微滴數(shù)字PCR在重癥急性胰腺炎疑似血流感染病原學(xué)診斷中的應(yīng)用

王新雨,李 剛,毛文健,楊 潔,張敬柱,柯路,,李維勤,,童智慧,

(1. 南京醫(yī)科大學(xué)金陵臨床醫(yī)學(xué)院重癥醫(yī)學(xué)科,江蘇 南京 210002; 2. 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,江蘇 南京 210002)

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是由多種病因引起的因胰酶異常激活消化胰腺自身及周?chē)M織而引發(fā)的急腹癥[1],其中20%的患者會(huì)伴發(fā)器官功能障礙和(或)胰腺壞死組織感染(infected pancreatic necrosis, IPN)進(jìn)展為重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP),病死率高達(dá)20%～40%[2-4]。SAP患者存在諸多引發(fā)血流感染(bloodstream infection, BSI)的高危因素,如侵入性操作、免疫抑制狀態(tài)、局灶性感染播散、醫(yī)院感染、營(yíng)養(yǎng)狀況差等[5],易誘發(fā)膿毒癥,加重器官功能障礙,嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。因此,快速、準(zhǔn)確識(shí)別BSI病原體是指導(dǎo)抗菌藥物使用的關(guān)鍵。目前,血培養(yǎng)(blood culture, BC)是BSI診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[6],但受其技術(shù)原理限制,存在陽(yáng)性率低、耗時(shí)長(zhǎng)、采血量大、易污染等缺點(diǎn)[7-8],難以實(shí)時(shí)輔助臨床診治。微滴數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(droplet digital PCR, ddPCR)作為第三代核酸擴(kuò)增與檢測(cè)技術(shù),通過(guò)平行的單分子擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)待檢靶分子載量值的絕對(duì)定量[9-11],能同時(shí)對(duì)病原體及耐藥基因進(jìn)行多重檢測(cè),具有快速、高靈敏度、不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線等優(yōu)勢(shì)[12],以及研究和臨床應(yīng)用前景。本研究基于SAP合并疑似BSI患者人群,評(píng)價(jià)ddPCR的病原學(xué)診斷效能,并探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2022年7—9月某院重癥醫(yī)學(xué)科收治的SAP患者,臨床醫(yī)生懷疑BSI發(fā)生時(shí),在同一時(shí)間、同一部位采集患者靜脈血標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)包括(1)依據(jù)改良Atlanta標(biāo)準(zhǔn)診斷為SAP[13]。(2)年齡≥18歲。(3)至少符合兩項(xiàng)全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)標(biāo)準(zhǔn):a)最高體溫>38℃或<36℃;b)心率>90次/min;c)呼吸>20次/min或PaCO2<32 mmHg;d)白細(xì)胞計(jì)數(shù)>12.0×109/L或<4.0×109/L。排除標(biāo)準(zhǔn)包括(1)拒絕抽血檢測(cè);(2)病歷資料不完整。本研究方案經(jīng)該醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào):2021NZKY-014-01),納入受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 BC法 按規(guī)范流程采集2套血標(biāo)本并送至微生物實(shí)驗(yàn)室[6],使用血培養(yǎng)儀(BD BactecTM FX40,美國(guó))按使用手冊(cè)對(duì)血標(biāo)本進(jìn)行分析,使用Vitek?MS系統(tǒng)(BioMerieux, version 1.7, 法國(guó))對(duì)培養(yǎng)陽(yáng)性血標(biāo)本進(jìn)行菌種鑒定,并進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)(antimicrobial susceptibility testing, AST)。

1.2.2 ddPCR法 按規(guī)范流程采集5～10 mL靜脈血于EDTA抗凝管中,2 h內(nèi)離心(3 000 r/min,15 min)后采集血漿。依次取60 μL洗脫液、2 mL血漿、10 μL內(nèi)對(duì)照、200 μL蛋白酶K加至提取槽并置于核酸提取儀進(jìn)行核酸提取,收集洗脫液并以5 μL/管加入至含靶標(biāo)的預(yù)混液試劑管中,放于標(biāo)本制備儀(DG32,領(lǐng)航基因科技,中國(guó))進(jìn)行液滴制備,使用PCR擴(kuò)增儀(TC1,領(lǐng)航基因科技,中國(guó))按照“95℃ 5 min; (95℃ 5 s,60℃ 20 s) ×40 循環(huán); 25℃ 5 min”循環(huán)參數(shù)進(jìn)行平行擴(kuò)增,最后使用生物芯片閱讀儀(CS7,領(lǐng)航基因科技,中國(guó))分析并報(bào)告病原體和耐藥基因型的類別及載量值。

1.2.3 ddPCR檢測(cè)范圍 檢測(cè)范圍包括15種病原體及5種耐藥基因,分別為銅綠假單胞菌、陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、腸球菌、鏈球菌、念珠菌、嗜麥芽窄食單胞菌、檸檬酸桿菌、黏質(zhì)沙雷菌、奇異變形桿菌、洋蔥伯克霍爾德菌,以及耐藥基因blaKPC、mecA、blaNDM/IMP、blaOXA-48、VanA/VanM。

1.3 數(shù)據(jù)收集 通過(guò)電子病歷系統(tǒng)收集患者的年齡、性別、身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、AP病因、首次檢測(cè)距發(fā)病日數(shù)、首次檢測(cè)當(dāng)日器官功能支持情況,收集兩種檢測(cè)方法的結(jié)果及從上機(jī)至報(bào)告最終結(jié)果的耗時(shí),每次檢測(cè)當(dāng)日的病情嚴(yán)重度評(píng)分,以及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)、檢測(cè)前1周內(nèi)的其他體液細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果等。

1.4 檢測(cè)結(jié)果解讀 如果檢測(cè)到一種或多種病原體認(rèn)定為陽(yáng)性結(jié)果,沒(méi)有檢測(cè)到病原體認(rèn)定為陰性結(jié)果。如果單次檢測(cè)兩種方法均為陰性或ddPCR檢測(cè)菌種等同/包含BC結(jié)果,定義為結(jié)果一致;BC呈陽(yáng)性,ddPCR呈陰性或檢測(cè)菌種不等同/不包含BC結(jié)果,ddPCR結(jié)果定義為假陰性;當(dāng)BC呈陰性,ddPCR呈陽(yáng)性,則判定為可能血流感染或推定假陽(yáng)性。可能血流感染是指ddPCR結(jié)果與檢測(cè)前1周內(nèi)非血標(biāo)本病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果相符;推定假陽(yáng)性是指ddPCR結(jié)果與檢測(cè)前1周內(nèi)非血標(biāo)本病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果不相符[14]。AST陽(yáng)性是指下述情況:AST顯示對(duì)亞胺培南或美羅培南耐藥,定義為碳青霉烯類耐藥,對(duì)應(yīng)ddPCR耐藥基因型為blaKPC、blaNDM/IMP、blaOXA-48;AST顯示對(duì)甲氧西林耐藥,對(duì)應(yīng)ddPCR耐藥基因mecA;AST顯示對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥,對(duì)應(yīng)ddPCR耐藥基因?yàn)閂anA/VanM。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 本研究共納入22例患者,年齡18～69歲,平均(42.4±15.3)歲,男性15例(68.2%),首次檢測(cè)時(shí)患者的平均C反應(yīng)蛋白(CRP)和降鈣素原(PCT)值分別為194.8 mg/L、4.19 μg/L。見(jiàn)表1。共送檢血標(biāo)本52份,ddPCR耗時(shí)[(0.16±0.03)d]低于BC耗時(shí)[(5.92±1.20)d;P<0.001]。

表1 22例SAP患者一般資料與臨床特征Table 1 General data and clinical characteristics of 22 SAP patients

2.2 病原體檢出情況 52份血標(biāo)本中,BC陽(yáng)性17份(32.7%),分離病原體29株,以凝固酶陰性葡萄球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌為主;ddPCR檢測(cè)陽(yáng)性41份(78.8%),檢出病原體73株,以肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、腸球菌為主。ddPCR檢測(cè)前7日內(nèi)患者引流液、痰、膽汁等34份體液標(biāo)本的細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果顯示,共分離病原體51株。見(jiàn)圖1。41.2%的BC陽(yáng)性及46.3%的ddPCR陽(yáng)性血標(biāo)本中檢測(cè)到兩種及以上病原體。見(jiàn)圖2。

圖1 SAP患者血標(biāo)本BC、ddPCR檢測(cè)及非血標(biāo)培養(yǎng)病原菌分布情況Figure 1 Pathogen distribution of blood specimens from SAP patients by BC and ddPCR as well as non-blood specimens by bacterial culture

圖2 ddPCR和BC單次檢測(cè)出病原體種類分布Figure 2 Distribution of pathogen species in single detection by ddPCR and BC

2.3 ddPCR檢測(cè)的診斷效能 在ddPCR檢測(cè)范圍內(nèi),共有50份血標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果納入診斷效能的計(jì)算,排除的2份血標(biāo)本BC檢測(cè)結(jié)果為惡臭假單胞菌和食酸代夫特菌,不在ddPCR檢測(cè)范圍內(nèi)。以BC為金標(biāo)準(zhǔn),兩種方法一致陽(yáng)性12份,一致陰性10份,總體一致性為44.0%(22/50),ddPCR的靈敏度為80.0%(12/15),特異度為28.6%(10/35),陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為32.4%(12/37)、76.9%(10/13);在考慮可能BSI之后,ddPCR的靈敏度為91.9%(34/37),特異度為76.9%(10/13),陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為91.9%(34/37)、76.9%(10/13)。見(jiàn)表2、圖3。

注:+表示陽(yáng)性;-表示陰性。圖3 目標(biāo)范圍內(nèi)ddPCR和BC的檢測(cè)情況及結(jié)果Figure 3 Detection results of ddPCR and BC in targeted range

表2 ddPCR在病原學(xué)診斷中的效能Table 2 Efficacy of ddPCR in etiological diagnosis

2.4 病原菌載量與感染指標(biāo)的相關(guān)性 相關(guān)性分析顯示,在ddPCR檢出的陽(yáng)性血標(biāo)本中,病原菌載量值與檢測(cè)當(dāng)日的CRP、PCT水平呈正相關(guān)(均P<0.05),與檢測(cè)當(dāng)日的體溫峰值、SOFA評(píng)分、MODS評(píng)分、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)均未見(jiàn)明顯相關(guān)性(均P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 病原菌載量與感染指標(biāo)的相關(guān)性Table 3 Correlation between pathogen load and inflammatory parameters

2.5 耐藥基因分布 17份BC陽(yáng)性的血標(biāo)本中12份AST陽(yáng)性。41份ddPCR陽(yáng)性血標(biāo)本中28份檢出耐藥基因,其中blaKPC陽(yáng)性19份,blaNDM/IMP陽(yáng)性9份,VanA/VanM陽(yáng)性6份,mecA陽(yáng)性5份。6份ddPCR檢出VanA/VanM基因的血標(biāo)本中,5份(83.3%)腸球菌陽(yáng)性;5份檢出mecA基因的血標(biāo)本中,4份(80.0%)葡萄球菌陽(yáng)性。12份AST陽(yáng)性血標(biāo)本中,ddPCR耐藥基因檢測(cè)陽(yáng)性9份(75.0%),其中8份(66.7%)耐藥基因結(jié)果等同或包含AST結(jié)果,不一致的4份標(biāo)本中存在2份漏檢,2份未在ddPCR檢測(cè)范圍內(nèi)。

3 討論

BSI是世界范圍內(nèi)一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題,延遲的感染源控制與不充分的抗感染治療會(huì)顯著增加患者死亡風(fēng)險(xiǎn)并影響長(zhǎng)期預(yù)后[15-17]。2021年《膿毒癥和膿毒癥休克管理國(guó)際指南》強(qiáng)調(diào):對(duì)于可能患有膿毒癥或膿毒癥休克的成人,應(yīng)在1 h內(nèi)給予抗菌藥物[18]。由于BSI的癥狀缺乏特異性、BC陽(yáng)性率低及存在滯后性,在BSI病原學(xué)早期診斷、感染程度分層、抗菌藥物精準(zhǔn)使用及療效監(jiān)測(cè)等方面存在諸多困難。

ddPCR作為一種新興的分子診斷技術(shù),不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線即可對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行絕對(duì)定量檢測(cè)[12],目前已廣泛應(yīng)用于無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)和腫瘤的液體活檢[19-20];同時(shí),在感染性疾病的診斷中也顯示出了巨大潛力[21]。本研究顯示,ddPCR在耗時(shí)方面明顯優(yōu)于BC,此為BSI病原學(xué)早期診斷,精準(zhǔn)指導(dǎo)抗菌藥物使用提供了可能;同時(shí),包括AP在內(nèi)的許多無(wú)菌性炎癥在發(fā)病早期具有發(fā)熱、炎癥指標(biāo)升高等易與感染相混淆的表現(xiàn)[22],ddPCR的使用將有助于臨床醫(yī)生對(duì)其進(jìn)行鑒別。考慮到BC存在一定假陰性率[23],本研究整合了檢測(cè)前1周內(nèi)非血標(biāo)本細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果來(lái)綜合判定BSI的可能,使ddPCR的靈敏度和特異度分別提升至91.9%、76.9%,與既往研究[24]報(bào)道一致。值得注意的是,ddPCR和BC在2份血標(biāo)本中均檢測(cè)到念珠菌,并且既往研究[14,25]也證實(shí)了ddPCR對(duì)于真菌的診斷性能。

BC陽(yáng)性血標(biāo)本中,有3份ddPCR檢測(cè)為陰性,在既往研究[21,26]中有類似報(bào)道,結(jié)合BC常見(jiàn)污染菌分布[6],考慮其中2份血標(biāo)本BC分離的溶血性葡萄球菌為采樣時(shí)混入的皮膚定植菌;另外1份血標(biāo)本BC分離出多種細(xì)菌,ddPCR漏檢了其中的黏質(zhì)沙雷菌和陰溝腸桿菌,筆者認(rèn)為可能是由于ddPCR檢測(cè)血漿中病原體DNA片段,存在DNA突變或在菌種過(guò)多時(shí)存在相互干擾的情況,進(jìn)而影響檢測(cè)的精準(zhǔn)度,還需要更多的基礎(chǔ)研究來(lái)證實(shí)。

在過(guò)去幾十年中,有250余種膿毒癥相關(guān)生物標(biāo)志物被研究用于輔助臨床決策[18,27],CRP和PCT等作為當(dāng)前研究和應(yīng)用最廣泛的生物標(biāo)志物,一定程度上反映了機(jī)體對(duì)病原體的免疫反應(yīng)強(qiáng)度[28]。本研究顯示了ddPCR陽(yáng)性血標(biāo)本中病原菌DNA載量值與檢測(cè)當(dāng)日的CRP和PCT水平呈明顯的正相關(guān)關(guān)系,表明ddPCR在檢測(cè)出病原體種類的同時(shí),也能較直觀地反映感染的嚴(yán)重程度[29-30];并且,憑借其絕對(duì)定量的特性,為抗感染療效的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)提供可能[31]。

近年來(lái),不斷有新興的檢測(cè)方法應(yīng)用于感染病原學(xué)領(lǐng)域[8,32-33],其中,宏基因組二代測(cè)序(meta-genomic next-generation sequencing, mNGS)應(yīng)用廣泛并在膿毒癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、組織感染等感染性疾病的病原體檢測(cè)中逐漸受到認(rèn)可[34-36]。有研究[37]比較了mNGS與ddPCR對(duì)于BSI的診斷效能,結(jié)果表明在ddPCR檢測(cè)范圍內(nèi),ddPCR具有更高的靈敏度和更短的檢測(cè)耗時(shí),然而mNGS具有更廣的檢測(cè)范圍,并且在罕見(jiàn)病原體的診斷上具有優(yōu)勢(shì)。筆者認(rèn)為,ddPCR在應(yīng)用方面還需考慮以下幾點(diǎn):首先,基于檢測(cè)血漿中微生物游離DNA(mcfDNA)的方法[38],ddPCR受病原體生存狀況影響小,使其在檢測(cè)中具有穩(wěn)定性和可重復(fù)性,但無(wú)法區(qū)分血液中的病原菌處于存活或失活狀態(tài);同時(shí),尚缺少病原菌DNA載量值定義BSI臨床診斷及判定抗菌藥物最佳啟動(dòng)時(shí)機(jī)閾值的相關(guān)研究。其次,盡管本研究在ddPCR檢測(cè)的多數(shù)血標(biāo)本中呈現(xiàn)了菌種與耐藥基因型的對(duì)應(yīng)關(guān)系,但ddPCR檢測(cè)出的耐藥基因型不等同于表型,且在多種病原菌感染時(shí)較難確定耐藥基因源于何種病原菌,使其在指導(dǎo)抗感染藥物使用時(shí)存在一定局限性。因此,如何將ddPCR更好地應(yīng)用到臨床實(shí)踐中還需要更多高質(zhì)量的前瞻性研究來(lái)明確。

本研究存在一定局限性。首先,該研究是在單中心進(jìn)行的,作為探索性研究樣本量較小;其次,未能評(píng)價(jià)和探討ddPCR在動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)個(gè)體抗感染療效、改善患者預(yù)后方面的效能。

綜上所述,ddPCR作為一種輔助BC診斷BSI的檢測(cè)方法具有靈敏度高、耗時(shí)低等優(yōu)勢(shì),對(duì)BSI病原體及耐藥基因的快速檢測(cè)具有一定的診斷意義,未來(lái)還需要更多前瞻性研究去探究其在指導(dǎo)抗菌藥物使用、療效動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)及改善患者預(yù)后等方面的臨床價(jià)值。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。