霍山石斛和西洋參配伍對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的大鼠血虛證模型治療作用研究

張小勇 邵銀盈 薛曉輝 孟廣東

血虛證為中醫(yī)臨床常見(jiàn)的癥候群之一，表現(xiàn)為唇舌面淡白，毛發(fā)無(wú)光澤，脈細(xì)弱、頭昏乏力。其主要原因是血液虧虛，不能滋養(yǎng)經(jīng)絡(luò)、臟腑。血液虧虛由兩方面原因所致，一方面是相關(guān)臟腑功能減退，血液來(lái)源不足，另一方面是血液損耗太多，多因大量出血或者大病、久病、勞神太過(guò)而致[1-2]。

霍山石斛俗稱米斛，正式載入2020 版《中國(guó)藥典》，具有益胃生津，滋陰清熱的功效。西洋參為五加科人參屬植物，功能以補(bǔ)益為主，能夠清熱生津，補(bǔ)氣養(yǎng)陰。現(xiàn)代研究表明，霍山石斛富含多糖、生物堿、黃酮、蛋白質(zhì)、氨基酸和聯(lián)芐類(lèi)化合物等多種成分，在抑制腫瘤、提高免疫、抗衰老、抗氧化、抗白內(nèi)障和肝損傷保護(hù)等方面具有較強(qiáng)的藥理活性[3]。貧血小鼠使用西洋參莖葉總皂甙后，可明顯促進(jìn)紅細(xì)胞總數(shù)（RBC）、血紅蛋白（HB）、骨髓有核細(xì)胞（BMC）、血小板（PLT）的數(shù)值提高，抑制白細(xì)胞總數(shù)（WBC），WBC數(shù)值降低（P＜0.05），加快貧血小鼠造血功能的恢復(fù)[4]。本研究建立血虛證大鼠模型，考察霍山石斛和西洋參破壁飲片配伍使用對(duì)血虛證的治療作用，為霍山石斛、西洋參合用治療血虛證提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量（220±20）g，許可證號(hào)：SCXK（蘇）2017-0003，于安徽中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房常規(guī)飼養(yǎng)，室溫（20±5）℃，濕度40%～70%的環(huán)境下。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物顆粒飼料的生產(chǎn)許可證為京飼證（2019）06076，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)：2021DW005）。

1.2 藥物與試劑 環(huán)磷酰胺（ 生產(chǎn)批號(hào)20092225）。當(dāng)歸補(bǔ)血口服液（ 生產(chǎn)批號(hào)012011181）；霍山石斛（生產(chǎn)批號(hào)20191153）；西洋參（生產(chǎn)批號(hào)19023354）。Rat IL-2 ELISA Kit（ 批號(hào)A30200842）；Rat IL-6 ELISA Kit（ 批號(hào)A30601231）；Rat EPO ELISA Kit（ 批號(hào)Q81LJ8U2N1）；Rat MCSF ELISA Kit（ 批號(hào)UH8N57E56A）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 邁瑞Mindray全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀BC-5390CRP；酶標(biāo)儀；低速大容量離心機(jī)；電子天平；HJ-4A恒溫磁力攪拌器。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 建立環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的大鼠血虛證模型 大鼠常規(guī)飼養(yǎng)1 周后，對(duì)除正常組以外的所有大鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺30 mg/kg，建立大鼠血虛模型，給藥容積0.3 mL/100 g，連續(xù)給藥4 d。

1.4.2 分組與給藥 將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（當(dāng)歸補(bǔ)血口服液）、霍山石斛和西洋參高（1.8 g/kg）、中（0.9 g/kg）、低（0.45 g/kg）劑量組，共6 組。陽(yáng)性對(duì)照組大鼠以2.0 mL/kg的劑量給藥當(dāng)歸補(bǔ)血口服液。分別制備霍山石斛和西洋參破壁飲片，按比例混合后加純化水制成混懸液，每天給藥一次，給藥容積1 mL/100 g，正常組和模型組給予等體積的生理鹽水，連續(xù)給藥14 d。

1.5 檢測(cè)指標(biāo) ①大鼠的一般狀態(tài)觀察：觀察給藥期間大鼠的精神狀態(tài)、活躍度、毛色、尾、爪色澤、食量等基本情況，每隔7 天稱重一次，記錄體質(zhì)量。根據(jù)體質(zhì)量變化按給藥標(biāo)準(zhǔn)調(diào)整劑量。②外周血象指標(biāo)的檢測(cè)：給藥14 d后，提前對(duì)所有大鼠禁食不禁水12 h。將實(shí)驗(yàn)大鼠稱重后用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）進(jìn)行麻醉。取腹主動(dòng)脈血樣2 mL，注入EDTA-K2 抗凝管中，用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀分析抗凝管中的血樣，測(cè)定血象指標(biāo)：白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、血小板計(jì)數(shù)（PLT）、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBC）、淋巴細(xì)胞百分比（LYM）和血紅蛋白（HGB）。③免疫和造血相關(guān)因子水平檢測(cè)：取腹主動(dòng)脈血樣5 mL注入無(wú)抗凝劑的采血管中，離心取血清，置凍存管中，于-20 ℃儲(chǔ)存待檢。檢測(cè)時(shí)按照ELISA試劑盒中的說(shuō)明書(shū)，依次在標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔中加入相應(yīng)試液，加檢測(cè)抗體，孵育，洗板，各孔加入底物，孵育，加終止液，制標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)血清中免疫相關(guān)因子（IL-2、IL-6）和造血相關(guān)因子（EPO、M-CSF）水平。④胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的檢測(cè)：采集大鼠的胸腺和脾臟組織將其用濾紙吸去表面液體，稱重記錄。以下述公式計(jì)算臟器指數(shù)（OI）：脾臟指數(shù)（g/kg）=脾臟質(zhì)量/ 體質(zhì)量；胸腺指數(shù)（g/kg）=胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用（±s）表示，各組數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠體質(zhì)量和一般狀態(tài)觀察結(jié)果比較 正常組大鼠活動(dòng)敏捷，反應(yīng)迅速，食量正常，模型組大鼠的活躍度下降，精神狀態(tài)不佳，目光呆滯，毛發(fā)無(wú)光澤且耳、尾顏色明顯變蒼白，飲食和飲水量減少。給藥組大鼠較模型組上述癥狀均有明顯改善。給藥7 天后，模型組大鼠體質(zhì)量明顯下降，與正常組相比差異顯著（P＜0.01）。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組與霍山石斛和西洋參高劑量組大鼠體質(zhì)量有所提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。霍山石斛和西洋參給藥組對(duì)于體質(zhì)量的影響呈現(xiàn)劑量依賴性，高劑量對(duì)于體質(zhì)量的提高優(yōu)于中、低劑量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 霍山石斛和西洋參對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響（±s，n=10）

表1 霍山石斛和西洋參對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響（±s，n=10）

注：與正常組比較，★★P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05

組別體質(zhì)量（g）給藥第1天 給藥第7天 給藥第14天正常組234.46±21.20 271.86±39.15 292.97±24.19模型組235.28±21.34 215.85±19.61★★220.7±13.53★★陽(yáng)性對(duì)照組233.90±23.68 243.57±33.70# 257.94±19.62#霍山石斛和西洋參高劑量組236.53±21.58 242.51±30.52# 258.96±19.43#霍山石斛和西洋參中劑量組236.57±19.81 240.18±31.25 243.77±15.39霍山石斛和西洋參低劑量組239.62±24.48 234.55±13.69 224.23±18.98

2.2 霍山石斛和西洋參對(duì)外周血象的影響 與正常組相比，模型組大鼠外周血象中的WBC、PLT、RBC、LYM、HGB水平下降趨勢(shì)明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。各給藥組對(duì)于外周血液均有一定程度的改善作用，與模型組相比較，霍山石斛和西洋參高劑量組大鼠外周血液中上述5個(gè)指標(biāo)水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）；霍山石斛和西洋參中劑量組大鼠外周血液中WBC、PLT、RBC水平顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01）；霍山石斛和西洋參低劑量組大鼠外周血液中WBC、PLT水平顯著升高（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠外周WBC、PLT、RBC、LYM和HGB水平檢測(cè)結(jié)果比較（±s，n=10）

表2 各組大鼠外周WBC、PLT、RBC、LYM和HGB水平檢測(cè)結(jié)果比較（±s，n=10）

注：與正常組比較，★★P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別WBC(109/L)PLT(109/L)RBC(109/L)LYM(%)HGB(109/L)正常組4.24±1.61707.09±88.986.92±0.3169.41±7.58139.9±5.58模型組0.10±0.06★★94.53±14.19★★4.92±0.39★★42.92±4.85★★98.75±9.52★★陽(yáng)性對(duì)照組0.29±0.15##202.23±44.76##5.66±0.34##53.56±5.71#116.44±10.33#霍山石斛和西洋參高劑量組0.27±0.05##181.62±32.88##5.62±0.32##52.77±5.46#115.00±5.39#霍山石斛和西洋參中劑量組0.21±0.06##179.33±25.04##5.52±0.30#48.93±5.68113.33±6.65霍山石斛和西洋參低劑量組0.20±0.02##149.00±26.54##5.23±0.4744.20±6.44109.63±11.27

2.3 霍山石斛和西洋參對(duì)免疫和造血相關(guān)因子的影響 與正常組相比較，模型組大鼠血清中IL-2、IL-6、EPO、M-CSF水平具有顯著差異（P＜0.01）。各給藥組對(duì)于免疫和造血相關(guān)因子水平均有不同程度的改善趨勢(shì)，與模型組相比，霍山石斛和西洋參高劑量組大鼠IL-2、IL-6、EPO、M-CSF水平顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01），霍山石斛和西洋參中劑量組大鼠M-CSF水平顯著升高（P＜0.01），霍山石斛和西洋參低劑量組大鼠IL-2、IL-6、EPO、M-CSF水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清中免疫和造血相關(guān)因子水平測(cè)定結(jié)果比較（± s，n=10）

表3 各組大鼠血清中免疫和造血相關(guān)因子水平測(cè)定結(jié)果比較（± s，n=10）

注：與正常組比較，★★P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別IL-2(pg/L)IL-6(pg/L)EPO(ng/L) M-CSF(pg/L)正常組1016.46±91.90 561.43±89.94 2.62±0.43 235.58±28.80模型組761.82±39.48★★ 103.5±13.51★★ 1.73±0.19★★112.42±14.94★★陽(yáng)性對(duì)照組 842.80±90.44# 139.95±22.68## 2.48±0.23## 191.32±26.28##霍山石斛和西洋參高劑量組 836.75±70.42# 124.15±16.95# 2.45±0.31# 177.41±24.06##霍山石斛和西洋參中劑量組 772.94±31.60122.79±17.24 2.19±0.24 163.98±12.99##霍山石斛和西洋參低劑量組 755.59±46.19118.39±24.46 2.04±0.37 136.76±16.12

2.4 霍山石斛和西洋參對(duì)胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響 與正常組相比，模型組大鼠胸腺和胸腺指數(shù)下降明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組及霍山石斛和西洋參高劑量組對(duì)于大鼠胸腺和脾臟指數(shù)有升高的趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；霍山石斛和西洋參中劑量組及其低劑量組大鼠胸腺和脾臟指數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表4。

表4 胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的測(cè)定結(jié)果比較（±s，n=10）

表4 胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的測(cè)定結(jié)果比較（±s，n=10）

注：與正常組比較，★P＜0.05、★★P＜0.01，與模型組比較#P＜0.05

組別臟器指數(shù)(g/kg)胸腺脾臟正常組2.40±0.213.71±0.77模型組1.22±0.24★ 1.77±0.23★★陽(yáng)性對(duì)照組1.53±0.22#2.15±0.16#霍山石斛和西洋參高劑量組 1.52±0.14#2.37±0.20#霍山石斛和西洋參中劑量組 1.41±0.171.86±0.29霍山石斛和西洋參低劑量組 1.08±0.091.80±0.31

3 討 論

中醫(yī)理論認(rèn)為，氣血密切相關(guān)，氣能生血，血不足者可補(bǔ)氣以生之，達(dá)到不治而治的目的。研究發(fā)現(xiàn)，西洋參能明顯升高血紅蛋白、紅細(xì)胞和血小板的數(shù)量，證實(shí)了“氣能生血”這一中醫(yī)理論的正確性[5]。西洋參不僅補(bǔ)氣，且同霍山石斛兼具生津功效，因此霍山石斛和西洋參合用補(bǔ)血，具有中醫(yī)理論基礎(chǔ)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察，給藥組大鼠體質(zhì)量增加，活動(dòng)增多，亦符合古籍記載霍山石斛具有“補(bǔ)五臟虛勞羸瘦”之功效。現(xiàn)代研究表明，鐵皮石斛能夠增加脾虛便秘型小鼠血小板比容、紅細(xì)胞比容，血小板計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)量，降低白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量，使其恢復(fù)至正常水平[6]。霍山石斛與鐵皮石斛同科同屬，以此作為切入點(diǎn)，研究霍山石斛補(bǔ)血作用，具有現(xiàn)代藥理學(xué)基礎(chǔ)。

血虛證造模的方法有失血法、溶血法、輻射損傷法、營(yíng)養(yǎng)法、化學(xué)損傷法等多種方法[7]。本實(shí)驗(yàn)采用環(huán)磷酰胺化學(xué)損傷法建立血虛證模型，環(huán)磷酰胺是典型的抗腫瘤藥，具有顯著的骨髓抑制作用，可引起骨髓造血干細(xì)胞損傷，外周血細(xì)胞下降，大鼠血虛證造模常用此法[8]。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般狀態(tài)的觀察發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在造模期間活躍度明顯下降，耳、尾明顯蒼白，體質(zhì)量下降，精神狀態(tài)萎靡，符合中醫(yī)血虛證的臨床表現(xiàn)。進(jìn)一步對(duì)模型組大鼠外周血象各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其WBC、PLT、RBC、LYM、HGB與正常組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01），由此可推斷環(huán)磷酰胺已經(jīng)抑制了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的骨髓造血功能，血虛證大鼠模型成功建立。

中藥破壁飲片是指將符合國(guó)家法定標(biāo)準(zhǔn)的植物類(lèi)中藥飲片，采用現(xiàn)代加工技術(shù)，粉碎至D90＜45μm（300 目以上），可供直接口服的中藥飲片粉末。與傳統(tǒng)飲片相比，其優(yōu)點(diǎn)是能夠保留全成分，有利于有效成分的釋放和溶出[9]。目前，中醫(yī)臨床上對(duì)于中藥破壁飲片的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，比如呼吸系統(tǒng)疾病、心腦血管系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等[10-11]。本次實(shí)驗(yàn)采用霍山石斛和西洋參破壁飲片對(duì)血虛證大鼠模型進(jìn)行治療，結(jié)果表明破壁飲片的治療效果明顯。因霍山石斛市場(chǎng)價(jià)格較高，破壁成粉末亦符合我國(guó)貴重藥材的使用傳統(tǒng)，因此，霍山石斛破壁飲片使用對(duì)藥品開(kāi)發(fā)具有一定指導(dǎo)意義。本研究發(fā)現(xiàn)，霍山石斛和西洋參破壁飲片對(duì)于外周血象指標(biāo)WBC、PLT、RBC、LYM、HGB水平以及相關(guān)的細(xì)胞因子IL-2、IL-6、EPO、M-CSF水平均有提高的趨勢(shì)，能提高大鼠胸腺和脾臟指數(shù)，呈現(xiàn)出劑量依賴性，高劑量比中、低劑量的治療效果好。

綜上所述，本研究表明霍山石斛和西洋參配伍對(duì)血虛證有一定的治療作用，但具體的臨床應(yīng)用效果還需進(jìn)一步研究。