免疫層析技術(shù)在食物過敏原快速檢測中的應(yīng)用進(jìn)展

郭開通,胡驍飛,孫亞寧,邢云瑞,王成賓,吳佳蓓,王琳,宋乾召,楊海濤,王耀

1(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,河南 洛陽,471003)2(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南 鄭州,450002)3(河南宜測科技有限公司,河南 鄭州,451162)

食物過敏是一種對(duì)機(jī)體不利的免疫反應(yīng),在接觸特定的食物或相關(guān)成分后可重復(fù)發(fā)生,輕則可引起消化系統(tǒng)疾病和皮膚刺激,重則會(huì)導(dǎo)致休克甚至死亡[1]。食物過敏已成為全球性的健康問題,被世界衛(wèi)生組織認(rèn)為是最重要的公共衛(wèi)生問題之一[2]。在發(fā)達(dá)國家中,約有10%的人會(huì)產(chǎn)生食物過敏,其中以兒童為主[3]。此外,在過去的10～20年里,食物過敏發(fā)病率有所上升[4-5]。目前,還沒有有效的方法可以徹底解決食物過敏問題,對(duì)于過敏人群來說,最好的防護(hù)措施是避免接觸過敏原[6]。因此,一些國家通過食品標(biāo)簽向消費(fèi)者提供產(chǎn)品有關(guān)致敏成分的信息,以達(dá)到保護(hù)過敏人群的目的。但這種方法有局限性,在原材料或最終產(chǎn)品的加工或儲(chǔ)存過程中,由于交叉干擾無意或有意添加而存在的過敏原使食品標(biāo)簽可信度降低,甚至?xí)?dǎo)致更多食物過敏的發(fā)生[7]。

食物過敏原常用檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫層析(immunochromatographic assay,ICA)、實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和質(zhì)譜儀檢測等,其中,免疫層析具有便于操作、耗時(shí)短、檢測成本低等優(yōu)點(diǎn)[8],非常適用于大規(guī)模樣品現(xiàn)場快速篩查。在實(shí)際應(yīng)用中,可通過使用不同標(biāo)記物標(biāo)記抗體提高免疫層析的檢測性能,根據(jù)標(biāo)記物材料可以分為:有色納米顆粒、磁性納米顆粒、熒光納米顆粒[9]。本文對(duì)主要食物過敏原及免疫層析檢測原理進(jìn)行了簡要介紹,并對(duì)免疫層析在主要食物過敏原檢測中的應(yīng)用進(jìn)行歸納總結(jié)。

1 常見食物過敏原

根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織的統(tǒng)計(jì),超過90%的食物過敏主要與8種食物有關(guān),按來源可以分為植物源性食物(包括花生、大豆、小麥、樹生堅(jiān)果類)和動(dòng)物源性食物(牛奶、雞蛋、甲殼類和魚類)[10]。植物源性和動(dòng)物源性食物中存在的過敏原主要是少數(shù)具有特殊結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)[11]。植物源性食物過敏原主要屬于Cupin超家族和醇溶蛋白超家族[12]。而動(dòng)物源性食物過敏原的多樣性低于植物源性食物過敏原,它們可分為三大家族:鈣結(jié)合蛋白(小白蛋白)、原肌球蛋白(甲殼類動(dòng)物和軟體動(dòng)物)和酪蛋白[13]。常見食物主要過敏原如表1所示。

2 免疫層析檢測原理

免疫層析是以免疫技術(shù)、色譜層析技術(shù)、新材料及標(biāo)記技術(shù)為基礎(chǔ)建立的一種免疫學(xué)快速檢測技術(shù)。如圖1所示,免疫層析試紙主要包含樣品墊、結(jié)合墊、吸收墊、硝酸纖維素(nitrocellulose,NC)膜、檢測線和質(zhì)控線等,其原理是以待測物溶液為流動(dòng)相,在毛細(xì)作用下,待測物溶液經(jīng)樣品墊向吸收墊方向移動(dòng),先溶解結(jié)合墊上的檢測抗體后與其相互反應(yīng),再與檢測線和質(zhì)控線上固定有的抗原或抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng),最后,通過檢測線和質(zhì)控線顏色判斷測試結(jié)果[24]。根據(jù)抗原抗體結(jié)合方式的差異,主要可以分為2種檢測模式:夾心法(如圖1-a)和競爭法(如圖1-b)。夾心法一般用于大分子物質(zhì)的檢測,在食品過敏原檢測中較為常用,而競爭法常用于小分子物質(zhì)的檢測。

表1 常見食物主要過敏原及致敏癥狀Table 1 Common food allergens and sensitization symptoms

a-夾心法;b-競爭法圖1 免疫層析技術(shù)檢測模式示意圖Fig.1 Schematic diagram of immunochromatographic assay detection mode

3 免疫層析在食物過敏原檢測中的應(yīng)用

3.1 基于有色納米顆粒的免疫層析

有色納米顆粒包括:膠體金、納米銀、乳膠顆粒等,具有良好的光學(xué)特性,僅靠肉眼就可以判斷結(jié)果等優(yōu)點(diǎn),在食品過敏原檢測過程中應(yīng)用較為廣泛[25]。而膠體金因其生物相容性好且制作簡單,在ICA制備中有較多應(yīng)用[26]。為快速檢測花生過敏原,吉坤美等[27]通過提取總花生過敏原,免疫小鼠制備出高效價(jià)多克隆抗體,并利用膠體金作為抗體標(biāo)記物,開發(fā)了一種檢測花生過敏原的膠體金免疫層析試紙條,目測檢出限為50 ng/mL。然而,多克隆抗體的交叉反應(yīng),可能會(huì)導(dǎo)致免疫層析法出現(xiàn)假陽性結(jié)果,為此,WU等[28]將膠體金與檢測抗體進(jìn)行偶聯(lián),制備出膠體金檢測探針,開發(fā)了一種基于雙位點(diǎn)單克隆抗體的膠體金免疫層析法,可用于β-LG的檢測,所制備的單克隆抗體可在一個(gè)小區(qū)域(β-LG的Glu-Asn)識(shí)別出2個(gè)相鄰的、單獨(dú)的表位,沒有交叉反應(yīng)。該方法具有高特異性,可實(shí)現(xiàn)對(duì)β-LG的快速檢測,目測檢出限為0.2 ng/mL。WANG等[29-30]分別針對(duì)大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白研制了夾心法膠體金免疫層析快速檢測試紙條,均基于高度特異性的鼠源單克隆抗體作為捕獲抗體,將兔源多克隆抗體作為檢測抗體并與膠體金進(jìn)行偶聯(lián),建立了2種主要大豆過敏原的免疫層析試紙條,借助光密度儀掃描試紙條檢測線能夠?qū)崿F(xiàn)定量檢測,可用于奶粉中2種大豆過敏原的檢測,目測檢出限分別為0.69和1.66 mg/kg。在免疫層析中競爭法也可用于大分子過敏原檢測,王士峰等[31]通過制備β-LG單克隆抗體,利用競爭法檢測線上包備β-LG標(biāo)準(zhǔn)品,將膠體金與檢測抗體偶聯(lián),建立了一種競爭法膠體金免疫層析法,該方法與夾心法相比,節(jié)約了抗體的使用量,目測檢出限達(dá)50 μg/mL。MASIRI等[32]制備了一組針對(duì)杏仁、腰果、椰子、榛子和豆奶中存在的修飾蛋白的多克隆抗體,并同時(shí)利用夾心法和競爭法,研制了一種膠體金免疫層析試紙條,可以實(shí)現(xiàn)多靶標(biāo)檢測。試紙條上設(shè)置有2條檢測線,檢測線T1運(yùn)用夾心法模式,線上固定有特異性抗體,檢測線T2運(yùn)用競爭法模式,線上包被有待測物標(biāo)準(zhǔn)品。當(dāng)與試紙條讀卡儀配合使用時(shí),可以在25 min內(nèi)獲得檢測結(jié)果,目測檢出限為1.0 μg/mL。膠體金不僅可以作為檢測探針,當(dāng)ICA與其他檢測技術(shù)相結(jié)合時(shí),還可以發(fā)揮更多作用,為提高檢測能力,XI等[33]將表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)與免疫層析技術(shù)結(jié)合,利用對(duì)氨基苯硫酚修飾的膠體金作為拉曼光譜增強(qiáng)信號(hào),建立了一種以膠體金為活性基底的拉曼光譜增強(qiáng)免疫層析法,可實(shí)現(xiàn)對(duì)β-伴大豆蛋白的定量檢測,目測檢出限為1 μg/mL,儀器檢出限為32 ng/mL。YIN等[34]建立了一種條碼式的免疫層析法,用于檢測麥醇溶蛋白,該方法以膠體金為標(biāo)記物,并與雞多克隆抗麥醇溶蛋白免疫球蛋白Y(immunoglobulin Y,IgY)抗體非共價(jià)結(jié)合,NC膜上設(shè)置有2條檢測線,測試線1的臨界值設(shè)置為10 mg/kg,測試線2的臨界值設(shè)置為50 mg/kg,該方法可通過試紙條上出現(xiàn)的檢測線數(shù)量與分析物濃度之間的關(guān)系來快速提供半定量結(jié)果,具有耗時(shí)短、低成本等優(yōu)點(diǎn),目測檢出限為10 mg/kg。在多靶標(biāo)檢測中,膠體金免疫層析檢測線顏色過于單一,區(qū)分度較低。ANFOSSI等[35]利用金和銀納米顆粒為標(biāo)記物,建立了一種多色多重免疫層析法,用于多種過敏原檢測,該方法將針對(duì)卵清蛋白、酪蛋白和榛子過敏原的抗體分別與球形銀納米顆粒(argentum nanoparticles,AgNPs)、球形和沙漠玫瑰狀金納米顆粒(aurum nanoparticles,AuNPs)偶聯(lián),作為檢測探針,該方法靈敏度高,目測檢出限為0.1 mg/L,可產(chǎn)生3種不同顏色(青色/酪蛋白、黃色/卵清蛋白、紅色/榛子蛋白),在實(shí)際應(yīng)用中,能夠根據(jù)探針的顏色輕松識(shí)別商品中的過敏原,具有簡單便捷、節(jié)約成本等優(yōu)點(diǎn)。GALAN-MALO等[36]建立了一種基于彩色乳膠顆粒的免疫層析法,可以對(duì)β-LG和酪蛋白進(jìn)行同時(shí)檢測和獨(dú)立檢測。該方法將紅色和藍(lán)色羧基改性染色乳膠顆粒作為抗體標(biāo)記物,與膠體金相比,由于乳膠微球具有良好的穩(wěn)定性,并且色彩艷麗,具有很好的視覺效果等優(yōu)點(diǎn),可以有效提高試紙條檢測靈敏度,對(duì)β-LG目測檢出限為0.5 μg/mL,酪蛋白目測檢出限為2 μg/mL。雖然有色納米顆粒在食物過敏原檢測中應(yīng)用較為廣泛,但檢測中往往存在一些背景干擾,易出現(xiàn)假陽性或者假陰性等問題。

3.2 基于磁性納米顆粒的免疫層析

磁性納米顆粒是指顆粒直徑在1～100 nm的磁性材料。根據(jù)納米標(biāo)記物本身自帶的磁性,具有穩(wěn)定性好、檢測信號(hào)持續(xù)時(shí)間長等優(yōu)點(diǎn),并且在應(yīng)用過程中可以簡化操作、縮短檢測時(shí)間、提高檢測效率等,在免疫層析技術(shù)中具有廣闊的應(yīng)用前景。常見的磁性納米顆粒有免疫磁性納米粒子(immunomagnetic nanoparticle,IMNP)[37]、超順磁性納米顆粒(superparamagnetic nanoparticle,SPMNP)[38]、Fe3O4/Au納米粒子[39]等。在食品檢測中,對(duì)食用油中可能殘存的花生過敏原進(jìn)行檢測較為困難,YIN等[40]開發(fā)了一種基于IMNP的免疫層析法,該方法將IMNP與抗Ara h 2的多抗偶聯(lián)形成復(fù)合物IMNP-pAbs,并作為檢測探針,在外加磁場的作用下可以簡便地分離出食用油中的Ara h 2,很大程度上簡化了樣品處理,并且可以在試紙條上產(chǎn)生棕色信號(hào)。在食用油中的目測檢出限為0.1 mg/kg。在此基礎(chǔ)上,YIN等[41]運(yùn)用IMNP為抗體標(biāo)記物開發(fā)了一種用于檢測加工食品中Ara h 1的免疫層析試紙條,目測檢出限為0.01 μg/mL。SHI等[42]開發(fā)了一種基于超順磁性納米顆粒的免疫層析法用于檢測過敏原TM,與傳統(tǒng)的標(biāo)記材料相比,SPMNPs受到食物基質(zhì)干擾的影響較小,信號(hào)不會(huì)在很長時(shí)間內(nèi)退化,而且在必要時(shí)可以重新檢查ICA試紙條,該方法檢測范圍為0.01～20 μg/mL,儀器檢出限為12.4 ng/mL。ZHENG等[43]利用SPMNPs作為抗體標(biāo)記物,將抗PV的單抗固定在SPMNP表面,制備了PV特異性的SPMNP探針,建立了一種SPMNP探針標(biāo)記的競爭形式免疫層析法,利用磁性分析閱讀器系統(tǒng)讀取磁信號(hào)來實(shí)現(xiàn)定量測量,目測檢出限為5 mg/mL,儀器檢出限為0.046 mg/mL。對(duì)29份食品提取物樣品分別進(jìn)行了免疫層析法和Western Blot檢測,比較結(jié)果表明,2種方法的相對(duì)符合率為93.1%(27/29)。李夢銀[44]以Fe3O4為核心,膠體金為殼,制備了金磁(Fe3O4/Au))復(fù)合微粒,建立了一種基于金磁復(fù)合微粒的免疫層析法,用于高特異性檢測過敏原PV,目測檢出限為4 ng/mL,該方法與普通膠體金試紙條相比,可通過磁信號(hào)分析儀直接得到信號(hào)值,靈敏度高,彌補(bǔ)了膠體金免疫層析無法量化的缺陷,達(dá)到對(duì)PV的定量檢測。ZHANG等[45]建立了一種基于Fe3O4/Au的免疫層析法,用于檢測過敏原PV,利用Fe3O4/Au納米微粒具有超順磁性的性能,采用Fe3O4/Au標(biāo)記抗體,進(jìn)一步簡化了樣品處理,使用試紙條讀卡儀進(jìn)行定量分析,目測檢出限為2 ng/mL,儀器檢出限達(dá)0.691 ng/mL。磁性納米顆粒作為ICA中新型標(biāo)記材料,已經(jīng)引起廣泛關(guān)注,但在應(yīng)用中往往需要磁性閱讀器輔助讀值才能得到檢測結(jié)果,降低了應(yīng)用的便捷性。

3.3 基于熒光納米顆粒的免疫層析

熒光納米顆粒包括量子點(diǎn)(quantum dot,QD)[46]、熒光微球[47]、上轉(zhuǎn)換熒光微球[48]等,量子點(diǎn)是一種納米尺度的半導(dǎo)體材料,一般為球形或準(zhǔn)球形,直徑<10 nm。主要由Ⅱ～Ⅵ族(如CdTe、CdS、ZnSe等)或Ⅲ～Ⅴ族(如In P、In As等)元素組成的納米顆粒,與傳統(tǒng)的標(biāo)記物相比,量子點(diǎn)具有穩(wěn)定的熒光和亮度等優(yōu)異的熒光特性[49]。WANG等[50]建立了一種基于量子點(diǎn)的免疫層析法,將水溶性QD標(biāo)記多克隆抗體(polyclonal antibodies,pAbs)形成QD-pAbs聚合物,并作為檢測探針,該方法通過試紙條讀卡儀可以實(shí)現(xiàn)定量檢測,目測檢出限為0.5 μg/mL,儀器檢出限為0.05 μg/mL。熒光微球因其構(gòu)型穩(wěn)定、熒光強(qiáng)度高、光穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn),越來越多地被用作免疫分析的檢測標(biāo)記。楊亞杰等[51]利用表面羧基化修飾的熒光微球與抗體表面的氨基共價(jià)結(jié)合,形成熒光微球檢測探針,建立了一種熒光微球免疫層析法,可用于酪蛋白的檢測,由于熒光微球具有發(fā)光效率高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn),靈敏度得到進(jìn)一步提高,目測檢出限達(dá)100 ng/mL。雖然熒光納米顆粒可以通過不同的方法來實(shí)現(xiàn)高靈敏度檢測,但熒光信號(hào)易猝滅等問題導(dǎo)致其不能夠長期保存,不利于大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。

4 結(jié)語

免疫層析技術(shù)具有靈敏度高、操作簡便、檢測成本低等優(yōu)點(diǎn),目前,已在食物過敏原快速檢測方面有較廣泛的應(yīng)用,然而,免疫層析技術(shù)在過敏原檢測中仍有很大發(fā)展空間。1)食物過敏原多靶標(biāo)檢測。在復(fù)雜的食品基質(zhì)中,往往存在多種食物過敏原,目前,在對(duì)多種過敏原同時(shí)檢測的研究中,存在著靈敏度較低、穩(wěn)定性較差以及同時(shí)檢測的最大分析物數(shù)量存在固有的限制等問題。利用微陣列格式對(duì)檢測線進(jìn)行改造及不同納米標(biāo)記物的應(yīng)用等,開發(fā)一種可商業(yè)化的、同時(shí)檢測食品中多種過敏原的免疫層析技術(shù),將是未來發(fā)展的一個(gè)方向。2)實(shí)現(xiàn)定量分析。定量分析是免疫層析研究中的重點(diǎn),單獨(dú)依靠免疫層析技術(shù)很難實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的定量分析,在食物過敏原檢測中,將智能手機(jī)等其他便攜式智能設(shè)備與免疫層析技術(shù)結(jié)合,開發(fā)可以對(duì)食物過敏原進(jìn)行現(xiàn)場快速定量檢測方法是發(fā)展的趨勢。3)新型納米標(biāo)記物的應(yīng)用。抗體標(biāo)記物本身的性質(zhì)會(huì)很大程度上影響免疫層析技術(shù)檢測過敏原的靈敏度,然而,近年來,在過敏原檢測中仍以膠體金等傳統(tǒng)標(biāo)記物的應(yīng)用為主,表2簡要總結(jié)了近年來不同新型納米標(biāo)記物的免疫層析技術(shù)在食物過敏原快速檢測中的應(yīng)用。隨著新型納米標(biāo)記物的出現(xiàn)及應(yīng)用,將不斷推動(dòng)免疫層析技術(shù)在過敏原檢測研究中的發(fā)展。4)加工食品中過敏原的致敏性變化。食物過敏原在生產(chǎn)加工過程中,會(huì)受到各種因素(高溫,高壓,輻照等)影響導(dǎo)致結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,其致敏性可能會(huì)發(fā)生變化,從而影響免疫層析技術(shù)的檢測結(jié)果,在研究中也是值得關(guān)注的一個(gè)重要問題。5)特異性抗體替代物的研究。適配體因其具有和抗體相似的功能,且穩(wěn)定性、重復(fù)性等方面具有一定優(yōu)勢,可作為抗體的良好替代物,但在眾多檢測食物過敏原的研究中,利用適配體作為過敏原的識(shí)別分子報(bào)道較少。因此,篩選食物過敏原的適配體,并將其用于層析檢測的識(shí)別元件,具有良好的發(fā)展前景。6)綠色環(huán)保免疫層析試紙條的研究。免疫層析試紙條作為一次性用品,在參與大規(guī)模現(xiàn)場檢測過程中,會(huì)產(chǎn)生很多廢棄物,通過對(duì)使用的環(huán)保材料進(jìn)行改進(jìn),例如用可回收或可生物降解的塑料作為試紙條塑料殼、用纖維素代替硝酸纖維素膜等,開發(fā)綠色環(huán)保的免疫層析試紙條將成為新的研究方向。

表2 不同納米標(biāo)記物在食物過敏原免疫層析檢測中的應(yīng)用Table 2 Application of different nanomarkers in ICA for food allergens