西藏凹乳芹多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)表征及抗氧化活性研究

趙澤素,南木加,劉雙平,毛健,4,5*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)2(糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心(江南大學(xué)), 江蘇 無錫,214122)3(西藏藏醫(yī)藥大學(xué),基礎(chǔ)部,西藏 拉薩,850000)4(江南大學(xué)(紹興)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院, 浙江 紹興,312000)5(國家黃酒工程技術(shù)研究中心,浙江 紹興,312000)

西藏凹乳芹(Vicatiathibeticade Boiss),為傘形科凹乳芹屬植物凹乳芹的根,在我國主要分布于西藏、四川、云南等地區(qū)[1],其在西藏、云南地區(qū)常被作為滋補(bǔ)菜肴食用,也是藏藥基礎(chǔ)五大根藥的重要組成[2]。據(jù)記載,西藏凹乳芹具有祛風(fēng)除濕、散寒止痛的作用[3]。目前西藏凹乳芹中分離出多種生物活性成分,包括多糖、黃酮、香豆素、酚酸等[4]。目前對西藏凹乳芹的研究主要集中在藥理方面,對其化學(xué)成分和結(jié)構(gòu)特征的報(bào)道較少。

多糖是一種天然的大分子碳水化合物,廣泛存在于動物、植物和細(xì)菌中[5]。多糖已被證明具有抗病毒、抗癌、抗氧化、降血糖、抗炎、免疫和調(diào)節(jié)腸道微生物活性的作用,由于其生物降解性、無毒性質(zhì)、生物相容性和低加工成本等特點(diǎn),被應(yīng)用于許多領(lǐng)域[6]。西藏凹乳芹多糖(Vicatiathibeticade Boiss polysaccharide,VTP)是西藏凹乳芹的主要成分之一,因其具有抗疲勞[7]、抗氧化應(yīng)激[8]、免疫調(diào)節(jié)[9]等作用成為研究熱點(diǎn)。多糖的提取是其開發(fā)或應(yīng)用的最關(guān)鍵步驟,然而關(guān)于VTP提取和純化的進(jìn)一步研究尚未見報(bào)道。

西藏凹乳芹資源豐富,是食品和醫(yī)藥行業(yè)應(yīng)用的重要原料,目前主要被用于藏區(qū)人民食用和藏藥原料成分,且大部分只流通于西藏、云南等地區(qū),還未覆蓋全國,對其的開發(fā)還處于基礎(chǔ)階段,未來具有廣闊的市場前景。因此本研究以拉薩市西藏凹乳芹為原料,通過對VTP的提取、分離純化、結(jié)構(gòu)表征和體外抗氧化活性進(jìn)行研究,旨在為充分利用西藏凹乳芹打下基礎(chǔ),為VTP的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)材料:西藏凹乳芹,購于西藏昌都市藍(lán)寶石藥材有限公司拉薩分公司,經(jīng)西藏藏醫(yī)藥大學(xué)南木加老師鑒定為西藏凹乳芹的根。

實(shí)驗(yàn)試劑:木瓜蛋白酶、纖維素酶、苯酚、硫酸、無水乙醇、NaCl、NaOH,國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司;DEAE-cellulose 52、Sephadex G-100,北京索萊寶科技有限公司;系列葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品,美國聚合物標(biāo)準(zhǔn)品公司;單糖標(biāo)準(zhǔn)品,美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

R-1020旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,杭州庚雨儀器有限公司;MAX-190型酶標(biāo)儀,美國分子儀器公司;ME204號立式大容量多管離心機(jī)、Trace 1300 ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、DIONEX ICS-5000+SP-5型高壓離子色譜系統(tǒng),美國賽默飛世爾科技有限公司;Beta 1-8實(shí)驗(yàn)室型凍干機(jī),北京博勱行儀器有限公司;Waters 1525EF 型高效液相色譜儀,美國沃特世公司;NEXUS型傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)儀,美國尼高力儀器公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 西藏凹乳芹粗多糖(VTP-0)提取工藝優(yōu)化

1.3.1.1 單因素優(yōu)化

西藏凹乳芹經(jīng)50 ℃干燥后粉碎,過60目篩,備用。之后分別考察料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50, g∶mL)、復(fù)合酶(纖維素酶和木瓜蛋白酶,4∶6,質(zhì)量比)添加量(0%、1%、2%、3%、4%,質(zhì)量分?jǐn)?shù))、超聲溫度(35、45、55、65、75 ℃)、超聲時(shí)間(35、45、55、65、75 min)、超聲功率(250、300、350、400、450 W)對VTP-0得率的影響。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中,在一定條件下,使用超聲輔助酶法提取5 g西藏凹乳芹粉,超聲結(jié)束后,95 ℃下水浴滅酶10 min,冷卻,4 500 r/min 離心15 min,得到VTP-0提取液,采用苯酚-硫酸法[10]測定VTP-0含量。

1.3.1.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化VTP-0提取工藝

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,從5個(gè)單因素中選出4個(gè)比較重要的因素和因素的3個(gè)水平,以VTP-0得率為指標(biāo),采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),見表1,確定料液比(A)、超聲溫度(B)、超聲時(shí)間(C)、和超聲功率(D)的最佳組合,從而對VTP-0的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

表1 VTP-0提取的正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for VTP-0

1.3.2 VTP-0的分離純化

取上述VTP-0提取液上清液中加入無水乙醇至終體積分?jǐn)?shù)為80%,4 ℃放置24 h后,4 500 r/min離心15 min,收集沉淀,冷凍干燥即得VTP-0。

取100 mg VTP-0溶于10 mL超純水,0.45 μm的水系濾膜過濾,用裝好的離子交換柱進(jìn)行梯度洗脫,洗脫液為0、0.1、0.3、0.5 mol/L的NaCl溶液,洗脫速率為1 mL/min,洗脫時(shí)間為10 min/管。采用苯酚-硫酸法[10]測定每管洗脫液的總糖含量,根據(jù)洗脫管數(shù)和OD值繪制洗脫曲線。收集不同組分濃縮、透析、冷凍干燥。根據(jù)篩選結(jié)果使用超純水溶液進(jìn)行SephadexG-100柱洗脫,流速為0.5 mL/min,收集單一組分,濃縮冷凍干燥得VTP-1。

1.3.3 VTP-1相對分子質(zhì)量測定

參照DING等[11]的方法采用高效凝膠滲透色譜法測定。

1.3.4 VTP-1的單糖組成分析

參照GU等[12]的方法采用離子色譜法對VTP-1的單糖組成進(jìn)行測定。

1.3.5 VTP-1紫外光譜和FT-IR分析

利用紫外分光光度計(jì)在200～400 nm掃描,掃描間距為1 nm,檢測在260、280 nm處是否含有核酸和蛋白質(zhì)。

參照HE等[13]的方法,稱取VTP-1 5 mg置于FT-IR儀樣平臺上,固定樣品后,用FT-IR儀在4 000～500 cm-1掃描。

1.3.6 VTP-1的三螺旋結(jié)構(gòu)分析

參照XU等[14]的方法,將100 μL VTP-1樣品(2 mg/mL)與100 μL剛果紅溶液(80 μmol/L)與系列濃度梯度的NaOH溶液(0～0.5 mol/L)混合均勻,室溫靜置5 min,使用酶標(biāo)儀在200～700 nm測定其最大吸收波長的變化。

1.3.7 VTP-1的體外抗氧化活性測定

1.3.7.1 清除DPPH自由基能力測定

參考XIE等[15]的方法,并加以改動,將2 mL VTP-1溶液(1～10 mg/mL)與2 mL DPPH溶液,劇烈振搖混勻,在室溫下于黑暗處靜置30 min,測定混合物于517 nm處的吸光值,以無水乙醇作為空白對照。DPPH自由基清除能力計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

式中:A1,樣品溶液的吸光度;A2,無水乙醇代替DPPH-無水乙醇溶液的吸光度;A0,去離子水代替樣品溶液的吸光度。

1.3.7.2 ABTS陽離子自由基清除能力測定

參考ZHAO等[16]的方法,將14 mmol/L ABTS溶液與4.9 mmol/L K2S2O8溶液1∶1(體積比)混合,于室溫下黑暗中放置16 h,用去離子水將混合液的734 nm處吸光度值調(diào)至0.700±0.020。取20 μL VTP-1溶液(1～10 mg/mL)和180 μL ABTS稀釋液,劇烈振搖混勻,靜置10 min后于734 nm處測定吸光值,以維生素C為陽性對照,去離子水為空白對照。ABTS陽離子自由基清除能力計(jì)算如公式(2)所示:

(2)

式中:A1,樣品溶液的吸光度;A2,去離子水代替ABTS溶液的吸光度;A0,去離子水代替樣品溶液的吸光度。

1.3.7.3 ·OH清除能力測定

參考CHEN等[17]的方法,在試管中依次加入VTP-1溶液(1～14 mg/mL)、9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L水楊酸乙醇溶液、9 mmol/L H2O2溶液各1 mL混勻。將混合溶液于 37 ℃下溫育30 min,冷卻至室溫后測定510 nm處的吸光值,以維生素C為陽性對照,去離子水為空白對照,·OH清除能力計(jì)算如公式(3)所示:

(3)

式中:A1,樣品溶液的吸光度值;A2,去離子水替代H2O2溶液的吸光度值;A0,去離子水替代樣品的吸光度值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本研究各實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組平行,使用 Origin 2018進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。多重比較之間的差異采用單因素方差分析和 Fisher’s LSD 檢驗(yàn)進(jìn)行分析,P<0.05被認(rèn)為是顯著的。

2 結(jié)果與分析

2.1 VTP-0提取工藝優(yōu)化

2.1.1 VTP-0提取單因素優(yōu)化結(jié)果

采用超聲輔助酶解法提取VTP-0,在控制其他條件不變的條件下,分別對料液比、酶添加量、超聲溫度、超聲時(shí)間、超聲功率進(jìn)行了單因素試驗(yàn)。結(jié)果表明(圖1),VTP-0在料液比為1∶30,酶添加量2%,超聲時(shí)間55 min,超聲功率300 W,超聲溫度65 ℃條件下得率最高,為(40.33±0.40)%。

a-料液比;b-酶添加量;c-超聲溫度;d-超聲時(shí)間;e-超聲功率圖1 VTP-0提取單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Single factor experiment results of VTP-0 extraction

2.1.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化VTP-0的提取工藝

正交試驗(yàn)優(yōu)化VTP-0的提取工藝如表2所示,提取工藝優(yōu)化過程中,以L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),并對結(jié)果進(jìn)行直觀分析。R值與該因素對提取率影響呈正相關(guān)。提取率受各因素的影響程度由大到小依次為:A>D>C>B。最佳工藝組合為A2B1C2D3,即料液比1∶30(g∶mL),提取溫度55 ℃,提取時(shí)間55 min,超聲功率350 W,在該提取條件下VTP-0得率為(41.37±1.40)%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.38%,表明精密度良好。對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析,結(jié)果如表3所示,其中料液比對VTP-0得率的影響極顯著,其余3個(gè)因素均對VTP-0得率影響不顯著。

2.2 VTP-0分離純化

經(jīng)提取、醇沉、冷凍干燥后得到的VTP-0,提取得率為(28.51±0.94)%。VTP-0經(jīng)DEAE-cellulose 52離子交換柱分離,分別在水洗脫和梯度鹽洗脫部分得到4個(gè)峰,如圖2所示,命名為VTP-1、VTP-2、VTP-3、VTP-4。各組分所得多糖比率分別為(79.80±1.68)%、(10.82±0.53)%、(5.85±0.66)%、(3.53±0.26)%。考慮到收集時(shí)間與脫鹽成本,本實(shí)驗(yàn)選擇VTP-1進(jìn)行后續(xù)分離純化。經(jīng)SephadexG-100凝膠柱純化后,得到單一對稱的單峰組分,證明VTP-1為較均一多糖,收集組分液,透析、干燥,其含量為(86.91±1.83)%。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及直觀分析Table 2 Orthogonal experiment results and range analysis of extraction of total flavonoids

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment results

2.3 VTP-1相對分子質(zhì)量測定及單糖組成

重均分子質(zhì)量(weight-average molecular weight,Mw)和數(shù)均分子質(zhì)量(number-average molecular weight,Mn)是用于評價(jià)多糖理化性質(zhì)的關(guān)鍵參數(shù)[18]。因此,使用高效凝膠滲透色譜測定VTP-1的分子質(zhì)量,結(jié)果如表4所示。

a-DEAE-52洗脫曲線;b-SephadexG-100洗脫曲線圖2 DEAE-52纖維素柱色譜法洗脫曲線和 SephadexG-100洗脫曲線Fig.2 Elution curve of polysaccharides by DEAE-52 cellulose column chromatography elution curve and Sephadex G-100

VTP-1的Mw和Mn分別為96.81 kDa和56.28 kDa。多分散系數(shù)(Mw/Mn)為1.72,表明VTP-1是一種相對均質(zhì)的多糖。

本研究采用高效液相色譜法分析VTP-1的單糖組成。如表4所示,VTP-1由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖等組成,摩爾比為5.63∶2.79∶86.36∶3.02∶1.59。由于VTP-1未有報(bào)道,與西藏凹乳芹同屬的傘形科當(dāng)歸的研究表明[19],當(dāng)歸多糖由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和木糖組成,摩爾比為8.4∶2.7∶1.8∶1.0,與本文分離純化得到的單糖種類及占比類似,葡萄糖占比最高。

表4 VTP-1的分子質(zhì)量及單糖組成Table 4 Molecular weight and monosaccharide composition of VTP-1

2.4 紫外光譜和FT-IR分析

紫外可見光譜結(jié)果如圖3-a所示,VTP-1在紫外掃描范圍內(nèi)均無吸收峰,表明VTP-1中不含有蛋白質(zhì)和核酸。

a-紫外光譜;b-FT-IR圖3 VTP-1的紫外-可見光光譜和FT-IR分析Fig.3 Ultraviolet and visible spectra and FT-IR of VTP-1

2.5 VTP-1三維螺旋結(jié)構(gòu)分析

具有三螺旋結(jié)構(gòu)的多糖與剛果紅溶液結(jié)合時(shí),會導(dǎo)致多糖與剛果紅復(fù)合物的最大吸收波長發(fā)生紅移[23]。因此,采用剛果紅測定法測定VTP-1的三螺旋結(jié)構(gòu)。如圖4所示,VTP-1的最大吸收波長隨NaOH濃度的增加而減小,表明VTP-1不具備三螺旋結(jié)構(gòu)。

圖4 VTP-1剛果紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Results of Congo red with VTP-1

2.6 VTP-1的體外抗氧化活性

如圖5所示,VTP-1的抗氧化能力對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、·OH的清除能力呈劑量依賴性,但仍不及陽性對照(維生素C)的抗氧化能力。在10 mg/mL時(shí),VTP-1對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除率分別可達(dá)到(92.45±0.62)%、(84.87±0.59)%;在14 mg/mL時(shí),VTP-1對·OH清除率達(dá)到(93.82±2.34)%。VTP-1對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、·OH清除率的IC50值分別為1.808、1.845、4.634 mg/mL。綜上所述,VTP-1的抗氧化活性按DPPH自由基>ABTS陽離子自由基>·OH的順序排列。

研究表明,多糖的抗氧化活性與其結(jié)構(gòu)特性(分子質(zhì)量、單糖組成、糖苷鍵類型和鏈構(gòu)象等)有很大關(guān)系[24]。VTP-1的抗氧化活性受多種因素影響,而非單一因素的影響。本文提取得到的VTP-1分子質(zhì)量較高(Mw=96.81 kDa),表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗氧化性。研究表明,低分子質(zhì)量的灰喇叭菌酸性多糖具有較低的抗氧化性[25],而分子質(zhì)量較高的羅漢果多糖不具有更強(qiáng)的抗氧化性[26]。因此,基于上述研究之間發(fā)現(xiàn)的不一致,表明多糖分子質(zhì)量不是影響其抗氧化活性的主要因素。單糖中的鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖等的存在可能與抗氧化活性有關(guān)[27-28]。因此,VTP-1其單糖組成種類豐富可能是決定其有良好抗氧化性的原因。此外,多糖中的α-和β-型糖苷鍵也會影響多糖的抗氧化活性[29-30]。VTP-1同時(shí)含有α-和β-型糖苷鍵,這可能也是其抗氧化性良好的原因。總之,由于多糖的抗氧化機(jī)制復(fù)雜,因此多糖的抗氧化能力與結(jié)構(gòu)特征之間的特異性相關(guān)性有待進(jìn)一步研究。

a-DPPH自由基清除率;b-ABTS陽離子自由基清除率;c-·OH清除率圖5 VTP-1的體外抗氧化活性Fig.5 Antioxidant activities of VTP-1 in vitro

3 結(jié)論

采用超聲輔助酶法提取得到VTP-0,最佳提取工藝為料液比1∶30(g∶mL),提取溫度55 ℃,提取時(shí)間55 min,超聲功率 350 W,VTP-0得率為(41.37±1.40)%。后續(xù)經(jīng)DEAE-cellulose 52和Sephadex G-100柱分離純化得到VTP-1。 結(jié)果表明,VTP-1的分子質(zhì)量為96.81 kDa。VTP-1是由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖組成,摩爾比為5.63∶2.79∶86.36∶3.02∶1.59;VTP-1為單一多糖,不含核酸和蛋白質(zhì)。VTP-1具有多糖的特征吸收基團(tuán),同時(shí)含有α-和β-型糖苷鍵,且無三螺旋結(jié)構(gòu)。VTP-1對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、·OH清除率的IC50值分別為1.808、1.845、4.634 mg/mL,具有良好的體外抗氧化活性,證明了VTP的潛在藥用價(jià)值。本文對VTP的組分進(jìn)行了初步研究,為進(jìn)一步探討VTP抗氧化活性與結(jié)構(gòu)的關(guān)系提供了一定的數(shù)據(jù)支持,但后續(xù)還需進(jìn)一步探究VTP-1的結(jié)構(gòu)與體內(nèi)功能活性的關(guān)系。