酵素飲料的糖酸比分別降低至15.78、13.27、10.86。因此,4 ℃下貯藏的復合酵素具有更高的穩定性,更好地保持了其品質屬性。

a-SSC;b-糖酸比圖4 不同貯藏溫度下復合酵素的SSC和糖酸比的變化Fig.4 Change of SSC and sugar acid ratio of complex Jiaosu at different storage temperatures

2.3 不同溫度下貯藏時間對復合酵素活性成分的影響

2.3.1 總酚含量的分析

酚類化合物是衡量復合酵素營養品質的重要指標。如圖5所示,4、25、37 ℃貯藏的復合酵素的總酚含量在第1周內均出現小幅度增長,之后隨著時間的延長而逐漸降低。張正偉[6]在楊梅酒的貯藏前期也觀察到了總酚含量的增長,并推測可能是由于結合酚與其他大分子間的化學鍵隨時間發生斷裂,釋放出更多的酚羥基基團導致的。ZHANG等[20]對蔓越莓汁進行噴霧干燥,之后放置在25 ℃貯藏,貯藏期間也觀察到了類似的現象,他們認為這可能是由于共軛多酚的水解。

隨著貯藏時間的延長,復合酵素中的總酚含量出現不同程度的降低。在4、25、37 ℃時,總酚含量分別下降了31.35%、38.20%、42.43%。比較3種貯藏溫度,4 ℃更有利于復合酵素中多酚的最大保留。ESCOBAR-ORTIZ等[21]分析了在4、25、35、45、80 ℃下儲存45 d的芙蓉花提取物中酚類物質的變化,結果也發現了總酚含量類似的下降趨勢。此外,氧氣濃度也會直接影響多酚的保留,所以,在貯藏過程中,應盡量選擇隔氧性較好的包裝材料,從而有效保護多酚不被氧化。

圖5 不同貯藏溫度下復合酵素的總酚含量的變化Fig.5 Change of total phenols content of complex Jiaosu at different storage temperatures

2.3.2 SOD活力和抗壞血酸含量的分析

SOD活力是影響復合酵素品質的重要指標。如圖6-a所示,SOD活性在不同貯藏溫度下均有一定的損失,貯藏期達56 d時,4、25、37 ℃下的SOD活力較貯藏前[(24.75±0.58) U/mL]分別降低至(19.17±0.24)、(17.99±0.25)、(15.70±0.27) U/mL。溫度越高,SOD活力的損失越嚴重。因此,溫度是影響SOD活力的主要因素之一。WANG等[8]將在板栗玫瑰飲料的儲存中也發現相似的SOD活力變化趨勢。

如圖6-b所示,復合酵素的抗壞血酸含量在貯藏過程中發生了一定程度的降解。4、25、37 ℃下的抗壞血酸含量相比于貯藏前分別降低了33.10%、52.11%、77.93%。一般認為,這種降低趨勢主要是復合酵素體系中抗壞血酸的氧化降解造成的,并且這種降解在有氧和無氧條件下都可以發生[22],此外,復合酵素中存在的金屬離子可能也會導致抗壞血酸的損失[23]。高溫也會加劇抗壞血酸的降解[10],可能是較高的溫度促進了其氧化降解的過程?？偟膩碚f,在儲存期間,溫度和溶解氧濃度在決定飲料中抗壞血酸降解量方面起著重要作用。

此外,WANG等[8]發現復合酵素飲料中抗壞血酸含量越高,SOD活性也越不容易損失。根據我們的研究結果,隨著貯藏時間的增加,復合酵素飲料中的抗壞血酸含量發生了一定量的損失,并且隨著抗壞血酸含量的下降,SOD活性下降速度也加快。所以,較高的抗壞血酸含量以及較低的溫度可能有利于SOD活性的保留。

a-SOD活力;b-抗壞血酸含量圖6 不同貯藏溫度下復合酵素的SOD活力和 抗壞血酸含量的變化Fig.6 Change of SOD activity and ascorbic acid content of complex Jiaosu at different storage temperatures

2.4 復合酵素的貨架期

2.4.1 貨架期模型的構建與預測

SOD作為復合酵素中的一種關鍵性功效酶,與其品質直接相關。因此,SOD活性往往成為判斷復合酵素貨架期的關鍵。QB/T 5323—2018對SOD活力和保存時間都有著明確的規定,其中,SOD活力要求在15 U/L以上,且保存時間不少于180 d。根據前文分析,SOD活力在貯藏期間顯著降低,因此,以SOD活性作為評價指標判斷復合酵素的貨架期。白琳[4]以SOD活力為指標監測藍莓酵素的貨架期,得到藍莓酵素在25 ℃貯藏時的貨架期為283 d。然而,在酵素的工業應用中,若直接通過測定SOD活力的變化來判斷酵素的貨架期,會耗費大量的人力和物力,建立可靠的預測模型具有非常重要的意義。本研究使用動力學模型和Arrhenius方程來對該復合酵素的貨架期進行分析和預測。如表3所示,零級反應的R2平均值較高,說明對于SOD活力而言,零級反應方程可以更好的擬合其在不同貯藏條件下隨時間的變化。根據表3中不同貯藏溫度下的動力學常數k值,從而得出lnk值。并根據Arrhenius方程,以lnk為縱坐標,-1/T(T為絕對溫度)為橫坐標,得出該復合酵素在不同貯藏溫度下的線性回歸方程:y=1 109.9x+1.715 4,R2為0.940 3。根據該方程的斜率和截距計算得出Ea值和K0值(表4)。在將Ea值和K0值代入零級反應貨架期模型方程,得到在該復合酵素在25 ℃下的貨架期為184 d。

表3 不同貯藏溫度下復合酵素飲料SOD活力的 反應速率常數和測定系數Table 3 Reaction rate constant and determination coefficient of SOD activity in complex Jiaosu during storage at different temperatures

表4 基于SOD活力的Arrhenius方程Table 4 Arrhenius equation based on SOD activity

2.4.2 貨架期模型的驗證與分析

為了驗證所構建的預測模型的準確性,我們將復合酵素飲料分別放置在10、20、25 ℃下儲存,并且以SOD活力為評價指標,驗證該模型的準確性.如表5所示,復合酵素在不同溫度下貯藏時,貨架期預測值與實測值的相對誤差均在5%以下,所以,此模型具有較高的準確性。對于酵素的工業化發展具有重要的意義。

表5 復合酵素貨架期的驗證及誤差Table 5 Validation and relative error of shelf life of complex Jiaosu

3 結論與討論

本研究對復合酵素在貯藏期間的穩定性進行了考察,探究了不同時間和溫度對復合酵素品質的影響,并建立了一個可靠的貨架期預測模型。結果發現,復合酵素在不同溫度下貯藏時,pH值、SSC和糖酸比均顯著下降,SOD活力、抗壞血酸等活性成分損失嚴重,且抗壞血酸對SOD活力具有一定的保護作用。ΔE和褐變指數也隨溫度和時間的延長而顯著提高,因此,4 ℃貯藏的復合酵素具有最高的穩定性。此外,以SOD活力為指標構建復合酵素的貨架期模型時,零級反應動力學與Arrhenius方程更為適配,這樣得到的模型也較為可靠。后續的研究應嘗試施加不同的處理方式(充氮、更換包裝材料等)去延長復合酵素的貨架期,為開發更高品質的復合酵素奠定基礎。