基于網絡藥理學的大黃蟄蟲丸治療結直腸癌作用機制研究

柏小輝 蔣 麗 吳 震 陶 琦 潘萌莎

結直腸癌（Colorectal cancer，CRC）目前已成為一種普遍的惡性腫瘤，全球發病率不斷上升，CRC的發展過程具有多階段、多步驟的特點[1]，早期CRC可通過手術方法治療，發展到中晚期后則需依賴于化療、放療提高其五年生存率。雖然靶向藥物在治療CRC方面有優勢，但對于自然或獲得性耐藥，其生存效益并不十分理想。根據《金匱要略》闡述及臨床經驗，大黃蟄蟲丸（DHZCP）主要用于治療因五勞七傷而致淤血阻滯，臨床以體形消瘦、兩目黯黑、肌膚甲錯、腹滿不食為特征。組方由熟大黃、蟄蟲（炒）、水蛭（制）、虻蟲（去翅足，炒）、蠐螬（炒）、桃仁、干漆（煅）、黃芩、白芍、炒苦杏仁、地黃和甘草12 味中藥組成，具有“掃毒攻堅，蕩滌積垢，推陳出新，蟲動其疲，通以去閉，活血化疲?！敝π?。對于CRC中后期出現的腹痛、消瘦、貧血、乏力、腸梗阻等癥狀有較好的針對性[2]。

網絡藥理學為目前中藥學科的前端研究，通過揭示疾病、靶蛋白與藥效組分之間的內在聯系，在分子層面探索藥效組分的作用機制，這與具有多組分、多途徑、多靶點特性的中藥復方擁有天然的兼容性，從而為中醫向循證醫學轉變提供了新思路[3]。DHZCP治療CRC確有療效，但其藥效物質基礎致使其臨床應用受限。本文擬通過網絡藥理學方法，探尋DHZCP所含化學組分與CRC相關靶點的結合效應，進而從系統生物學整體水平闡釋其藥效物質基礎與作用機制，為DHZCP應用于CRC臨床提供依據。

1 材料與方法

1.1 DHZCP化學組分數據庫的構建 使用傳統中藥系統藥理學數據庫TCMSP和中國中藥整合數據庫TCMID收集DHZCP中每味中藥的所有化學組分，并結合文獻進行數據整理。

1.2 有效化學成分的篩選 本研究的建構模型為ADME（藥物吸收、分布、代謝、排泄）模型，借助TCMSP平臺系統來獲取化學組分的口服利用度（OB）和類藥性（DL）信息，篩選條件為OB≥30%及DL≥0.18，以此獲得活性組分的作用靶點。運用UniProt數據庫統一檢索蛋白靶點ID及基因名。

1.3 DHZCP抗CRC核心靶點確定 基于DrugBank及聯合化療方案[4]，確定包括5-Fu、左旋亞葉酸、替吡嘧啶、瑞格菲尼、卡培他濱、伊立替康、曲氟尿苷、雷替曲塞、紫杉醇在內的CRC化療藥物9個，通過PharmMapperServer數據庫預測其作用靶點?；贕eneCards數據庫驗證陽性藥預測靶點與CRC的關系。將上述陽性藥與DHZCP組分導入SwissTargetPredicton與PharmMapper數據庫搜索作用靶點，合并去重后獲得陽性藥作用靶點和DHZCP組分的作用靶點。此外，在CTD數據庫、GeneCards數據庫中，以關鍵詞“Colorectal Cancer”進行搜索。

1.4 網絡模型拓撲學參數分析 使用NetworkAnalyzer插件計算網絡模型拓撲學參數，靶點蛋白作為網絡節點，度中心度（DC）、接近中心度（CC）、中介中心度（BC）作為與靶點蛋白相關聯的主要參數值。綜合前人研究經驗[5]和特點，用“目標重要性（TI）”來定義主要目標評價指標。其中，TI值與模塊中的關鍵目標成正比關系，即TI值越大則表明模塊中擁有越多的關鍵目標。

1.5 KEGG通路富集分析 使用在線分析工具DAVID[6]軟件針對上述26 個重要靶點進行KEGG通路注釋分析，設定閾值P＜0.05。再通過Omicshare云平臺系統對以上數據開展可視化處理。

2 結 果

2.1 活性組分的篩選 通過TCMSP、TCMID并結合文獻挖掘收集大黃蟄蟲丸中所含化學組分，以OB≥30%及DL≥0.18為條件對化學組分進行篩選，確定大黃蟄蟲丸活性組分共226個，其中大黃19個、動物藥25個、桃仁26個、干漆0個、黃芩40個、白芍19個、苦杏仁19個、地黃5 個、甘草99 個，包含14 個共有化學組分。

2.2 核心靶點確定 將陽性藥預測靶點374 個（匹配度≥3）、DHZCP作用靶點282 個、CRC疾病相關靶點630 個取交集，獲得DHZCP治療CRC核心靶點34 個（見圖1）。這些靶點不僅與CRC疾病密切相關，同時是CRC常用化療藥物與DHZCP的共同作用靶點。

圖1 大黃蟄蟲丸、陽性藥與結直腸癌疾病相關基因交集靶點韋恩圖

2.3 關鍵藥效組分及主要靶點的網絡特性 借助系統NetworkAnalyzer插件進行計算網絡模型的拓撲學參數，通過網絡節點的中心度值、網絡度及親中心度值可以獲得各節點的TI值。分析數據篩選出7 個T≥0.2 的關鍵藥效組分，依次為槲皮素、山奈酚、L-尿苷、白樺脂酸、漢黃芩素、異鼠李素、1-甲氧基菜豆素（見表1）。所篩選的關鍵組分不僅作用于更多的靶點，而且與眾多靶點之間的最短路徑的個數、接近程度均居于網絡前列。進一步篩選出包含NOS2、PPARG、PIK3CG、F2、GSK3B、CDK2、PGR、CHEK1 等在內的出26 個主要靶點（見表2），其TI值均大于或等于0.11。

表1 7個關鍵藥效組分的網絡特性

表2 26個主要靶點的網絡特性

2.4 PPI網絡分析和關鍵靶點的篩選 把以上26 個重要靶點上傳至STRING平臺系統，得到PPI網絡圖（見圖2）。PPI網絡圖涵蓋節點數26 個和136 條互作邊，0.755 作為平均節點度值。將“節點-節點”依據綜合評分進行排序，排名靠前的分別為AKT1-NOS3，AKT1-GSK3B，CCNA2-CDK2，CASP3-MAPK14，NOS3-KDR，STAT1-MAPK14，AKT1-PIK3CG等。

圖2 大黃蟄蟲丸的26個共有靶點網絡關系圖

2.5 靶點生物功能及靶點-通路分析 將26 個重要靶點進行KEGG富集分析（P＜0.05），結果顯示涉及的相關信號通路共111 條。其中，共同靶點主要富集的關鍵通路為PI3K-Akt、TNF、VEGF、HIF-、FoxO、Apelin、MAPK信號通路等。

3 討 論

CRC常引起消化道出血、穿孔等并發癥，治療和預后效果不佳，復發和病死率較高。DHZCP出自《金匱要略》，是治療“五勞極虛[7]，贏瘦腹滿，不能飲食”的著名方劑。臨床以DHZCP用于CRC術后輔助治療，具有較好的效果。

本研究通過篩選中藥方劑DHZCP的有效化學組分并對其拓撲學參數進行分析，得到幾種重要組分。其槲皮素重要性排名最高（TI=0.44），研究顯示，槲皮素細胞增殖、促凋亡、抑制腫瘤血管生成和抗CRC細胞轉移的作用[8]。動物藥中重要性排名最高的組分為L-尿苷（TI=0.34），L-尿苷為RNA成分D-尿苷的對映異構體，但缺乏抗CRC活性的相關報道。

KEGG通路富集分析：PI3K-Akt信號通路為DHZCP抗CRC通路中涉足基因數最多的信號通路，涵蓋GSK3B、MAPK1、PIK3CG、CDK2、KDR、AKT1、NOS3 共計7 個靶點。值得注意的是，參照STRING在線數據平臺分析結果，上述7 個靶點綜合評分均居于靶點互作網絡最前列，提示PI3KAkt信號通路可能為DHZCP發揮抗CRC作用的關鍵通路。DHZCP“單靶點”與“多靶點網絡”聯合的作用模式，或許為針對PI3K-Akt通路靶向藥物的研發提供思路。

綜上所述，基于網絡藥理學研究，初步探索了經典名方DHZCP治療CRC的作用機制。DHZCP通過多靶點、多途徑治療CRC，屬于系統性調控過程。至于DHZCP中化學成分與化學成分之間的相互作用、組分的含量以及藥物在體內的代謝過程等對疾病的影響因素還需進一步探究。