貽貝蒸煮液美拉德反應制備海鮮調味基料工藝研究及其揮發性風味分析

柯志剛,吳濤,陳慧,周緒霞,金友定,戴央章, 鄧尚貴,周小敏,丁玉庭,劉書來,8,相興偉*

1(浙江工業大學 食品科學與工程學院,浙江 杭州,310014)2(浙江省深藍漁業資源高效開發利用重點實驗室, 浙江 杭州,310014)3(國家遠洋水產品加工技術研發分中心(杭州),浙江 杭州,310014)4(海洋食品精深加工 關鍵技術省部共建協同創新中心,大連工業大學,遼寧 大連,116034)5(嵊泗縣景晟貽貝產業發展有限公司, 浙江 嵊泗,316000)6(浙江海洋大學 食品與藥學學院,浙江 舟山,316000)7(浙江興業集團有限公司, 浙江 舟山,316000)8(寧?？h浙工大科學技術研究院,浙江 寧波,315600)

貽貝是一種以營足絲附著生活的雙殼類軟體動物,生長力強,產量高,在我國山東、浙江、福建等沿海省份均有大量養殖。貽貝肉富含氨基酸和維生素,其中?；撬岬暮空伎偘被岬?%(質量分數),其對兒童生長發育有重要促進作用;貽貝中的多不飽和脂肪酸含量也很高,特別是二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)和二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)含量占總脂肪酸的31.65%(質量分數)[1],有益于防患老年人動脈粥樣硬化。貽貝收獲季節集中,采捕期短,產量大,采捕后若不及時處理,貽貝肉極易發生腐敗變質。國內通常是將貽貝制成干制品、冷凍品以延長其儲藏期。但在貽貝加工過程中會產生大量的蒸煮廢液,每生產1 t貽貝產品,就會產生1.5 t蒸煮液[2]。將貽貝蒸煮液直接排放不僅會帶來極大的環境壓力,也造成了其中水溶性營養成分和蛋白質的浪費。研究發現,貽貝蒸煮液中富含蛋白質、氨基酸等物質,是一種極好的制作海鮮風味調料的原料。王欣等[3]將貽貝蒸煮液添加入醬油后制備了一種具有貽貝風味且營養價值高的醬油,為貽貝蒸煮液的綜合利用提供了新的途徑。也有學者通過對貽貝蒸煮液進行酶解,開發了海鮮調味醬。

美拉德反應是一種非酶促褐變反應,它是指在加熱條件下,還原糖的羰基與氨基酸、肽或蛋白質的氨基發生反應,生成包括酮類、醛類、醇類、呋喃類等多種化合物的反應[4]。這些物質賦予美拉德反應產物獨有的特征芳香風味。本實驗以貽貝蒸煮過程中產生的蒸煮液濃縮后獲得的濃縮液為基料,加入胰酶酶解制得酶解液,再向其中添加一定量的還原糖進行美拉德反應,以期獲得貽貝風味調味料基料。綜合應用單因素試驗、Friedman排序檢驗、響應曲面結合模糊數學感官評價等方法,考察美拉德反應中還原糖添加量、反應時間、反應溫度、反應初始pH等對美拉德反應產物風味的影響,優化得到了最佳反應條件,通過GC-MS對所得的反應產物的主要風味物質進行了分析。本研究結果為貽貝加工副產物的高值化利用提供了一定的借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本試驗所用貽貝購自湖州市德清縣長橋農貿市場。

試劑:胰酶,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;NaOH、HCl等試劑均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司;木糖、葡萄糖均為食品級,山東齊魯生物科技公司。

1.2 儀器

數顯恒溫水浴鍋,上海邦西儀器科技有限公司;TU-1900分光光度計,北京普析通用儀器有限責任公司;高速冷凍離心機,日本日立公司;Trace 1300-ISQ QD氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS),賽默飛世爾科技有限公司

1.3 酶解液的制備

將清理后的新鮮貽貝按料液比5∶1(g∶mL)加入純水,沸水浴中加熱15 min。待蒸煮液冷卻至室溫后,用紗布過濾2次。利用凍結-解凍方法對蒸煮液進行濃縮處理,以提高蒸煮液中蛋白質的濃度。將所得蒸煮液在-20 ℃下凍藏24 h,再進行常溫水浴解凍。解凍完成后,9 400×g離心10 min,蒸煮液分離為上層的澄清液及下層的蛋白質沉淀物。澄清液通過超濾處理濃縮10倍后,與蛋白質沉淀物按2∶1(mL∶g)比例混勻,調節其中蛋白質含量至50 mg/mL。添加胰蛋白酶(酶活力200 U/mg)至2 000 U/g,50 ℃下酶解4 h。酶解完成后將酶解液置于100 ℃水浴鍋處理10 min。滅活后的酶解液經9 400×g離心10 min,取上清液在4 ℃下保存備用。

1.4 美拉德反應產物的制備

吸取10 mL酶解液于試管中,按比例加入一定量(質量分數為1%、2%、3%、4%、5%)的木糖與葡萄糖(其比例為1∶1),調節初始pH(6.5、7、7.5、8、8.5、9)后密封,放置于油浴鍋中(90、100、110、120 ℃)進行反應,反應(30、60、90、120、150 min)后立即進行冰浴,降至室溫后4 ℃保存待測。

褐變程度測定參考侯鈺柯等[5]方法并作適當修改,將美拉德反應產物稀釋10倍,以水為參比,測定其在420 nm處的吸光度。

低分子香味中間體測定參考韓科研等[6]方法并做適當修改,將美拉德反應產物稀釋100倍,以水為參比,測定其在280 nm處的吸光度。

1.5 Friedman排序檢驗

將美拉德反應液置于室溫下平衡30 min,以避免溫度對評估帶來的影響。10名經過訓練的感官評價員根據樣品整體風味的可接受程度對樣品進行排序打分,分值設置為1～5分,其中5分為最優,1分為最差,采用Kramer 檢定法對樣品的差異顯著性進行分析。

1.6 美拉德反應條件響應面優化試驗

根據褐變程度、低分子香味中間體及Friedman排序檢驗結果,對還原糖添加量、反應時間、反應溫度、pH值4個因素進行優化,將-1、0、1編碼為每個自變量的低、中、高試驗水平,以模糊感官評價為響應值。利用統計軟件Design Expert 8.0.6進行回歸性分析,獲得二次多元回歸模型后對模型進行方差分析,用模型對美拉德反應液的感官評價進行分析和預測,得出最佳反應條件。響應面設計中各因素及其水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Response surface test factors and levels

1.7 模糊感官評價

1.7.1 建立因素集和評語集

因素集是指感官評定組成因素的集合,本試驗因素集U={u1,u2,u3,u4}={色澤,海鮮味,焦香味,腥臭味};評語集指被評價的對象所處質量級別的集合,本試驗以極優、優、良、差、極差為評語等級,評語集V={V1,V2,V3,V4,V5}={極優,優,良,差,極差},其中V1=5分,V2=4分,V3=3分,V4=2分,V5=1分。

1.7.2 建立感官評價因素集權重

通過0～4判別法確定美拉德反應產物評價過程中色澤、海鮮味、焦香味、腥臭味4個因素所占權重。對每個因素兩兩進行重要性比較,根據相對重要性打分:很重要-很不重要4～0分;較重要-不很重要3～1分;同樣重要2～2分。根據評價員對各個因素所打分進行統計,得到各因素得分及權重因子。最后得到因素集的權重向量α=(α1、α2、α3、α4)=(0.167、0.354、0.278、0.201),其中α1+α2+α3+α4=1。

1.7.3 模糊矩陣及模糊變換

統計各因素中每個等級票數分布,采用模糊數學的方法處理評定結果,各個樣品的感官結果為權重集α與所得的模糊矩陣A合成,即結果Y=αA。最后比較各樣品的結果,得分高者即為風味質量模糊感官最佳。

1.8 揮發性成分的檢測

取5 mL美拉德反應液置于20 mL頂空瓶中,加質量濃度為10-3μg/mL的1,2-二氯苯溶液30 μL,擰緊瓶蓋,置于60 ℃恒溫水浴鍋中平衡10 min,后插入75 μm的PDMS SPME萃取頭恒溫萃取40 min,用GC-MS進行分析測定。

色譜柱采用DB-5MS毛細管柱(60 m×0.32 mm,1 μm),進樣采用不分流模式。升溫程序:起始溫度40 ℃,以5 ℃/min的速率升溫至100 ℃,再以2 ℃/min的速率升溫至180 ℃,最后以5 ℃/min的速率升溫至240 ℃,保持5 min。質譜條件:EI模式,離子源溫度220 ℃,檢測器溫度250 ℃,傳輸線溫度270 ℃,質量掃描范圍35～500 amu,掃描速率3.0 scans/s,掃描時間間隔0.2 s。

1.9 數據處理

數據采用平均值±標準差表示(n=3),采用SPSS 26軟件對相關數據進行方差分析,P<0.05具有差異顯著性;采用Origin 2021繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 還原糖添加量的確定

還原糖添加量是影響美拉德反應速率的重要因素,同時對美拉德反應產物的風味和色澤也有重要影響[7]。通常以280 nm處的吸光度(A280)表征美拉德反應生成的低分子香味中間體含量,以420 nm處的吸光度(A420)表征美拉德反應終期產物含量[8]。本試驗所添加的還原糖由木糖和葡萄糖復配組成,根據前期試驗得知其比例1∶1時,反應液風味較佳。由圖1可知,在1%～5%范圍內,隨著還原糖添加量的增加,美拉德反應低分子香味中間體含量顯著增加(P<0.05),褐變程度顯著增大(P<0.05)。若添加量從2%增加至3%,反應產物中低分子香味中間體和終產物的含量均顯著增高(P<0.05)。若進一步增加還原糖含量至4%或5%,二者變化不再顯著。

根據Friedman排序檢驗法對不同還原糖添加量的美拉德反應產物品質進行評價,秩次從小到大表示品質的從劣到優,樣品進行顯著性差異分析,查表2 Krammer順位檢定表評價員J=10,P=5(樣品數)的臨界值,上段用于確定樣品間是否存在顯著性差異,下段用于對樣品的顯著性差異進行分組。在P=0.05的顯著性水平上,由R5%=18

圖1 還原糖添加量對貽貝蒸煮液美拉德反應產物 褐變程度和中間產物生成量的影響Fig.1 Effects of the amounts of the added reducing sugar on the browning degree and the amounts of intermediate product in the Maillard reaction products of mussel cooking liquor注:不同字母表示不同組之間具有顯著性差異(P<0.05)(下同)。

表2 Krammer順位檢定表(5%顯著水平)Table 2 Krammer ranking test table (5% significant level)

表3 不同還原糖添加量下貽貝蒸煮液美拉德 反應產物的秩和Table 3 Rank sum of the Maillard reaction products of mussel cooking liquid with different amounts of reducing sugar

2.2 反應時間的確定

反應時間對美拉德反應生成的低分子香味中間體和終期產物的含量的影響如圖2所示。由圖可知,在前2 h內,隨著反應時間的延長,反應液A420急劇增加(P<0.05),溶液顏色逐漸加深,表明類黑精等終產物含量隨反應時間的增加而逐漸增加[9-10];進一步延長反應時間后,A420增加速率開始降低,反應速率開始下降。這與XIAO等[10]的研究結果一致。另一方面,隨著反應時間的增加,美拉德反應產物中低分子香味中間體呈先上升后下降的趨勢(P<0.05),在2 h低分子香味中間體生成量最高。

圖2 反應時間對貽貝蒸煮液美拉德反應產物 褐變程度和中間產物生成量的影響Fig.2 Effects of the reaction times on the browning degree and the amounts of intermediate product in the Maillard reaction products of mussel cooking liquor

在P=0.05的顯著性水平上,由R0.5 h=17

表4 不同反應時間下貽貝蒸煮液美拉德反應產物的秩和Table 4 Rank sums of Maillard reaction products of mussel cooking liquor at different reaction times

2.3 反應溫度的確定

反應溫度對美拉德反應的影響極為明顯,溫度較低時,反應進行速率慢,生成的有益風味物質較少;而當溫度較高時,反應速率會急劇增加,生成的風味物質能顯著改善產品風味,但反應終產物類黑精的快速積累會產生焦苦味,破壞產品風味[11]。由圖3可知,低分子香味中間體的生成量隨反應溫度的升高呈現先增加后降低的趨勢(P<0.05)。在110 ℃時低分子香味中間體含量最高,當溫度為120 ℃時低分子香味中間體生成量降低,可能是糖類物質在溫度較高時破壞程度加劇,以及蛋白質、肽發生熱降解所致[12]。褐變程度(A420)則隨著溫度的增加而增加,表明隨著溫度升高,美拉德反應在末期產生的類黑精等物質生成量顯著增加(P<0.05)。

圖3 反應溫度對貽貝蒸煮液美拉德反應產物 褐變程度和中間產物生成量的影響Fig.3 Effects of reaction temperatures on the degree of browning and the production of intermediates in the Maillard reaction products of mussel cooking liquor

在P=0.05的顯著性水平上,R90 ℃=14

表5 不同反應溫度下貽貝蒸煮液美拉德反應產物的秩和Table 5 Rank sums of the Maillard reaction products of mussel cooking liquid at different reaction temperatures

續表5

2.4 反應pH的確定

pH是影響美拉德反應的重要因素之一。美拉德反應速率隨著pH的升高會加速Amadori重排產物及其下游褐變前體物質的形成與積累,有利于形成呋喃酮或還原酮,促進類黑精的生成[13]。而若pH值過高,會產生較多的NH3,從而對風味產生不利影響。由圖4可知,在pH 6.5～9.0,隨著反應初始pH增加,A420逐漸增大,這表明褐變程度增加,類黑精等美拉德反應終期產物含量增加;在pH 6.5～7.5,隨著pH增加,A280不斷增加。在pH 7.5～9,隨著pH增加,A280不斷減小。在pH 7.5時,A280最大。上述結果表明隨著pH的增加,美拉德反應速率顯著加快,但是會褐變嚴重且生成不具有香味的大分子物質,對反應產物的風味有不利影響。在pH 7.5時低分子香味中間體生成量最高,風味最佳。

圖4 反應初始pH對貽貝蒸煮液美拉德反應產物 褐變程度和中間產物生成量的影響Fig.4 Effects of initial pH on the browning degree and the production of intermediates in the Maillard reaction products of mussel cooking liquor

在P=0.05的顯著性水平上,由R8.5=13

表6 不同反應初始pH下貽貝蒸煮液美拉德反應產物的秩和Table 6 Rank sum of Maillard reaction products of mussel cooking liquor at different initial pH

2.5 響應面結果優化

2.5.1 回歸模型的建立和方差分析

根據響應曲面試驗設計得到29組試驗方案,將各個等級的票數分布進行整理,利用模糊矩陣變換原理計算得各組的感官評價得分。基于單因素試驗的結果,通過響應面試驗優化了還原糖添加量(A)、反應時間(B)、反應溫度(C)、反應pH(D)對美拉德反應產物感官評價的影響。響應面二次模型的ANOVA結果如表7所示。采用多元回歸分析對數據進行分析,擬合模型方程如下:Y=88.37+0.39A+3.53B-5.24C-1.80D-3.71AB-3.52AC-5.74AD-4.33BC+3.02BD-4.26CD-14.29A2-12.11B2-23.66C2-16.66D2。

表7 響應面試驗設計與結果Table 7 Response surface test design and results

續表7

美拉德反應液的感官評價的回歸方程方差分析見表8。響應面擬合模型極顯著(P<0.01和R2=0.955 7),表明該模型可靠性高,與數據擬合良好[14]。失擬項P=0.493 3>0.05,失擬項不顯著,表明該模型可以反映制備條件對美拉德反應產物感官風味的影響,未知因素對試驗結果的影響較小,殘差主要來源于隨機誤差。反應溫度(C)、A2、B2、C2、D2具有極顯著的影響(P<0.01),反應時間(B)、AD也有顯著性差異(P<0.05)。各因素的影響程度可分為:C>B>D>A。

表8 感官評價結果方差分析Table 8 Analysis of variance of sensory evaluation results

2.5.2 最佳工藝的驗證

結合響應面優化試驗分析,以感官評價得分作為評價指標,得到的美拉德反應最佳工藝為還原糖添加量3.01%,反應時間2.08 h,反應溫度114.38 ℃,初始pH 7.49。在此條件下感官評價得分的預測值為89.01。為驗證最佳工藝,向貽貝蒸煮液加入3%還原糖,調節pH值至7.5,在115 ℃下反應2 h,得到美拉德反應產物,并對其進行感官評價,結果見表9。經過模糊矩陣變換計算后得到感官評分86.62,與預測值較為接近,擬合較好,模型可靠。

表9 貽貝蒸煮液最佳美拉德工藝感官評價票數Table 9 Votes for sensory evaluation of the best Maillard process for mussel cooking liquid

2.6 美拉德反應前后揮發性物質變化分析

對貽貝蒸煮液及其美拉德反應產物分別進行了GC-MS分析,結果如圖5及表10所示。未進行美拉德反應的貽貝蒸煮液中共檢出26種揮發性物質,而在其美拉德反應液中共檢出39種揮發性物質。美拉德反應前后揮發性物質數量、種類及含量均有較大差異。醛類物質在反應產物的風味中起主要作用,呋喃、吡嗪類物質則使其風味得到進一步提升。

圖5 貽貝蒸煮液美拉德反應前后揮發性 物質種類及個數變化Fig.5 Changes in the types and numbers of volatile substances before and after the Maillard reaction

醛類物質具有較低的閾值,一般呈水果、青草等氣味特征,在促成食品形成特征風味方面起重要作用[15]。貽貝蒸煮液中OAV>1的醛類物質包括異戊醛、庚醛、3-甲硫基丙醛、正辛醛、壬醛、反,順-2,6-壬二烯醛。異戊醛具有麥芽味、蘋果味,在Strecker降解中有較高的產率,是美拉德反應產物中重要的香氣化合物[16]。3-甲硫基丙醛是魚露中主要的風味化合物,具有馬鈴薯、麥芽香、果香等宜人氣味[17-18]。壬醛具有脂肪香味,是美拉德反應產物中形成肉味的主要來源。庚醛[19]具有強烈的魚腥味,是貽貝蒸煮液中不良風味的主要貢獻者。這些醛類物質共同組成了貽貝蒸煮液特有的清香味和魚腥味。而貽貝蒸煮液的美拉德反應物中OAV>1的醛類物質包括異戊醛、2-甲基丁醛、3-甲硫基丙醛、苯乙醛和壬醛。2-甲基丁醛作為常用香料,在低濃度時具有令人愉悅的果味,帶有可可香和巧克力味,已廣泛應用于食品工業中。苯乙醛有很強的滲透力,具有甜風信子、丁香氣味。美拉德反應前后庚醛、正辛醛、反,順-2,6-壬二烯醛含量顯著下降,異戊醛、2-甲基丁醛、苯乙醛含量顯著增高。這些醛類物質種類及含量的變化表明貽貝蒸煮液在經過美拉德反應后腥味得到顯著改善,并且花香、果香等更加突出,使得產物的整體風味更加柔和。

表10 揮發性成分分析Table 10 Analysis of volatile components

醛類、酮類物質的相互作用可以為美拉德反應產物形成獨特風味發揮重要作用[11]。酮類物質的氣味閾值高于醛類物質,通常具有堅果、水果香。本研究中,美拉德反應后4-甲基-3-戊烯-2-酮(OAV>1)含量顯著降低;異佛爾酮(OAV>1)含量略有增加,其具有薄荷香氣,可作為食品香料。醇類物質閾值較高,對風味的貢獻較小,1-辛烯-3醇[20]是貽貝蒸煮液中草腥味和清香味的主要來源,在貽貝蒸煮液美拉德反應產物中未檢出,表明在反應產物中無風味貢獻。

呋喃、吡嗪類化合物是由還原糖經脫水、分解及環化等一系列步驟形成。經過美拉德反應后的貽貝蒸煮液中共檢出3種呋喃類物質和2種吡嗪類物質。其中2-正戊基呋喃OAV>1,其通常被認為是亞油酸酯氫過氧化物和亞麻酸氫過氧化物熱降解形成[21],在美拉德反應產物中是焦糖風味的主要貢獻者。

揮發性硫化物是硫醇、硫醚、噻吩、噻唑等的總稱,由于揮發性硫化物香氣閾值相對較低,即使在非常低的濃度下也能對食品的整體風味做出貢獻[22]。本研究中二甲基硫醚OAV>1,其生成途徑與硫胺素的降解有關,能夠提供卷心菜味[23]。

3 結論

本研究以貽貝蒸煮液經酶解后的溶液為原料,通過美拉德反應制備海鮮基調味基料。以美拉德反應終產物和中間體含量、感官評價等為指標,通過單因素和響應面優化試驗得到美拉德反應的最優條件為還原糖添加量3%、pH 7.5、反應時間2 h、溫度115 ℃。所采用的模糊數學方法能夠有效避免單純感官評價的少數評價員錯誤信息,使得評價結果更加可靠。所制備的美拉德反應液風味濃郁,經GC-MS分析,產物中以醛、酮類物質為主,呋喃、吡嗪類等雜環化合物進一步加強了特征風味,整體風味和諧、豐滿。本研究結果可為貽貝加工副產物高值化利用提供一定的借鑒和參考。