梓醇對2型糖尿病大鼠心肌纖維化及心肌細胞形態(tài)學的影響*

許 瑞，畢艷平，鄒國良，王 研，史建平，張 艷

1 遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 110032；2 吉林中西醫(yī)結合醫(yī)院，吉林 吉林 132012； 3 黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一種復雜的、慢性的、進展性的除控制血糖外，需要持續(xù)醫(yī)學護理手段以減少多種危險因素的代謝性疾病。與正常人群比較，DM 患者發(fā)生心血管疾病的風險顯著增加［1-2］。NUNODA 等［3］研究發(fā)現(xiàn)對于無瓣膜病、冠心病等心臟疾病的2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者，其右心室心內膜下活檢顯示心肌肥大，心肌間質纖維化嚴重。梓醇是玄參科植物地黃的有效成分之一，已證實梓醇可降低血糖，改善DM及其并發(fā)癥［4］，但其作用機制尚待進一步明確。本研究以高脂高糖膳食誘導及小劑量鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）腹腔注射建立T2DM大鼠模型，觀察梓醇對T2DM大鼠心肌纖維化及心肌細胞形態(tài)學的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF 級雄性Wistar 大鼠90 只，購自長春市億新實驗動物有限公司，動物許可證號：［SCXK（吉）2011-0004］。大鼠同室分籠飼養(yǎng)，實驗室通風良好，溫度、相對濕度適宜，12 h 光照周期，自由飲食水；普通飼料及高糖高脂飼料由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。隔日更換墊料。

1.2 實驗儀器Histostar 組織包埋機（美國賽默飛世爾科技公司）；HM 340E 型石蠟切片機（美國賽默飛世爾科技公司）；DP72 型顯微攝像系統(tǒng)（日本奧林巴斯公司）；AL204 型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；E-Centrifuge-6d 型離心機（美國威泰克公司）。

1.3 藥品與試劑鏈脲佐菌素STZ（美國Sigma化學公司，批號：Sigma-S0130）；梓醇（南京景竹生物科技有限公司，批號C85851-20mg）；鹽酸二甲雙胍片（中美上海施貴寶制藥有限公司，批號：H20023371）；檸檬酸緩沖溶液（武漢博士德公司，批號：AR0024）；轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）抗體、生物素標記山羊抗兔IgG、DAB 顯色液（北京博奧森公司，批號：bs-0086R、SP-0023、C-0010）。

1.4 動物分組、造模與干預措施采用隨機數(shù)字表法將SPF 級雄性Wistar 大鼠隨機分為正常組10只和實驗組80只。實驗組大鼠高脂高糖飼料喂養(yǎng)8 周后，腹腔注射鏈脲佐菌素STZ 溶液15 mg/kg制備T2DM 模型。將成模大鼠根據(jù)空腹血糖（fasting plasma glucose，F(xiàn)PG）、體質量隨機分為模型組、二甲雙胍組與梓醇低、中、高劑量組。二甲雙胍組灌胃二甲雙胍混懸液90 mg/kg，梓醇低、中、高劑量組分別灌胃梓醇2.5、5、10 mg/kg，正常組和模型組灌胃等體積生理鹽水，每日1 次，均灌胃12周［5］。

1.5 大鼠心肌組織結構及TGF-β1水平觀察實驗結束前1天禁食水12 h，次日上午經尾靜脈采血測量各組大鼠FPG，灌胃結束后以2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠，沿腹正中線打開腹腔，刺破橫隔膜，取出心臟，沖洗心臟內血液，濾紙吸干。然后沿心室長軸切取心室肌肉3 mm×3 mm×3 mm；迅速剪取近心尖部1/4心肌置于4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片；采用免疫組織化學法檢測心肌TGF-β1表達；應用Image-proplus 6.0圖像分析軟件，校正光密度后，每組隨機選取4張切片，測定TGF-β1表達陽性染色物質的平均光密度（mean optical density，MOD），MOD 是TGF-β1的蛋白相對表達量值，即積分光密度/面積（IOD SUM/area）；采用HE染色法，每組隨機選取4張切片，顯微鏡下觀察心肌組織結構。

1.6 統(tǒng)計學方法采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析，組間多重比較方差齊，采用LSD-t檢驗；方差不齊用Tanbane's T2 檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般情況至實驗結束時，因灌胃不當或出現(xiàn)并發(fā)癥等死亡大鼠共計7 只，即正常組、模型組、二甲雙胍組及梓醇高、中、低劑量組分別剩余10、9、10、10、10、9只大鼠，合計存活58只。

2.2 FPG 及心肌TGF-β1水平造模后，與正常組比較，模型大鼠FPG 增高（P＜0.05），提示模型制備成功。給藥結束后，與模型組相比較，梓醇高、中、低劑量組及二甲雙胍組大鼠FPG 降低（P＜0.05）；與二甲雙胍組比較，梓醇中、低劑量組大鼠FPG 水平升高（P＜0.05），梓醇高劑量組與二甲雙胍組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，各組大鼠心肌TGF-β1降低（P＜0.05）；二甲雙胍組和梓醇中劑量組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但均低于梓醇低劑量組（P＜0.05），高于正常組和梓醇高劑量組（P＜0.05）；梓醇高劑量組與其他組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠FPG及TGF-β1水平比較（±s）

表1 各組大鼠FPG及TGF-β1水平比較（±s）

注：a表示與正常組比較，P＜0.05；b表示與模型組比較，P＜0.05；c表示與二甲雙胍組比較，P＜0.05

組別正常組模型組二甲雙胍組梓醇高劑量組梓醇中劑量組梓醇低劑量組MOD（TGF-β1蛋白相對表達量）0.064±0.010 0.194±0.030a 0.125±0.013ab 0.092±0.017abc 0.139±0.036ab 0.167±0.016abc鼠數(shù)10 9 10 10 10 9造模后FPG（mmol/L）5.35±0.25 19.67±0.39a 19.80±0.36a 19.41±0.52a 19.84±0.93a 20.21±1.04a給藥結束后FPG（mmol/L）5.72±0.56 20.00±0.70a 8.98±0.26ab 9.21±0.74ab 10.61±0.88abc 13.71±0.62abc

2.3 大鼠心肌組織結構各組大鼠心肌纖維、胞質、膠原纖維呈深淺不一的紅色，細胞核呈藍色。梓醇高劑量組較正常組心肌纖維、胞質、膠原纖維、細胞核無明顯變化。模型組和梓醇低劑量組心肌纖維排列紊亂或不規(guī)整，局灶性溶解、斷裂，甚至呈小片狀分布，胞質染色不均勻，中度或輕度腫脹，部分心肌正常；部分細胞核變形，固縮，甚至碎裂消失；心肌間隙顯著增寬，可見大量或少量炎性細胞或成纖維細胞。二甲雙胍組和梓醇中劑量組心肌纖維排列略規(guī)整，心肌細胞核極少部分變形；心肌間隙略增寬，炎性細胞較少。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織結構（HE，×200）

3 討論

T2DM發(fā)生機制是胰島β細胞功能受損和胰島素抵抗（insulin resistance，IR），IR 往往發(fā)生在血糖升高之前。高糖高脂飲食聯(lián)合小劑量STZ腹腔注射是國內外公認的實驗類動物造模方法。本研究首先給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)8 周造成大鼠肥胖和IR，然后腹腔注射小劑量STZ 破壞胰島β細胞，使血糖升高［6］。持續(xù)高糖高脂飲食可增加糖尿病心血管疾病風險，且模型組大鼠包含T2DM 2 個特點：即IR 和糖脂代謝紊亂。有研究顯示注射40 mg/kg以上STZ會直接損害大鼠大部分胰島β細胞，建立T1DM 模型。本研究模擬了臨床由于長期高脂高糖進食且極少運動的不健康生活方式而發(fā)生的T2DM。

據(jù)相關研究報道，經STZ 誘發(fā)T2DM 大鼠糖尿病發(fā)病8～12 周后便有心肌超微結構病理改變，6～14 周有心功能改變［7-8］。而DM 心肌病典型病理特點為心肌肥大、凋亡、微血管病變和間質纖維化，臨床早期出現(xiàn)左心室肌肉肥厚和（或）舒張功能障礙，隨著病情的進展出現(xiàn)以擴張型心室重塑為特點的收縮功能不全。心臟組織結構變化是研究糖尿病心肌損傷病理狀態(tài)的重要依據(jù)。而心肌間質纖維化及肌原纖維重塑是DM 患者心臟組織結構損傷的主要發(fā)病機制［9-10］，其中TGF-β1是心肌纖維化的重要促發(fā)因子。正常情況下，TGF-β1會修復受損組織，抑制炎癥反應及細胞增生；在高糖狀態(tài)下，TGF-β1表達上調，進一步促成心肌成纖維細胞增殖、分化，加劇膠原成分累積，Ⅰ/Ⅲ型膠原比例失調，抑制膠原降解［11］。本研究觀察大鼠心肌組織病理切片可見正常組心肌纖維呈條束狀，整齊排列，無斷裂，無壞死灶；胞質均質紅染，無腫脹。心肌細胞核呈圓形或橢圓形，居細胞中央；心肌間隙正常，無炎性細胞浸潤。模型組大鼠高脂高糖喂養(yǎng)8 周后血糖升高，干預12 周，TGF-β1表達上調，心功能改變及心肌纖維排列紊亂，出現(xiàn)局灶性溶解、斷裂，甚至呈小片狀分布，胞質染色不均勻，中度腫脹，部分心肌保持正常；細胞核變形，固縮，甚至碎裂消失；心肌間隙顯著增寬，炎性細胞及成纖維細胞顯著增多，呈典型DM 心肌病的臨床和形態(tài)學特征。

目前研究顯示梓醇對心肌組織的保護作用主要通過抗氧化應激、抗炎及抗凋亡等途徑實現(xiàn)。近年國內外研究發(fā)現(xiàn)，梓醇通過調控Smad2/3和NF-κB信號通路抑制TGF-β1誘導的人非小細胞肺癌細胞上皮間質轉化［12］。梓醇可降低心肌TGF-β1表達，改善心肌纖維化［13］。且梓醇衍生的環(huán)烯醚萜苷可通過抑制人氣道上皮細胞中TGF-β1活化酶/TNF-α/NF-κB 通路減少MUC5AC mRNA 和蛋白表達［14］。梓醇也可減少血管TGF-β1和IV型膠原mRNA和蛋白表達而改善糖尿病兔動脈粥樣硬化［15］。梓醇也可通過下調大鼠腎皮質TGF-β1和CTGF mRNA 表達發(fā)揮腎保護作用［16］。本研究中梓醇各劑量組均可不同程度抑制TGF-β1表達，減少心肌纖維損傷、細胞核變形以及心肌間質的炎性細胞滲出，且高劑量組效果更優(yōu)，提示梓醇的心肌保護作用可能呈劑量依賴性。

綜上所述，梓醇可改善DM 心肌纖維化，減輕心肌細胞損傷，推測梓醇可能為保護心肌細胞的有效手段。而梓醇是否還有其他保護心肌細胞的分子機制仍需進一步探討。