不同全谷物輔料對啤酒內源性抗氧化力的影響

趙亞剛,吳殿輝,彭鄭聰,張明,陸健*,謝廣發

1(工業生物技術教育部重點實驗室,糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心,江蘇省生物活性制品加工工程 技術研究中心,江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)2(江蘇省農墾麥芽有限公司,江蘇 鹽城,224399) 3(浙江省污染暴露與健康干預重點實驗室,浙江樹人學院,浙江 杭州,310015)

啤酒是以麥芽、水和啤酒花為主要原料,再添加一些輔料(如小麥、玉米、大米等),經過酵母發酵釀造成的含有CO2的、起泡的、低酒精度的發酵酒[1]。近幾年全球“工坊啤酒”(craft beer)市場呈顯著增長的趨勢,形成了新的消費熱點,添加特色輔料發酵而成的工坊啤酒因其原輔料的豐富度、多元化的風味、新鮮的口感而受到廣大消費者的青睞[2]。工業化釀造的啤酒由于大多經過了熱殺菌環節、在市場流通銷售時間較長,啤酒的新鮮度逐步下降。在提升啤酒抗氧化能力、以保持新鮮度的系統方案中,啤酒的內源性抗氧化力越來越受到啤酒生產企業的重視。啤酒的內源性抗氧化力主要由啤酒中抗氧化物質提供,能起到清除自由基、抑制脂質過度氧化、與銅、鐵等金屬離子螯合的作用,對防止啤酒老化、維持啤酒新鮮度乃至風味穩定性具有重要作用[3]。基于不同的反應機制,對啤酒抗氧化性的評價也有多種方法,其中應用較多的是基于自由基清除能力評價啤酒抗氧化能力,如DPPH自由基和ABTS陽離子自由基等[4]。

酚類物質是目前工業化生產的啤酒中最主要的抗氧化物質,其主要來源于大麥麥芽和啤酒花,其中80%的酚類物質來源于大麥麥芽[5]。以往的啤酒生產大多對輔料進行適當處理,去除部分易引起啤酒氧化的成分,但這種方式對提升啤酒的內源性抗氧化力收效不明顯。因此有學者嘗試使用富含酚類物質的輔料,以提升啤酒的內源性抗氧化力,增強啤酒的風味穩定。全谷物是完整的、碾成粉狀、碎塊狀的谷物穎果,其淀粉胚乳、胚芽和糠麩的比例與完整穎果中的比例基本相同,富含酚類化合物、植酸、維生素等豐富的生物活性成分[6]。如蕎麥中富含蘆丁、槲皮素、大黃素等生物活性物質[7];高粱中生物活性成分主要是酚類化合物,其中酚酸、黃酮類化合物和單寧占比很高[8]。吉春暉[9]采用20%藜麥釀造的藜麥啤酒相比于全大麥麥芽啤酒具有更強的抗氧化活性,其中DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除活性分別比對照組高33%和40%。目前已報道的用于啤酒釀造的全谷物有藜麥[9]、青稞[10]、薏米[11]等,研究主要集中在全谷物啤酒和全大麥麥芽啤酒的對比上。但不同種類谷物中的酚類物質含量不同,不同谷物類型對啤酒內源性抗氧化力的影響也不同。在啤酒生產中采用酚類物質含量更高的全谷物輔料,可能對生產高抗氧化力啤酒具有潛在的應用前景。本研究以6種常見的全谷物(藜麥、蕎麥、薏米、糙米、青稞、高粱)為輔料,以20%的添加量,采用上面發酵技術釀造不同輔料啤酒,考察不同全谷物輔料對啤酒釀造的基本指標、抗氧化活性、酚類物質、風味物質和感官評分的影響,為不同全谷物輔料啤酒的開發、以及提高啤酒的內源性抗氧化力提供理論參考和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

谷物輔料:藜麥(青海高原白藜麥)、蕎麥(河北蕎麥)、薏米(蒲城薏米)、糙米(廣東客家糙米)、青稞(青海藍青稞)、高粱(東北紅高粱),無錫網上糧店養生專家(網購),谷物于-4 ℃下保藏備用。大麥麥芽,江蘇省農墾麥芽有限公司;青島大花,濟南雙麥啤酒物質有限公司;WB-06啤酒酵母,弗曼迪斯酵母有限公司;DPPH、ABTS、水溶性維生素E、福林酚(分析純)、沒食子酸、原兒茶酸、(+)-兒茶素、香草酸、咖啡酸、丁香酸、(-)-表兒茶素、p-香豆酸、綠原酸、阿魏酸、槲皮素,均為色譜純,上海麥克林生化科技有限公司;甲醇(色譜級)、冰乙酸(色譜級)、K2S2O8、Na2CO3、NaNO2,均為國產分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

H1750R高速離心機,湘儀離心機儀器有限公司;紫外分光光度計,普析通用儀器有限責任公司;旋轉蒸發儀,艾卡(廣州)儀器設備有限公司;CHS-100CL恒溫培養箱,上海一恒科學儀器有限公司;PL2002電子天平,梅特勒-托利多(上海)有限公司;冷凍干燥機,蘇州明德生物科技有限公司;GC-2030AF氣相色譜儀,日本島津公司;1260高效液相色譜儀,安捷倫科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 不同谷物輔料啤酒制作流程

以全大麥麥芽釀造的啤酒為對照,實驗組均按20%的質量比例分別添加全谷物(即80 g大麥麥芽搭配20 g全谷物)。以藜麥為例,參考吉春暉[9]的方法得到10°P的麥汁。接種WB-06活性干酵母0.15 g/L(酵母在30 ℃的無菌水中活化30 min),加發酵栓于12 ℃發酵。每24 h測質量,待日失重<0.2 g時,于4 ℃貯存7 d,每個樣品設3個平行樣。

1.3.2 不同輔料啤酒基本理化性質測定

將啤酒經超聲波處理5 min除氣,用單層中速干濾紙過濾后備用。啤酒酒精度、真正濃度、發酵度、pH、總酸、色度、苦味質和風味物質含量均按照GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》中的檢測方法測定。

1.3.3 谷物及啤酒樣品前處理

測定谷物的抗氧化指標、總多酚、總黃酮及谷物和啤酒樣品中單酚物質含量需要對樣品進行前處理。

谷物樣品前處理:取5 g絕干谷物粉碎后加50 mL體積分數80%的乙醇溶液,20 ℃超聲波處理60 min,然后3 000 r/min離心10 min后35 ℃旋蒸至干。殘余物溶于50 mL甲醇用于分析DPPH自由基清除活性、ABTS陽離子自由基活性、總多酚含量和總黃酮含量。殘余物溶于2 mL甲醇溶液中,過0.45 μm濾膜后進行HPLC分析。

啤酒樣品前處理:取50 mL除氣啤酒,加入20 g NaCl,用50 mL乙酸乙酯重復萃取3次,有機相合并后35 ℃旋轉蒸發至干,殘余物溶解于2 mL甲醇溶液中,過0.45 μm濾膜后直接進行HPLC分析。

1.3.4 總多酚和總黃酮含量測定

參照李會品[3]的方法,以沒食子酸為標準品,得到標準曲線y=335.61x-7.363 4(R2=0.999 4)。谷物和啤酒中的總多酚含量以沒食子酸當量表示,單位為mg/g和mg/L。

參照王立等[12]的方法,以蘆丁為標準品,得到標準曲線y=231.01x-0.784 7(R2=0.999 9)。谷物和啤酒中的總黃酮含量以蘆丁當量表示,單位為mg/g和mg/L。

1.3.5 抗氧化活性測定

參照RE等[13]的方法,稍作修改。以水溶性維生素E為標準品,分別得到標準曲線y=0.042 9x+0.001 3(R2=0.999 9)和y=2.780 3x+0.125 2(R2=0.996 3)。谷物和啤酒的DPPH自由基清除活性與ABTS陽離子自由基清除活性均以水溶性維生素E當量(trolox equavilance,TE)表示,單位分別為μmol TE/g和mmol TE/L。

1.3.6 酚類物質HPLC分析

色譜柱Agilent XDB-C18(150 mm×4.6 mm×5 μm)。采用梯度洗脫,流動相含有0.1%乙酸的水溶液(A相)和0.1%乙酸的甲醇溶液(B相),梯度洗脫程序:0 min,5% A;15 min,20% A;45 min,60% A;50 min,80% A;52 min,5% A;60 min,5% A。紫外檢測波長為254 nm和280 nm(原兒茶酸、香草酸和槲皮素在254 nm處檢測,其余在280 nm處檢測);柱溫20 ℃;流速1 mL/min;進樣量10 μL。

1.3.7 啤酒感官評價

由20名經過培訓的具有食品發酵專業背景的研究生組成感官評價小組,從外觀、香氣、口味為評價因素。感官評分標準如表1所示。

表1 不同輔料啤酒感官評分標準Table 1 Sensory evaluation criteria of beers with different adjunct

1.4 數據分析

采用Origin軟件和SPSS軟件對實驗數據進行統計學分析和整理作圖,各組數據表示為平均值±標準差。組間均值比較使用單因素方差分析(One-way ANOVA),差異性檢驗使用Duncan法,P<0.05表示差異具有顯著性。

2 結果與分析

2.1 不同全谷物輔料對啤酒理化性質的影響

如表2所示,啤酒樣品的發酵度和酒精度均符合國標要求,說明使用這些谷物后對啤酒的正常發酵過程、產品理化指標沒有負面影響。啤酒發酵過程中的底物主要是以葡萄糖或二糖為主的碳水化合物,淀粉含量會影響發酵液中可發酵糖的含量。不同谷物中的淀粉含量不同,分別為大麥麥芽(77.7%)、高粱(72.1%)、糙米(71.4%)、蕎麥(66.5%)、藜麥(64.2%)、青稞(63.4%)、薏米(49.5%)[11,14-16]。薏米中的淀粉含量遠低于其他谷物,因此薏米啤酒的酒精度和發酵度最低,對照組酒精度和發酵度最高。添加不同谷物會稍微降低啤酒的pH值,提高啤酒中的總酸含量。不同谷物啤酒色度在9.5～13.1 EBC之間,蕎麥啤酒、青稞啤酒和高粱啤酒的色度均高于對照組。淡色啤酒的色度80%均來自于原料,蕎麥、青稞和高粱的麩皮中花青素等色素物質含量均較高,這可能是此3種啤酒色度高于對照組的原因[14,17-18]。不同谷物啤酒苦味質在8.98～13.96 BU,蕎麥啤酒苦味質遠高于其他樣品。這可能是因為蕎麥中黃酮類物質含量高于其他樣品,其中主要成分為蘆丁、槲皮素和各種花色苷物質,其中槲皮素和花色苷都是典型的具有苦味的天然化合物[19]。SEBESTYéN等[20]研究也表明蕎麥會顯著增加啤酒的苦味質。

表2 不同谷物對啤酒發酵特性和基本理化指標的影響Table 2 Effects of different cereals on beer fermentation characteristics and basic physicochemical properties

2.2 不同全谷物輔料對啤酒抗氧化性的影響

如圖1-a所示,DPPH自由基清除活性為1.44～3.28 μmol TE/g,ABTS陽離子自由基清除活性為1.92～13.76 μmol TE/g,總多酚含量為0.30～1.60 mg/g,總黃酮含量為0.47～3.23 mg/g,這和已報道的谷物總多酚和總黃酮含量都在同一數量級[21-23]。不同谷物的抗氧化指標和抗氧化物質含量基本表現出相同的變化趨勢。其中蕎麥的各項指標均高于其他全谷物樣品,糙米各項指標均低于其他樣品。全谷物多酚以游離態和結合態的形式存在,其比例因谷物種類及品種而存在差異,研究表明薏米、蕎麥全谷物多酚中結合酚含量低于50%[24]。除蕎麥外,其余全谷物樣品各項指標均低于對照組,這可能是因為大麥酚類物質在發芽過程中隨麥芽溶解而游離,使得提取率變高[25]。因此,圖1-a的結果說明谷物中富含生物活性物質,對啤酒內源性抗氧化力的具體影響仍需要進一步的研究。

如圖1-b所示,蕎麥啤酒的DPPH自由基清除活性最強,達1.68 mmol TE/L,ABTS陽離子自由基清除活性最強的是青稞啤酒,達1.28 mmol TE/L。6種全谷物啤酒總多酚含量為232.06～263.48 mg/L,平均值為249.19 mg/L;總黃酮含量為101.41～118.02 mg/L,平均值為111.30 mg/L。其中藜麥啤酒的總多酚含量最高,達263.48 mg/L,比對照組高6.0%;青稞啤酒總黃酮含量最高,達118.02 mg/L,比對照組高8.8%。藜麥和青稞中的總多酚含量和總黃酮含量均低于大麥麥芽,但藜麥啤酒和青稞啤酒中的總多酚含量和總黃酮含量均高于對照組,這可能是因為在糖化過程中谷物的結合型多酚被進一步釋放,而圖1-a中測定的數值更接近游離型多酚。

a-全谷物樣品;b-全谷物輔料啤酒樣品圖1 不同全谷物和全谷物輔料啤酒抗氧化性及 抗氧化物質含量Fig.1 Antioxidation capacity and antioxidation substance content of different whole cereals and different whole grain adjunct

綜上所述,不同全谷物輔料對啤酒內源性抗氧化力的影響有明顯區別。其中藜麥、蕎麥和青稞參與釀造啤酒都能夠提升啤酒的內源性抗氧化力,薏米啤酒、糙米啤酒和高粱啤酒對啤酒的內源性抗氧化力提升有限。研究表明,酚類化合物是啤酒中最有影響力的抗氧化劑,總多酚含量對內源性抗氧化力的貢獻約為68%[26]。由圖1-b可知,各啤酒樣品之間的總多酚和總黃酮含量都比較接近,因此直接用總多酚和總黃酮含量不能反映不同谷物對啤酒內源性抗氧化力提升幅度,仍需要檢測其中的單酚物質含量。

2.3 不同全谷物輔料啤酒中單酚類物質分析

利用HPLC檢測出全谷物輔料及其釀造啤酒中10種單酚物質的含量,包括沒食子酸、兒茶素、p-香豆酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、阿魏酸、綠原酸、原兒茶酸和香草酸,分別見表3和表4。

表3 不同全谷物中單酚類物質含量 單位:mg/100 g

表4 不同全谷物輔料啤酒中單酚類物質含量 單位:mg/L

由表3可知,所有全谷物樣品中均能檢測出p-香豆酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、阿魏酸和香草酸。不同的谷物樣品中,各種單酚類物質含量存在一定差異。藜麥、蕎麥和青稞中單酚類物質總含量均高于大麥麥芽,高粱中單酚類物質總含量和大麥麥芽接近,薏米和糙米單酚類物質總含量均低于大麥麥芽。

由表4可知,所有全谷物輔料啤酒樣品中均能檢出沒食子酸、兒茶素、p-香豆酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、阿魏酸和香草酸。谷物輔料的添加量均為20%,對照組中除原兒茶酸外,其余單酚類物質均可以檢出,這可能是啤酒樣品中能檢測出更多種類的單酚類物質的原因,且酒花的添加也是啤酒樣品中檢測出更多單酚類物質的原因。不同啤酒樣品中,各種單酚類物質含量存在一定差異。從總量來看,藜麥啤酒最高,含量為8.18 mg/L;其次是青稞啤酒和蕎麥啤酒,含量分別為7.02、6.62 mg/L,均高于對照組。糙米啤酒和高粱啤酒單酚類物質總量與對照組比較接近,薏米啤酒遠低于對照組,這些和谷物中單酚物質總量的高低相一致。

單酚類物質抗氧化力的強弱與其種類、功能團和分子構象有關。邵郅勝等[27]研究了歐李葉片酚類物質含量與其抗氧化活性的關系,發現各酚類物質含量與其抗氧化活性存在明顯的協同變化關系,抗氧化活性隨著各酚類物質含量增加或降低而升高或降低。酚類物質的酚羥基結構中的鄰位酚羥基很容易被氧化成醌類結構,會消耗環境中的氧及活性氧自由基,這使其具有較強的抗氧化性及清除自由基的能力[28]。趙海峰[29]考察了不同因素對單酚類物質的抗氧化活性的影響,發現沒食子酸、兒茶素、咖啡酸、表兒茶素和原兒茶酸的抗氧化力較高,以這5種抗氧化活性較強的單酚類物質總含量為評價指標。對照組含量為2.11 mg/L;青稞啤酒中含量最高,達到4.32 mg/L;藜麥啤酒和蕎麥啤酒含量分別為3.67和3.62 mg/L;薏米啤酒含量最低,僅有1.45 mg/L。綜上所述,青稞啤酒、藜麥啤酒和蕎麥啤酒中酚類物質含量均高于對照組,也表明青稞、藜麥和蕎麥作為輔料能夠提高啤酒的內源性抗氧化力。

2.4 不同全谷物輔料啤酒風味物質含量和感官評價

啤酒中高級醇類和酯類物質是在發酵過程中產生,主要包括正丙醇、異丁醇、異戊醇和乙酸乙酯、乙酸異戊酯,是啤酒的主要風味物質。高級醇與酯類物質的含量比在3∶1～5∶1時,啤酒風味就比較協調、柔和且不容易上頭[30]。本文考察了不同全谷物輔料釀造啤酒,對啤酒的主要醇酯類風味物質形成的影響,成品啤酒中主要風味物質測定結果和感官評分表見表5和表6。

表5結果顯示,使用不同谷物釀造的啤酒中醇酯含量有較大差異,所有輔料參與釀造的啤酒中醇酯比均低于對照組,而且藜麥啤酒和蕎麥啤酒中的醇酯比都遠低于其他樣品,表明藜麥和蕎麥的加入可以提高啤酒的飲用舒適感。由表6結果可知,藜麥啤酒感官品評分最高,為78分;蕎麥啤酒和青稞啤酒分別為75分和74分,與對照組的75分比較接近。由表6可知,藜麥啤酒和蕎麥啤酒的風味物質指標良好,總體風味較為協調,更適合作為輔料進行啤酒釀造。

表5 不同全谷物輔料啤酒中主要風味物質含量 單位:mg/L

表6 不同谷物啤酒感官品評得分Table 6 Sensory evaluation scores of different beer samples

3 結論與討論

通過研究發現6種全谷物輔料釀造啤酒是可行的,對啤酒的正常發酵過程、理化指標沒有負面影響。不同全谷物輔料對啤酒內源性抗氧化力影響有明顯區別,其中藜麥、蕎麥和青稞參與釀造啤酒都能夠提升啤酒的內源性抗氧化力,這是由于藜麥、蕎麥和青稞中單酚類物質總含量較高。通過分析啤酒中主要風味物質含量、醇酯比,并進行啤酒感官品評,發現藜麥和蕎麥作為啤酒釀造輔料是較合適的,這2種谷物釀造的啤酒抗氧化指標較高、風味物質含量均衡及感官評分高。

隨著工坊啤酒的迅速發展,以及啤酒行業對提升啤酒新鮮度的不斷追求,充分挖掘富含內源性抗氧化成分的輔助原料參與釀造啤酒,將有潛在的應用前景與商業空間。