膜濾工藝中添加Fe2+及在不同干燥工藝條件下對牛乳膠束酪蛋白的結構及功能性質的影響

馮子真,楊繼濤*,鄭杰,秦娟娟,楊敏

1(甘肅農業大學 農業資源化學與應用研究所,甘肅 蘭州,730070)2(甘肅農業大學 理學院,甘肅 蘭州,730070)

牛乳酪蛋白是牛奶中最主要的蛋白質組分,約占蛋白質總量的80%,因其產量巨大,受到了人們廣泛關注。牛乳酪蛋白結構具有脯氨酸和谷氨酰胺組成的序列,并且鈣與磷蛋白相結合,導致了天然的分子親和力,其通過疏水、氫鍵以及靜電相互作用,使得數千個酪蛋白分子聚集在一起形成了膠束態酪蛋白[1-2]。食品工業中,可以采用加酸沉降法提取牛乳酪蛋白,但是會破壞膠束酪蛋白的原有形態,所以人們一直致力于提取酪蛋白的新工藝的開發與研究。

膜濾工藝是一種分離技術,其原理是利用不同分子質量截留膜及加壓循環裝置,來達到分離目的。牛乳中各成分分子質量差距較大,使用膜濾工藝可以高效地提取酪蛋白,分離過程中只需加水循環洗滌,故能最大程度保持酪蛋白的原有結構,所得酪蛋白是一種穩定且無定形的聚集物的形式,稱為膠束酪蛋白濃縮物(micellar casein concentrates,MCC)[3-4]。

鐵元素是人體必需元素之一,在運輸O2以及增強免疫方面均起到重要作用。食用蛋白與鐵相互作用,一直受到研究者們關注,通過蛋白質溶液體系下對鐵離子絡合,輔助以冷凍干燥及噴霧干燥等手段,來考察鐵離子對蛋白質結構與食品功能性影響。例如,BANJARE等[5]使用噴霧干燥技術絡合乳清蛋白與鐵從而改善了其生物可及性;ESTRADA等[6]使用豌豆蛋白與鐵進行包埋后探究其氧化等理化特性,然而目前對于膠束酪蛋白濃縮物作為鐵離子的基礎載物的研究鮮有報道。

在此次研究中利用膜濾工藝提取牛乳酪蛋白,工藝中采用不同濃度Fe2+水溶液進行多次洗滌,利用冷凍干燥及噴霧干燥2種工藝制備出不同的樣品。利用紫外、紅外、熒光光譜以及圓二色譜等手段分析Fe2+對膠束酪蛋白濃縮物的二級結構影響,并探究其熱穩定性、溶解性、濁度、吸油及乳化性等理化性質變化規律,以期對膠束酪蛋白濃縮物產品的生產與開發提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

巴氏殺菌奶(當日),蘭州莊園牧場股份有限公司(中國蘭州);大豆油,益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司;FeCl2、十二烷基硫酸鈉、姜黃素(均為分析純),上海麥克林生化科技有限公司。

H1850臺式離心機,湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;RNF0460-01膜濾機,廈門福美科技有限公司;FD-1-50冷凍干燥機,北京博醫康實驗儀器有限公司;NAI-GZJ噴霧干燥機,上海那艾精密儀器有限公司;AD500S-H高速均質機,上海昂尼儀器儀表有限公司;TU-1901雙光束分光光度計,北京普析通用儀器有限責任公司;RF-5301PC熒光分光光度計,日本津島公司;JASCOJ-1700圓二色譜儀,日本分光株式會社;STA449 F5熱分析儀,德國耐馳儀器制造有限公司,實驗用水均為二次蒸餾水。

1.2 膠束酪蛋白濃縮物的制備

根據GB 5749—2022《生活飲用水衛生標準》,鐵離子質量濃度含量不超過0.3 mg/L,因此選擇配制Fe2+為0.1、0.2、0.3 mg/L水溶液進行膜濾洗滌。二次蒸餾水作為空白對照組。先將巴氏殺菌牛乳在4 000×g離心20 min進行脫脂,后經過100 kDa有機膜的微濾系統,采取0.5 MPa跨膜壓力,按照Fe2+水溶液∶脫脂奶=4∶1(體積比)水洗脫鹽脫糖后,微濾濃縮至1 L的酪蛋白膠束溶液,分別經過冷凍干燥(freeze drying,FD)及噴霧干燥(spraying drying,SD)得到2組工藝組合下MCC樣品,根據添加Fe2+濃度分別標記為MCC-Fe0,MCC-Fe0.1,MCC-Fe0.2,MCC-Fe0.3。

1.3 紫外可見光譜(ultraviolet-visible spectrum,UV)

分別配制不同MCC樣品,質量濃度均為1.0 mg/mL,用二次蒸餾水作為空白,使用雙光束分光光度計在波長190～320 nm進行紫外吸收光譜掃描。

1.4 熒光光譜測定(fluorescence spectrometry,FS)

分別配制不同MCC樣品,質量濃度均為1.0 mg/mL,使用熒光分光光度計對290～700 nm內記錄發射光譜,選擇激發波長為280 nm,發射狹縫及激發狹縫為10 nm進行熒光光譜分析。

1.5 傅里葉紅外光譜分析(Fourier transform infrared spectrometer,FTIR)

使用傅里葉紅外光譜儀(Nicolet iS50 FTIR,美國賽默飛世爾科學公司)進行紅外光譜掃描,掃描范圍400～4 000 cm-1,掃描32次,分辨率為4 cm-1。

1.6 圓二色譜分析(circular dichroic chromatography,CD)

分別配制不同MCC樣品,質量濃度均為0.5 mg/mL,使用圓二色譜儀進行解析,設定溫度4 ℃,光譜范圍190～260 nm,選擇楊氏算法計算相關二級結構含量,所有樣品均已重復3次實驗。

1.7 熱重分析(thermogravimetry-derivative thermogravimetry,TG-DTG)

參考DOH等[7]的方法,略有修改。選擇溫度范圍25～600 ℃,升溫速率6 ℃/min,保護氣流速50 mL/min,反應氣流速50 mL/min,均為N2氣氛,使用熱分析儀(STA 449 F5,德國耐馳儀器制造有限公司)對樣品進行熱穩定性分析。

1.8 溶解度分析

參考CANO-CHAUCA等[8]的方法,分別配制10.0 mg/mL MCC溶液,取10 mL放置于離心管中,使用高速離心機以4 000 r/min離心10 min,小心去除上清液,放置于鼓風干燥箱內,恒溫60 ℃干燥至恒重,記為A1,原樣品質量記為A2,平行3次,取其平均值,以此測定相應溶解度。溶解性的計算如公式(1)所示:

(1)

1.9 濁度分析

配制1.0 mg/mL的MCC溶液,使用紫外可見分光光度計在860 nm處測定MCC溶液吸光度值,以吸光度大小表述溶液的濁度,去離子水做對比,平行測定3次,取其平均值,以此測定所有樣品濁度。

1.10 吸油性分析

參考楊敏等[9]的方法對吸油性進行測定,將0.5 g不同MCC樣品分別與5 mL大豆油渦旋5 min,靜置后使用離心機以4 000×g離心30 min,離心后將油層吸除,稱取沉淀質量。吸油性的計算如公式(2)所示:

(2)

1.11 乳化性及乳化穩定性分析

參考JIANG等[10]的方法測定乳化活力指數(emulsifying activity index,EAI)及乳化穩定性(emulsion stability index,ESI),將8 mL大豆油與24 mL質量濃度為2.0 mg/mL MCC溶液在高速均質機下以10 000 r/min均質1 min,混合均勻后靜置,分別取靜置0、30 min的50 μL膠束酪蛋白溶液與5 mL質量濃度為1.0 g/L的十二烷基硫酸鈉溶液混合后,利用分光光度法在500 nm測定其吸光度。乳化性的計算如公式(3)、公式(4)所示:

(3)

(4)

式中:ρ,初始溶液的質量濃度,g/mL;φ,光徑1 cm;θ,乳狀液中油相體積分數(θ=0.25);A0,起始吸光度;A30,30 min的吸光度。

1.12 數據及顯著性分析

采用SPSS Statistics 22、Origin 9對實驗數據進行統計分析,數據用平均值±標準偏差表示,差異性利用小寫字母標識(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 UV分析

紫外吸收光譜如圖1所示,樣品在277 nm左右出現吸收峰,其中凍干組吸光度明顯高于噴干組,這種結果是由于特征氨基酸基團暴露增加所造成的。在凍干組中,隨著Fe2+濃度增加,吸光度發生減少。這是由于Fe2+與酪氨酸、色氨酸中基團發生了相互締合作用,并且濃度越大作用力越強。噴干組具有類似規律,MCC-Fe0.1-SD吸光度達到最高,這可能是由于加入少量Fe2+后,加之隨著噴干過程的進行反而讓MCC中酪氨酸、色氨酸發生了暴露。

2組樣品的吸光度都會隨著離子濃度的增大發生藍移,最大吸收波長都出現由277 nm藍移至275 nm,這說明MCC中色氨酸和酪氨酸所處微環境發生改變,MCC的二級結構可能發生變化[11]。

a-噴霧干燥;b-冷凍干燥圖1 不同Fe2+濃度下的MCC的紫外吸收光譜圖Fig.1 UV absorption spectra of MCC at different Fe2+ concentrations

2.2 FS分析

樣品熒光光譜如圖2所示,2組樣品的最大熒光強度都出現在對照組中,加入Fe2+后熒光強度都有明顯下降,Fe2+具有淬滅效果,可能由于在解離折疊作用下,色氨酸會暴露于親水環境中[12]。噴干樣品組隨著Fe2+濃度的增加,熒光強度逐漸減小,而凍干組加入離子后呈現與噴干組相反趨勢。

a-噴霧干燥;b-冷凍干燥圖2 不同Fe2+濃度下的酪蛋白膠束的熒光光譜圖Fig.2 Fluorescence spectra of casein micelles at different Fe2+concentrations

2組對比可以得到:凍干組樣品熒光強度普遍小于噴干組,這可能是由于干燥工藝的不同導致疏水性差異。已有研究表明,凍干樣品的表面疏水性低于噴干樣品,這與本研究結果一致[13]。

根據KEERATI-U-RAI等[14]的理論,蛋白質結構松散從而使得色氨酸殘基暴露,表明蛋白質內色氨酸與酪氨酸殘基微環境的改變。隨著Fe2+濃度增大,最大發射波長也隨之發生紅移,這也反映了MCC二級結構發生變化。

2.3 FTIR分析

樣品紅外可見光譜如圖3所示,在2 919 cm-1處出現的吸收峰是C—H鍵的伸縮振動峰,但是各個樣品之間的C—H伸縮振動并沒有太大變化,這表示Fe2+濃度及干燥工藝的不同并沒有對樣品氫鍵發生顯著改變,3 400 cm-1左右的峰主要歸屬于蛋白質負載水的信號峰,可以看出凍干樣品水峰強度大于噴干樣品,說明凍干樣品含水量大于噴干樣品[15]。

圖3 不同Fe2+濃度下的酪蛋白膠束的紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectra of casein micelles at different Fe2+ concentrations

2.4 CD分析

可以在圖4中看到,干燥工藝與Fe2+添加均對MCC二級結構產生了影響,噴干組中未檢測出α-螺旋結構,隨著Fe2+的加入β-折疊含量發生減少,轉角含量逐漸增大,無規卷曲含量也有所增加。凍干組樣品中在Fe2+濃度最大一組中并未檢測到α-螺旋,β-折疊與無規卷曲在Fe2+質量濃度0.3 mg/L時含量最大,轉角含量在0.2 mg/L最大。

圖4 不同Fe2+濃度下的酪蛋白膠束的圓二色譜分析圖Fig.4 Circular dichroism of casein micelles at different Fe2+ concentrations注:不同小寫字母代表差異顯著,P<0.05(下同)。

根據顯著性分析可以看到,α-螺旋在凍干組具有明顯差異(P<0.05),差異性出現在0.2 mg/L組,同樣的在噴干組時,β-折疊、無規卷曲與轉角的差異性也出現在0.2 mg/L處。而在凍干組β-折疊與轉角的差異性出現在0.1與0.2 mg/L處,無規卷曲的差異性出現在0.3 mg/L處。

差異性對比可以看到在加入Fe2+后,樣品的二級結構發生了改變,與之前紅外、紫外及熒光光譜所得到的研究結果保持一致。

2.5 TG-DTG分析

通過圖5可以看到,凍干組MCC在347.5 ℃處出現一個失重峰,隨著不同濃度Fe2+的加入,失重峰升溫至362.5、354、362 ℃處,這說明樣品的熱穩定性與對照組相比有了明顯的提升,其中在質量濃度為0.1 mg/L處的熱穩定性最好。噴干樣品失重峰溫度均高于對應凍干組,這是由于噴干工藝下蛋白質顆粒更加緊密造成的。隨著Fe2+濃度的增大,失重峰溫度提升,這說明了在此時加入Fe2+會使得熱穩定性升高,這與凍干組結果一致。在吸熱時,蛋白質處于熱變性的過程,蛋白質狀態呈現有序到無序的轉變,隨著溫度升高及濃度的變化,多肽鏈展開,使得酪蛋白變性的發生,說明適當添加Fe2+在加熱時有穩定蛋白質結構作用[17]。

a-噴霧干燥;b-冷凍干燥圖5 不同Fe2+濃度下的冷凍干燥與 噴霧干燥的酪蛋白膠束TG圖Fig.5 TG plots of freeze-dried and spray-dried casein micelles at different Fe2+ concentrations

2.6 溶解性分析

樣品的溶解性如圖6所示,凍干組溶解度均值略大于噴干組,不具有顯著性差異。

與相應對照組相比,加入Fe2+后的MCC溶解度均略有降低,但是并不顯著。添加Fe2+后,質量濃度達到0.2 mg/L時噴干與凍干樣品溶解度均最高,這可能是因為Fe2+加入后表面基團的變化,使得更多親水區域的暴露會讓MCC與水的相互作用更加明顯,從而導致溶解度的提升[18]。之前REN等[18]的研究提出,通過噴霧冷凍干燥工藝后,溶解性與MCC孔隙率、膠體磷酸鈣解離程度以及低溫等因素相關,通過冷凍干燥后,MCC的疏水作用力得到削弱。這些因素或許可以解釋冷凍干燥后的樣品溶解性相對于噴霧干燥后的樣品溶解性更高。

圖6 不同Fe2+濃度下的酪蛋白膠束的溶解度Fig.6 Solubility of casein micelles at different Fe2+ concentrations

2.7 濁度分析

樣品的濁度如圖7所示,加入Fe2+后濁度普遍大于對照組,這表明Fe2+加入,會提高MCC濁度。噴干組的濁度始終大于凍干組樣品,兩組之間具有顯著性差異,其中MCC-Fe0.3噴干樣品濁度最高。

圖7 不同Fe2+濃度下的酪蛋白膠束的濁度Fig.7 Turbidity of casein micelles at different Fe2+concentrations

噴干組樣品濁度隨添加Fe2+濃度增加而增加,這可能是由于Fe2+濃度的增大而導致MCC相互之間靜電斥力下降,發生團聚造成的現象[19]。凍干組樣品在Fe2+加入后,呈現先減小后增大的趨勢,實驗結果表明,隨著Fe2+的加入,MCC尺寸發生變化,內部結構可能發生坍塌解離或酪蛋白出現聚集導致濁度變化[20]。

2.8 吸油性

樣品的吸油性可以從圖8中看到,由于凍干樣品較能保持酪蛋白膠束原始狀態,其結構孔隙率較高,凍干樣品吸油性要明顯高于噴干樣品,其各組均值為噴干樣品3～5倍,具有顯著性差異。

圖8 不同Fe2+濃度下的酪蛋白膠束的吸油性Fig.8 Oil absorption of casein micelles at different Fe2+concentrations

其中噴干組隨著Fe2+濃度的增加,吸油量升高,在0.2 mg/L時吸油量達到最大,吸油量為(1.59±0.17) g/g,比對照組提升了16%。凍干組樣品吸油量均低于相應對照組,說明凍干條件下Fe2+添加會降低MCC的持油能力,Fe2+加入0.2 mg/L時持油能力降低幅度最小。

2.9 乳化活力指數與乳化穩定性分析

對于MCC的乳化活力指數,如圖9所示,Fe2+加入后出現明顯差異性,乳化活力指數與對照組相比都

a-乳化活力指數;b-乳化穩定性圖9 不同Fe2+濃度下的酪蛋白膠束的 乳化活力指數及乳化穩定性Fig.9 Emulsification vitality index and emulsion stability of casein micelles at different Fe2+ concentrations

出現明顯的升高,在質量濃度達到0.2 mg/L之后,噴干組的乳化活力指數相比于凍干組來說,出現了明顯升高,并且在0.3 mg/L時二者差距達到10%。

凍干組乳化活力指數在0.1 mg/L處乳化活力到達最大,之后隨著濃度的增大乳化活力逐漸降低。噴干組乳化活力指數呈現出隨Fe2+濃度的增加而增加的趨勢,在0.3 mg/L時乳化活力值達到最大。

凍干樣品的乳化穩定性隨著濃度的增大逐漸減小,這說明了Fe2+的加入對于凍干組的乳化穩定性產生了負作用。噴干組在加入Fe2+后先是下降后上升,特別是在Fe2+質量濃度增加到0.3 mg/L,其乳化穩定性相比于對照組較好地提升。綜合乳化活力與乳化穩定性,凍干工藝中膜濾水洗液Fe2+最佳質量濃度為0.1 mg/L,噴干工藝為0.3 mg/L。

總的來說,對于所得到的噴霧干燥的EAI高于冷凍干燥,而冷凍干燥的ESI高于噴霧干燥。這或許因為噴霧干燥工藝所導致的液滴收縮,使得水分擴散系數的降低以及表面張力的增大從而得到的蛋白質塌陷以及結構松散,更容易達到乳狀液的狀態,所得的乳化活力指數更高,而冷凍干燥工藝所產生的溶質聚集以及其板狀顆粒的結構,使得蛋白質結構緊密,所以冷凍干燥的乳化穩定性要高于噴干組[21]。

3 結論與討論

本研究采用鮮牛乳脫脂后,在膜濾工藝下加入梯度濃度Fe2+水洗液,利用凍干工藝以及噴干工藝制備出系列MCC粉末;利用UV、FS、FTIR以及CD測試手段表征其結構的變化,結果表明噴霧干燥及冷凍干燥工藝對MCC二級結構影響較顯著,Fe2+水洗液濃度越大二級結構變化越明顯,其中α-螺旋,β-折疊,無規卷曲與轉角都發生了不同程度的改變。Fe2+的加入同時也提高了酪蛋白膠束的吸油性、濁度以及熱穩定性;Fe2+的加入對MCC溶解性沒有顯著影響;Fe2+加入使得MCC的乳化性得到改善。噴干工藝中,隨著Fe2+濃度變大,其乳化活力指數也增大,凍干組中加入0.1 mg/L Fe2+時,其乳化活力指數升至最高。由于干燥工藝不同,凍干組的乳化穩定性要高于噴干組,但是加入0.3 mg/L Fe2+噴干組的MCC則高于凍干組。本研究中Fe2+水洗液濃度設計滿足食品工業用水要求,相關實驗結果可以為膜濾工藝下不同性能MCC制備提供參考依據。