基于生/醋大黃的大承氣湯對實熱壅滯證胎糞性腹膜炎小鼠血清ET、NO和T NF-α的影響*

陸景榮，陸梅元，曾海生，馬秀梅，陳 勇，趙鳳仙，陳宏夏

1 廣西國際壯醫醫院，廣西 南寧 530201； 2 廣西壯族自治區食品藥品審評查驗中心，廣西 南寧 530029；3 右江民族醫學院附屬醫院，廣西 百色 533000； 4 廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530200

大承氣湯出自《傷寒論·辨陽明病脈證并治》，由大黃、枳實、厚樸和芒硝組成，是瀉法的代表方劑［1-3］，具有瀉下熱結的作用，主治陽明腑實證和里熱實證等［4］。目前臨床主要用于治療急腹癥、腸梗阻與胃腸道功能障礙等疾病，該方還用于輔助改善腦血管患者意識、有機磷農藥急性中毒搶救的輔助治療等［5-6］。研究表明，大承氣湯具有瀉下、抑制血清內毒素、抗炎、提高機體免疫力等藥理作用［3］。大黃經過不同炮制方法，其化學成分及其藥效變化差異較大，甚至產生相反的藥效［7］。目前多報道大黃與多味藥配伍前后藥效變化情況［8-10］，鮮見報道大黃不同炮制品與多味藥配伍后的瀉下功效的變化。本實驗主要研究生、醋大黃炮制品的大承氣湯對實熱壅滯證胎糞性腹膜炎（faecal peritonitis with excessive heat stagnation，ABP）小鼠血清內毒素（endotoxin，ET）、一氧化氮（nitric oxide，NO）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）含量的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器20110793 型全波長酶標儀［BIOTEKEpoch（美國）］；PRACTUM224-KN SOP型電子分析天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）；TDL-80-2B型低溫離心機（上海安亭科學儀器廠）；ZH-B6 型代謝籠（安徽正華有限公司）；PYX-190H-B 型育溫箱（廣東科力有限公司）。

1.2 藥物與試劑顯色基質鱟試劑盒（廈門市鱟試劑試驗廠有限公司，批號：160525）；炎性介質TNF-α、NO 測試盒（南京建成生物工程研究所，批號：201706、20170406）；氨芐西林膠囊（聯邦制藥廠有限公司，批號：20300）；實驗用水為純水。

1.3 藥材大黃、枳實、厚樸及芒硝購于廣東康美藥業有限公司，經廣西中醫藥大學藥用植物教研室李斌副教授鑒定，大黃為蓼科植物藥用大黃Rheum officinaleBaill.的干燥根和根莖；枳實為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.的干燥幼果；厚樸為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalisRehd.et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮；芒硝為硫酸鹽類礦物芒硝族芒硝，主要含十水硫酸鈉（Na2SO4·10H2O）。見表1。

表1 藥材批號與產地

1.4 動物清潔級昆明種小鼠，體質量（20±2）g，雄性。實驗動物質量合格證號：0001757；實驗動物生產許可證號：SCXK（桂）2019-0002，均由廣西醫科大學試驗動物中心提供。

1.5 方法

1.5.1 藥液提取 按處方比例取厚樸24 g，枳實12 g，大黃生/醋藥材粉末各12 g，芒硝9 g，分別精密稱定，厚樸與枳實加純水500 mL，浸泡30 min后，加熱煮沸后保持微沸30 min，使用500目濾布過濾，藥渣再加純水500 mL 浸泡30 min，加熱煮沸保持微沸30 min，過濾，合并2 次濾液，然后分別加入生/醋大黃粉末，浸泡20 min，加熱煮沸，保持微沸20 min，使用500目濾布過濾，藥渣加入純水300 mL，加熱煮沸后保持微沸20 min，濾過，合并濾液，趁熱加入芒硝，攪拌使溶解，濃縮成濃度為0.3∶1 的藥液（含生藥0.3 g/mL），置于2～8 ℃冰箱儲存備用。同上述制備藥液方法，將藥液濃縮成濃度為0.5∶1的藥液（含生藥0.5 g/mL），置于2～8 ℃冰箱儲存備用。

1.5.2 ABP 小鼠動物模型建立 參考文獻［11］以及結合預實驗，隨機選取15 只健康小鼠為空白對照組，腹腔注射氯化鈉注射液0.5 mL/只。取小鼠糞便6 g，加入100 mL 生理鹽水，研磨均勻，靜置30 min，取上層混懸液，腹腔注射0.5 mL/只，20 h 后小鼠眼角出現濃稠分泌物、少動、蜷曲蹲伏、腹部鼓脹和大便極干等實熱壅滯癥狀。解剖腹腔可見腹腔內有少量渾濁液體，多數腸管膨脹，腸管充血，部分腸管痙攣，表示造模成功。

1.5.3 分組給藥 取體質量為（20±2）g 的健康小鼠105只，雄性，適應性喂養3天后隨機分為生大承氣湯6、10 g/kg 劑量組，醋大承氣湯6、10 g/kg劑量組，空白對照組、模型組、陽性對照組［（氨芐西林20 mL/kg（體質量）、60 mg/mL］，每組15 只。生/醋大承氣湯不同劑量組造模成功后灌胃，連續2天，每日1次。陽性對照組灌胃氨節西林1.2 g/kg，容積為20 mL/kg（體質量），連續2 天，每日1 次。空白對照組腹腔注射生理鹽水20 mL/kg（體質量），20 h后給予蒸餾水灌胃，連續2天，每日1次。模型組造模成功后灌胃蒸餾水，每日20 mL/kg（體質量），連續2天，每日1次。

1.5.4 血清ET、NO 和TNF-α含量測定 各組小鼠造模成功42 h 后，吸取鱟試劑檢測配套的血液抗凝劑于無熱源試管中，無菌操作下眼球取血，血液置于無熱源試管中，與抗凝劑混勻，至冰水中加蓋，低溫離心（離心半徑10 cm，3000 r/min 離心12 min），精密吸取上清液適量，用ET 檢查用水配制成2 倍稀釋液儲存備用。取2 倍稀釋液0.2 mL加入到0.8 mL 樣本處理液中，混勻，制成10 倍稀釋液備用。將10倍稀釋液于68 ℃恒溫水浴中加熱12 min，將加熱后的10倍稀釋液水浴冷卻后在常溫條件下離心半徑10 cm，3000 r/min離心12 min，取上清液檢測ET、NO和TNF-α，檢測步驟見顯色基質鱟試劑盒說明書。

1.6 統計學方法采用SPSS 21.0 統計軟件分析數據，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析，組間多重比較方差齊，采用SNK-q檢驗，方差不齊用Tanbane's T2 檢驗，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 ET 標準溶液配制與標準曲線的制作ET 標準曲線溶液及其標準曲線見表2、圖1。

圖1 ET標準曲線

表2 ET標準曲線溶液

2.2 血清ET 含量與空白對照組比較，生大承氣湯10 g/kg 劑量組血清ET 含量差異無統計學意義（P＞0.05），生大承氣湯6 g/kg劑量組與醋大承氣湯6、10 g/kg 劑量組、模型組和陽性對照組比較ET 含量差異具有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，生大承氣湯6、10 g/kg 劑量組、醋大承氣湯6、10 g/kg 劑量組血清ET含量差異具有統計學意義（P＜0.01），陽性對照組差異無統計學意義（P＞0.05）；與生大承氣湯10 g/kg劑量組比較，醋大承氣湯10 g/kg 劑量組和陽性對照組血清ET含量差異具有統計學意義（P＜0.01）；與陽性對照組比較，生大承氣湯6、10 g/kg 劑量組、醋大承氣湯10 g/kg 劑量組血清ET 含量差異具有統計學意義（P＜0.01），醋大承氣湯6 g/kg 劑量組血清ET含量差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠血清ET、NO及TNF-α含量比較（±s）

表3 各組小鼠血清ET、NO及TNF-α含量比較（±s）

注：與空白對照組比較，**表示P＜0.01；與模型組比較，●●表示P＜0.01；與生大承氣湯10 g/kg劑量組比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01；與陽性對照組比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01；-表示等體積蒸餾水

TNF-α（pg/mL）4.42±0.75**●●##3.92±0.68**●●##4.57±1.13**●●##4.38±0.99**●●##5.89±0.46**●●△△0.56±0.49●●△△##9.31±0.95**△△##組別生大承氣湯組鼠數15醋大承氣湯組陽性對照組空白對照組模型組15 15 15 15給藥劑量（g/kg）6 10 6 10 1.2--外周血ET（EU/mL）0.32±0.11**●●##0.16±0.08●●##0.39±0.09**●●△#0.32±0.08**●●△△##0.46±0.07**△△0.13±0.04●●△△##0.52±0.10**△△NO（μmol/L）186.21±16.84**●●##285.16±28.31**●●##160.98±16.29**●●△△##267.73±26.56**●●△△##204.12±10.62**●●△△44.06±8.74●●△△##75.08±7.15**△△##

2.3 NO含量與空白對照組比較，生大承氣湯6、10 g/kg 劑量組、醋大承氣湯6、10 g/kg 劑量組、模型組和陽性對照組血清NO 含量差異具有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，生大承氣湯6、10 g/kg 劑量組與醋大承氣湯6、10 g/kg 劑量組和陽性對照組血清NO 含量差異具有統計學意義（P＜0.01）；與生大承氣湯10 g/kg劑量組比較，醋大承氣湯6、10 g/kg 劑量組和陽性對照組血清NO 含量差異具有統計學意義（P＜0.01）；與陽性對照組比較，生大承氣湯6、10 g/kg 劑量組、醋大承氣湯6、10 g/kg 劑量組血清NO 含量差異具有統計學意義（P＜0.01）。見表3。

2.4 TNF-α 含量與空白對照組比較，生大承氣湯6、10 g/kg 劑量組、醋大承氣湯6、10 g/kg 劑量組、模型組和陽性對照組血清TNF-α含量差異具有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，生大承氣湯10 g/kg劑量組、醋大承氣湯6、10 g/kg 劑量組和陽性對照組血清TNF-α含量差異具有統計學意義（P＜0.01）；與生大承氣湯10 g/kg 劑量組比較，陽性對照組血清TNF-α含量差異具有統計學意義（P＜0.01）；醋大承氣湯6、10 g/kg 劑量組血清TNF-α含量差異無統計學意義（P＞0.05）；與陽性對照組比較，生大承氣湯6、10 g/kg 劑量組、醋大承氣湯6、10 g/kg 劑量組血清TNF-α含量差異具有統計學意義（P＜0.01）。見表3。

3 討論

相關研究表明，急性感染性疾病和急腹癥等多是ET 生物活性的體現，或由其誘導產生的細胞因子與其他炎癥介質所致。實熱便秘是陽明腑實證的一種，實熱便秘的致病因素之一即為ET［12］。TNF 的生成釋放是機體對各種外源性或內源性物質刺激的反應，ET 是TNF 釋放的物質，ET 和TNF 都會對機體產生損害，兩者結合能產生協同作用［12］。腫瘤壞死因子可通過內分泌作用進入血液循環，還可通過旁分泌形式對鄰近腸上皮細胞發生影響，從而對腸道屏障功能產生一定影響［13］。NO 具有生物學活性，廣泛分布于生物體內各組織中，它是一種新型生物信使分子，其在腸道內導致的多器官功能衰竭綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）發病過程中起關鍵作用［14］。相關研究［15］表明，NO 是炎癥介質網絡的最后共同途徑，是導致器官功能損害的重要介質，炎癥介質引起的全身性炎癥反應綜合征是MODS 發生的主要機制，在細菌ET 和炎癥細胞因子刺激下過度產生的NO 為敗血癥性休克病理發生過程中的關鍵中介機制［11］。

本研究表明，生、醋大黃的大承氣湯作用于實熱壅滯的ABP 小鼠，其血清NO 增加，ET、TNF-α降低，可能與生、醋大黃炮制品及其配伍的厚樸、枳實和芒硝有關，至于與什么成分變化或含量的增減作用有關，有待進一步研究。