酪蛋白膠束/聚乳酸靜電紡絲復(fù)合纖維膜性質(zhì)及其對黃芩苷的負(fù)載性能研究

甄晨波,楊敏*,秦娟娟,鄭杰,廖海周,魏彥明,2*

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院,甘肅 蘭州,730070)2(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院,甘肅 蘭州,730070)

黃芩苷(C21H18O11,baicalin,BCL)是從雙子葉植物黃芩(Scutellariabaicalensis)根部分離得到的一種黃酮類化合物,具有抗炎、抑菌、抗腫瘤等多種藥理作用[1]。但由于BCL在水中的溶解度低,極大限制了其在食品及醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用。為了改善BCL的理化性質(zhì),眾多研究者將其制備成各種類型的制劑。CHEN等[2]將BCL和大豆磷脂共混后溶解于四氫呋喃中,隨后通過恒溫水浴回流和真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)制得BCL/大豆磷脂復(fù)合物,相較于游離BCL,復(fù)合物對1型鴨甲肝病毒表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制作用。LI等[3]將BCL乙醇溶液和β-環(huán)糊精水溶液共混60 ℃攪拌24 h后,將得到的懸浮液冷卻至室溫后過濾,隨后將濾液冷凍干燥72 h,制備出BCL/β-環(huán)糊精包合物,顯著提高了BCL的溶出速率和溶解度,且BCL的相對口服生物利用度提高了2倍。可見,適宜的負(fù)載和包封有利于改善BCL的理化性質(zhì)及生物利用度。然而,上述制劑制備過程多較為復(fù)雜。因此,有必要尋求一種簡單易行的技術(shù),構(gòu)建BCL的新制劑,改善其理化性質(zhì),擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。

靜電紡絲技術(shù)是一種制備平均直徑在亞微米到納米范圍內(nèi)超細(xì)纖維的新工藝。在此過程中聚合物溶液被置于可控電場中,當(dāng)施加的電壓達(dá)到臨界值,斥力超過表面張力后,射流就會從溶液的表面噴射出來,當(dāng)射流向接地的金屬收集器移動時(shí),溶劑蒸發(fā),超細(xì)干燥纖維沉積[4]。靜電紡絲具有簡單易行、制備率較高、成本低、纖維性能可控等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn);靜電紡絲納米纖維具有纖維直徑小、比表面積大、孔隙率高等特點(diǎn)[5];可對功能因子進(jìn)行負(fù)載和可控制釋放,提高功能因子的溶出率[6]。YANG等[7]利用靜電紡絲技術(shù)制備了聚乙烯醇/乙基纖維素/茶多酚復(fù)合納米纖維膜,該纖維膜具有較好耐水性和水蒸氣阻隔性能,且表現(xiàn)出良好的抗氧化和抗菌活性,可使豬肉的貨架期延長3 d。

雖然目前的靜電紡絲基料主要集中在合成聚合物上,但天然生物聚合物具有可再生和可持續(xù)的優(yōu)異特性,使得基于天然聚合物的纖維具有極好的生物相容性和可降解性。因此蛋白質(zhì)等天然聚合物成為靜電紡絲的新型理想基料。

酪蛋白是牛奶中含量最高的蛋白質(zhì),由αs1-、αs2-、β-、κ-酪蛋白4部分組成,占牛奶蛋白的80%;其價(jià)格低廉,易于獲得,可生物降解,并且具有較高的營養(yǎng)價(jià)值。天然狀態(tài)的酪蛋白與鈣結(jié)合并組裝成一種獨(dú)特的膠束結(jié)構(gòu),稱為酪蛋白膠束(casein micelle,MC),其粒徑范圍為50～600 nm,平均粒徑為150 nm[8]。MC具有內(nèi)部疏水、表面親水的特殊結(jié)構(gòu),是負(fù)載活性分子的優(yōu)良基質(zhì)。已有研究表明,MC可作為咖啡酸、咖啡酸苯乙酯、原花青素的良好載體,用于改善活性因子的理化性質(zhì)和抗氧化性[9-10]。然而,目前以MC為基質(zhì),通過靜電紡絲技術(shù)制備纖維膜,以負(fù)載活性因子的研究報(bào)道較少。

聚乳酸(poly lactic acid,PLA)是一種脂肪族熱塑性聚酯,由玉米、土豆等可再生資源生產(chǎn),具有安全性高、機(jī)械性能好、成本低等優(yōu)點(diǎn);并且具有良好的生物相容性和生物可降解性,是一種已被美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)的醫(yī)用輔料[11-12]。近年來,PLA已被廣泛用作靜電紡絲基料,用于負(fù)載活性因子。有報(bào)道利用靜電紡絲PLA纖維負(fù)載香芹酚,實(shí)現(xiàn)了香芹酚的控釋[13]。另外,采用靜電紡絲技術(shù)制備的PLA/絲素蛋白納米纖維用于負(fù)載扶他林,可對扶他林進(jìn)行控釋,對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出良好的抑制效果[14]。但是,將PLA和MC共混制備靜電紡絲纖維并進(jìn)行生物活性分子的負(fù)載研究報(bào)道較少。

本文以PLA和MC為基料,采用靜電紡絲技術(shù)制備出負(fù)載BCL的復(fù)合纖維膜;采用傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared,FTIR)、掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)等手段表征了復(fù)合纖維膜的結(jié)構(gòu),進(jìn)而分析了復(fù)合纖維膜的理化性質(zhì),并評價(jià)了復(fù)合纖維膜中BCL的釋放特性。研究結(jié)果不僅可為BCL的負(fù)載提供技術(shù)依據(jù),而且可為拓寬MC和PLA的應(yīng)用領(lǐng)域提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃芩苷、聚乳酸、六氟異丙醇,上海麥克林生化科技有限公司,其他試劑均為分析純。酪蛋白膠束,實(shí)驗(yàn)室自制,總蛋白質(zhì)含量為(83.26±1.87)%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

1.2 設(shè)備

Nicolet iS50型FTIR光譜儀,美國賽默飛世爾科學(xué)公司;XD3型X射線多晶衍射儀,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;STA 449 F5型TG-DSC熱分析儀,德國耐馳儀器制造有限公司;UV-1780雙光束紫外可見分光光度計(jì),島津儀器有限公司;HP-200精密色差儀,河南兄弟儀器設(shè)備有限公司;E05靜電紡絲機(jī),佛山輕子精密測控技術(shù)有限公司;CA200自動型光學(xué)接觸角測量儀,廣東北斗精密儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 紡絲共混溶液的制備

稱取適量的MC溶解于六氟異丙醇中,準(zhǔn)確稱取80 mg的BCL,溶于六氟異丙醇中制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液。將8 mL的BCL溶液加入8 mL MC溶液中,37 ℃下磁力攪拌1 h。在上述溶液中加入適量的PLA,繼續(xù)攪拌4 h后得到MC和PLA質(zhì)量比為1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1的靜電紡絲共混溶液(所有比例下MC和PLA總質(zhì)量為2.56 g)。以不含MC的共混液作為對照。

1.3.2 靜電紡絲纖維膜制備

將配制好的MC/PLA/BCL共混溶液吸入10 mL注射器中,配備20 G鋼針,安裝于注射泵上,采用靜電紡絲機(jī)進(jìn)行纖維膜制備。紡絲速度1.0 mL/h,電壓19 kV,針尖-滾筒接收間距12.5 cm,滾筒轉(zhuǎn)速120 r/min,紡絲溫度25 ℃。將收集的纖維膜置于密封袋中,備用。

1.3.3 SEM表征

將纖維膜置于導(dǎo)電硅膠上,噴金后采用S-3400 N掃描電子顯微鏡觀察表面形貌。

1.3.4 FTIR分析

將纖維膜樣品置于衰減全反射元件上,設(shè)置光譜分辨率為4 cm-1,掃描32次,記錄樣品在400～4 000 cm-1的紅外光譜。

1.3.5 X射線衍射(x-ray diffraction,XRD)分析

采用X射線單晶衍射儀在Cu Kα輻射下對纖維膜進(jìn)行XRD掃描。

1.3.6 差示掃描量熱-熱重(differential scanning calorimetry-thermogravimetry,DSC-TG)分析

用DSC-TG熱分析儀測定樣品的熱分解特性。準(zhǔn)確稱取6～8 mg樣品,置于Al2O3坩鍋中,以10 ℃/min的升溫速率從30 ℃加熱至500 ℃,用空坩堝作空白對照。

1.3.7 色度分析

使用精密色差儀對樣品色度進(jìn)行測量,顏色結(jié)果表示為L*(亮度),a*(紅度),b*(黃度)。樣品色差ΔE的計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

1.3.8 接觸角測定

將纖維膜裁剪成2 cm×2 cm的矩形,利用接觸角儀測量其水接觸角,評價(jià)復(fù)合纖維膜的疏水性。

1.3.9 溶脹性和降解性

參考GHORBANI等[15]的方法對復(fù)合纖維膜的溶脹性和降解性進(jìn)行測定,略有修改。

溶脹性的測定:將纖維膜裁剪成2 cm×2 cm的矩形并稱重。隨后,將纖維膜浸泡在25 ℃、0.05 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液中,分別在0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、10、12、24 h時(shí)將纖維膜從緩沖液中取出,用吸水紙去除表面水分,稱重。溶脹性計(jì)算如公式(2)所示:

(2)

式中:m0,纖維膜初始質(zhì)量,g;mt,纖維膜各時(shí)間點(diǎn)溶脹后的質(zhì)量,g。

降解性的測定:將纖維裁剪成2 cm×2 cm的矩形并稱重。隨后,將纖維膜在25 ℃、0.05 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液中浸泡48 h。然后,將未溶纖維膜小心取出,在60 ℃下干燥48 h,稱重。降解性計(jì)算如公式(3)所示:

(3)

式中:m0,纖維膜初始質(zhì)量,g;m,纖維膜浸泡48 h后剩余質(zhì)量,g。

1.3.10 黃芩苷的體外釋放分析

參考TAN等[16]的方法分析纖維膜中BCL的體外釋放特性,略有修改。準(zhǔn)確稱取100 mg樣品,置于具塞錐形瓶中。加入50 mL 0.05 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液,于37 ℃、130 r/min下恒溫振蕩。分別在設(shè)定時(shí)間點(diǎn)取3 mL溶液,同時(shí)補(bǔ)充3 mL緩沖溶液。使用紫外-可見分光光度計(jì)在360 nm處測定釋放液的吸光度,利用同條件下BCL的標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=33.506 74x,R2=0.999 96)計(jì)算BCL累積釋放率。

(4)

式中:ρ0,樣品中BCL總質(zhì)量濃度,mg/mL;ρt,t時(shí)刻時(shí)釋放的BCL質(zhì)量濃度,mg/mL。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3次,試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010處理并用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,用Origin Pro 9.0作圖,用SPSS 22進(jìn)行差異顯著性分析,數(shù)據(jù)間差異顯著分析采用Duncan法。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合纖維膜的微觀形貌觀察

如圖1所示,游離BCL和凍干MC為片層狀結(jié)構(gòu)。PLA纖維膜為均勻纖維狀結(jié)構(gòu),直徑為1～1.5 μm。添加BCL使PLA纖維出現(xiàn)輕微的卷曲現(xiàn)象,且直徑略有增大。這可能是由于BCL與PLA產(chǎn)生相互作用,在PLA分子鏈間形成了交聯(lián)作用,進(jìn)而改變了紡絲溶液的黏度,使紡絲溶液在靜電紡絲過程中無法充分拉伸,造成了纖維伸展性降低,與SUN等[17]的研究結(jié)果一致。隨著MC添加比例在0∶1到1∶1范圍內(nèi)的升高,纖維的整體有序性、均勻性和成纖性逐漸變差,且纖維直徑減小,并出現(xiàn)輕微的珠狀結(jié)構(gòu)。當(dāng)MC的添加量進(jìn)一步增加到與PLA的比例為1∶1時(shí),纖維直徑進(jìn)一步減小,并出現(xiàn)較大的珠狀結(jié)構(gòu)。這是因?yàn)殡S著MC添加量的增加,紡絲溶液的黏度降低,共混物中的分子鏈纏結(jié)不足,使其成纖能力下降,紡絲過程中出現(xiàn)靜電噴涂現(xiàn)象,產(chǎn)生較大的珠狀結(jié)構(gòu),并使纖維的均勻度下降。BIRANJE等[18]在此前研究中也發(fā)現(xiàn)隨著酪蛋白添加量的增加,酪蛋白/聚乙烯醇纖維中珠狀結(jié)構(gòu)也隨之增大。

圖1 復(fù)合纖維膜SEM圖Fig.1 SEM images of composite fiber membranes注:0∶1、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1和3∶1代表MC和PLA的質(zhì)量比; 80代表BCL的添加量為80 mg。

研究指出,PLA溶液的流動行為指數(shù)小于1,表現(xiàn)為非牛頓剪切稀化行為,這種特性可以增加聚合物鏈的纏結(jié),進(jìn)而使靜電紡絲纖維直徑增大[19-20]。另一方面,MC粒徑小于PLA分子鏈的長度,隨著PLA比例的減小,紡絲溶液中的鏈纏結(jié)下降,因此復(fù)合纖維直徑減小。當(dāng)MC與PLA質(zhì)量比進(jìn)一步增加到2∶1和3∶1時(shí),纖維直徑不再減小,約為0.5 μm。這可能是由于MC添加量進(jìn)一步增大,MC粒子間相互作用增強(qiáng),通過相互作用形成了穩(wěn)定的紡絲溶液。可見,MC與PLA質(zhì)量比為2∶1時(shí)具有較好的成纖性能,可通過調(diào)節(jié)MC和PLA的比例實(shí)現(xiàn)對纖維直徑的調(diào)控。

2.2 復(fù)合纖維膜的FTIR分析

圖2 復(fù)合纖維膜FTIR圖Fig.2 FTIR images of composite fiber membranes

2.3 復(fù)合纖維膜的XRD分析

如圖3所示,MC和PLA均出現(xiàn)較寬的峰,說明二者均呈現(xiàn)無定形結(jié)構(gòu)。BCL在12.48°、14.76°、17.08°、21.38°、23.80°、25.52°、28.12°和34.88°處出現(xiàn)特征晶體衍射峰,表明BCL為晶體形態(tài)[21]。然而,PLA/BCL和MC/PLA/BCL纖維膜中BCL的特征衍射峰消失,表明BCL被PLA和MC/PLA完全包封,這與FTIR研究結(jié)果一致。在MC/PLA/BCL纖維膜中出現(xiàn)MC的衍射峰,但強(qiáng)度小于單一MC的強(qiáng)度,并且輕微左移,這可能是因?yàn)镻LA的加入改變了原溶液的性質(zhì),且產(chǎn)生了非共價(jià)相互作用。

圖3 復(fù)合纖維膜XRD圖Fig.3 XRD images of composite fiber membranes

2.4 復(fù)合纖維膜的熱分解特性分析

由圖4-a可知,BCL在221 ℃附近出現(xiàn)熔融吸收峰;PLA纖維膜在66 ℃附近出現(xiàn)吸收峰,為PLA的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度[22],且在170 ℃附近出現(xiàn)熔融吸收峰。PLA/BCL和MC/PLA/BCL復(fù)合纖維膜表現(xiàn)出與PLA相似的DSC曲線,這是因?yàn)閺?fù)合纖維膜具有相似的結(jié)構(gòu)。但在MC/PLA/BCL復(fù)合纖維膜中PLA的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度略有降低,這可能是因?yàn)锽CL和MC的加入使PLA在靜電紡絲過程中改變了聚合物分子鏈的排列,打亂了PLA原有分子鏈的排列規(guī)則。HAN等[23]研究發(fā)現(xiàn),茶多酚和肉桂醛的加入使聚乳酸纖維膜的玻璃化轉(zhuǎn)化溫度略有降低,與本文研究結(jié)果一致。

a-DSC曲線;b-TG曲線圖4 復(fù)合纖維膜DSC-TG曲線Fig.4 DSC-TG curves of composite fiber membranes

如圖4-b所示,MC和BCL分別在270～410 ℃和200～350 ℃失重,表明分子熱分解。PLA纖維膜在260～360 ℃出現(xiàn)較大的質(zhì)量損失,由PLA鏈斷裂所致[24]。所有纖維膜均在60 ℃開始失重,這是由于溶劑蒸發(fā)所致。與PLA纖維膜相比,PLA/BCL纖維膜開始失重的溫度升高,表明BCL的添加增強(qiáng)了PLA纖維膜的熱穩(wěn)定性。與PLA/BCL纖維膜相比,MC/PLA/BCL纖維膜表現(xiàn)出更高的質(zhì)量保留率,表明MC的添加進(jìn)一步提高了復(fù)合纖維膜的熱穩(wěn)定性。這是因?yàn)樘砑覯C后,MC與PLA之間可產(chǎn)生非共價(jià)相互作用,且MC粒子之間存在相互作用,從而使纖維膜的熱穩(wěn)定性進(jìn)一步增強(qiáng)。AYDOGDU等[25]研究發(fā)現(xiàn),添加大豆蛋白降低了聚環(huán)氧乙烷/羥丙甲纖維素纖維膜的質(zhì)量損失,增強(qiáng)了復(fù)合纖維膜的熱穩(wěn)定性,與本文的研究結(jié)果一致。

2.5 復(fù)合纖維膜的水接觸角和色度分析

由圖5和表1可知,PLA膜疏水性較強(qiáng),是一種典型的疏水材料[26]。所有纖維膜的水接觸角均大于90°,表現(xiàn)出明顯的疏水特性。BCL對單一PLA纖維膜的水接觸角影響不大,這可能是因?yàn)锽CL添加量較少,且被完全包封在纖維中。隨著MC的添加,復(fù)合纖維膜的水接觸角逐漸減小。這可能是因?yàn)殡S著MC比例的增加,纖維外層的MC增加,使其疏水性下降。另一方面,隨著MC添加比例的增大,纖維直徑減小,纖維排列成膜時(shí)的間隙增加,水接觸角減小。有研究表明,纖維直徑越小,孔隙率越高,吸水率增大,接觸角減小[27]。

圖5 復(fù)合纖維膜水接觸角圖Fig.5 Water contact angle diagram of composite fiber membranes

色度方面,負(fù)載BCL的復(fù)合膜亮度值L*為93～95,表現(xiàn)出一定的黃色度,這是由于BCL呈現(xiàn)黃色度所致。隨著MC添加比例的增大,復(fù)合膜的a*值逐漸減小,b*值基本呈現(xiàn)增大的趨勢。可見,MC的添加降低了BCL的紅色度;且因其呈現(xiàn)乳黃色,因此增加了復(fù)合纖維膜的黃色度。

表1 復(fù)合纖維膜的接觸角及色度Table 1 Water contact angle and chromaticity of composite fiber membranes

2.6 復(fù)合纖維膜的降解性分析

如圖6所示,PLA纖維膜和PLA/BCL纖維膜在48 h內(nèi)的降解率均低于8%,負(fù)載BCL對PLA纖維膜的降解率影響不大。PLA作為一種典型的疏水材料,其在水中降解性較差。隨著MC添加比例在0∶1～1∶1增加,纖維膜的降解率明顯增大,這是因?yàn)镸C增加了纖維膜的溶解性。但當(dāng)MC比例進(jìn)一步增加到2∶1和3∶1后,纖維膜的降解率隨MC添加量的增加變化不顯著(P<0.05),這可能是因?yàn)楫?dāng)MC/PLA的比例超過1∶1后,復(fù)合纖維膜由PLA包覆MC型轉(zhuǎn)變?yōu)镸C包覆PLA型,因此MC的添加量增加對復(fù)合纖維膜降解率影響不大。另外,在MC與PLA的比例為0∶1～2∶1,復(fù)合纖維膜的降解率隨MC添加量的增加呈線性增大。可見,可通過添加MC以調(diào)節(jié)PLA纖維膜的降解率。

圖6 復(fù)合纖維膜降解率Fig.6 Degradation rate of composite fiber membranes

2.7 復(fù)合纖維膜的溶脹性分析

由圖7和表2可知,PLA纖維膜和PLA/BCL纖維膜在24 h的溶脹率只有(9.25±1.05)%和(8.82±0.62)%。添加一定量MC后,纖維膜的溶脹性迅速增大,這是因?yàn)镸C為水溶性多孔粒子,具有較高的水合性;且隨著MC的添加,纖維直徑減小,纖維間孔隙增大,吸水性增強(qiáng)。MC與PLA比例為1∶3的復(fù)合纖維膜溶脹性最好,在2 h達(dá)到最大溶脹率(228.28±3.95)%。之后,隨著MC添加量的進(jìn)一步增大,復(fù)合纖維膜最大溶脹率逐漸降低,達(dá)到最大溶脹率的時(shí)間也有所減少。這是因?yàn)镸C是水溶性分子,其在水中溶解,使膜的質(zhì)量降低所致,與LIU等[28]的研究結(jié)果相似。

圖7 復(fù)合纖維膜溶脹性Fig.7 Swelling rate of composite fiber membranes

表2 復(fù)合纖維膜最大溶脹率及最大溶脹時(shí)間Table 2 Maximum swelling rate and its time of composite fiber membranes

2.8 復(fù)合纖維膜中BCL的體外釋放性分析

如圖8所示,游離BCL在緩沖液中迅速釋放,且隨著時(shí)間的延長釋放率降低,說明其發(fā)生了輕度降解,與已有報(bào)道類似[29]。由于PLA為疏水性分子,經(jīng)PLA負(fù)載后,BCL釋放率極低。在MC/PLA/BCL復(fù)合纖維膜中,BCL在2 h內(nèi)迅速釋放,之后釋放率迅速減緩,并在3 h后維持穩(wěn)定。由于MC水溶性較好,其添加量越多,BCL釋放率越高。包封在玉米醇溶蛋白纖維中的姜黃素也表現(xiàn)出10 min內(nèi)爆發(fā)性釋放的特性,與本文研究結(jié)果類似[30]。由此可見,添加MC有利于增加BCL從PLA纖維膜中的釋放率。

圖8 復(fù)合纖維膜中BCL釋放率曲線Fig.8 Profiles of BCL release rate from composite fiber membranes

3 結(jié)論

以PLA和MC為基質(zhì),采用靜電紡絲技術(shù)制備了復(fù)合纖維膜,實(shí)現(xiàn)了BCL的負(fù)載。當(dāng)MC與PLA質(zhì)量比達(dá)到2∶1后,復(fù)合纖維具有較規(guī)則的形貌,且直徑較小。添加MC改善了PLA纖維膜的疏水性,提高了其溶脹率,且增加了BCL的釋放率。另外,MC的添加降低了纖維膜的紅色度,增加了黃色度,改善了顏色。經(jīng)MC/PLA復(fù)合纖維膜負(fù)載后,減緩了BCL的釋放率。