電針對布比卡因中毒大鼠心肌損傷及線粒體功能的影響*

張斌森，張笑佳，秦曉宇，王春愛

1 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2 甘肅省中醫(yī)院麻醉科，甘肅 蘭州 730050

布比卡因（bupivacaine，BPV）是一種通過阻滯鈉離子沿軸突內(nèi)流發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的局部麻醉藥［1］，過量或誤入血管可引起嚴重的心臟功能衰竭，且常見抗心力衰竭藥物復(fù)蘇困難［2-3］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)電針內(nèi)關(guān)穴可以保持線粒體結(jié)構(gòu)的完整性，改善線粒體功能，降低活性氧（reactive oxygen species，ROS），有效緩解心肌毒性［4］，但降低ROS 的具體機制尚未明確。因此，本研究通過持續(xù)靜脈泵注射的鹽酸BPV 建立大鼠心肌損傷模型，探討電針內(nèi)關(guān)穴抗心肌損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物、分組與取材SPF 級8 周齡雄性SD 大鼠30 只，體質(zhì)量250～300 g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（甘）2020-0001，且經(jīng)甘肅省中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準（2021-200）。參照《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)意見》處理大鼠。用3%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠后將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺上，暴露大鼠左側(cè)股靜脈，置24 G 套管針用于給藥；連接電極監(jiān)測標準Ⅱ?qū)?lián)心電圖，監(jiān)測心電圖及心率（heart rate，HR）；暴露右側(cè)頸動脈，置24 G套管針用于監(jiān)測動脈血壓。

采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為3 組：對照組（A組，n=10），以0.9%生理鹽水3 mL（kg/min）靜脈滴注，30 min 后處死；布比卡因組（B 組，n=10），先靜脈滴注生理鹽水30 min，再滴注0.5%布比卡因2 mg/（kg·min）至心臟驟停；電針組（E 組，n=10），大鼠在電針刺激內(nèi)關(guān)穴30 min 后靜脈滴注5%布比卡因，同時于前肢內(nèi)側(cè)，距離腕關(guān)節(jié)約3mm 的橈尺骨縫間，采用0.25 mm×13 mm 毫針垂直角度刺入2～3 mm，所有針頭末端分別連接電針儀，2/100 Hz 疏密波，強度為1 mA，以穴位周圍肌肉出現(xiàn)輕微顫動為宜。

實驗結(jié)束后對大鼠實施安樂死，并行心臟灌注，取大鼠心肌組織待測。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 鹽酸布比卡因注射液（上海朝輝藥業(yè)有限責任公司，批號：1805J01）；BCA蛋白定量試劑盒（北京索萊寶公司，批號：PC0020）；三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）含量檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20181008）；GENMED 純化線粒體膜通道孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）光度法檢測試劑盒（批號：GES10095.3）、GENMED動物細胞/組織活性線粒體分離試劑盒（GENMED SCIENTIFICS INC，批號：GES10006.2）；Fluo-3/AM、膠原酶、二氫乙啶（dihydroethidium，DHE）染料（均購自YESEN，貨號：40703ES50、40507ES60、0102ES02）。

1.2.2 主要儀器 ZZB-1/Ⅱ型微量注射泵（江蘇愛朋醫(yī)療科技有限公司）；SDZ-Ⅱ型電子針療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；iMEC8 Vet 型獸用便捷式多參數(shù)監(jiān)護儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子公司）；AE610型數(shù)字心電圖機（博士醫(yī)藥科技有限公司）；DW-HL528 型高速冷凍離心機（德國Eppendorf）；SK-O180-E型超低溫冰箱（中科美菱低溫科技公司）；iMark型酶標儀（美國Bio Rad公司）；DNP-9022型恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏設(shè)備公司）；LDZX-50KBS 型滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；JD-DB 型Langendorff離體心臟灌流系統(tǒng)（上海繼德）。

1.3 觀察指標及檢測方法

1.3.1 一般情況 麻醉前稱量每只大鼠體質(zhì)量，麻醉約10 min 后大鼠心率/血壓平穩(wěn)，記錄此時大鼠各項血流動力學(xué)指標數(shù)值（血流動力學(xué)基礎(chǔ)值），注射BPV前采集動脈血樣0.3 mL進行血氣分析。記錄各組大鼠發(fā)生心臟驟停所需時間。

1.3.2 心肌細胞線粒體提取 取大鼠心肌組織置于預(yù)冷的勻漿介質(zhì)（160 mmol/L KCI，10 mmol/L EDTA，0.5%牛血清白蛋白，pH7.4）中迅速剪碎，組織勻漿機制成10%的勻漿，4 ℃條件離心半徑10 cm，2000 r/min離心10 min，取上清液于4 ℃，離心半徑10 cm，8500 r/min離心10 min；沉淀用重懸液（320 mmol/L 蔗糖，l0 mmol/L，Tris-HCI，pH 7.4）重懸后，于4 ℃，離心半徑10 cm，8500 r/min離心10 min，沉淀物即為心肌細胞線粒體。

1.3.3 ATP 含量檢測 于-80 ℃冰箱中取出心肌組織，稱取100 mg 組織，用眼科剪剪碎后放入2 mL 離心管中裂解，4 ℃下離心半徑10 cm，12000 r/min離心5 min取上清，按照磷鉬酸比色法ATP試劑盒說明書操作。

1.3.4 ROS 水平檢測 應(yīng)用DHE 染色法將大鼠離體心臟于Langendorff 灌流裝置系統(tǒng)缺血前平衡20 min，將心肌組織剪成小塊，置于組織包埋塊中，液氮冷凍后切成厚度為10 μm的心肌切片，于37 ℃條件下，在1.6 μm/L DHE的PBS中避光孵育30 min，置于激光共聚焦顯微鏡（激發(fā)波長480～535 nm，放射波長590～610 nm）下拍照觀察。運用Image pro-Plus 6.0 采集其IOD 值和熒光面積，計算MOD值代表的ROS濃度。

1.3.5 細胞內(nèi)Ca2+水平檢測 將分離的心肌細胞從KB液中換到有鈣Tyrode液中穩(wěn)定1 h，離心半徑10 cm，500 r/min 離心2 min 棄上清液，37 ℃避光條件下用Fluo-3/AM（終濃度為5 μmol/L）負載1 h 后，離心半徑10 cm，500 r/min 離心1 min去除負載液，用有鈣Tyrode液洗滌細胞2次，除去殘余負載液。將DHE 負載的大鼠心室肌細胞培養(yǎng)皿置于ACAS 570載物臺上，常溫下測定所選細胞內(nèi)鈣值，置于激光共聚焦顯微鏡下（激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長526 nm，采樣頻率為488 Hz），連續(xù)動態(tài)掃描細胞內(nèi)熒光強度變化，以平均熒光強度變化反映游離Ca2+水平。運用Image pro-Plus 6.0 采集其IOD 值和熒光面積，并計算MOD 值代表的Ca2+濃度。

1.3.6 MPTP活性測定 線粒體以腫脹液（120 mmol/L KCI，20 mmol/L M0pS，10 mmol/L Tris-Hcl，5 mmol/L KH2PO4，pH 7.4）稀釋至0.25 g/L蛋白質(zhì)，于25 ℃，200 μmol/L 的CaC12作用于線粒體，在540 nm 波長下連續(xù)觀察線粒體吸光度（A540）變化15 min，30個循環(huán)。該吸光度變化可反映線粒體腫脹程度、MPTP的開放情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 26.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以xˉ±s 表示，采用單因素方差分析，方差齊時組間多重比較采用LSD-t檢驗，方差不齊時，組間多重比較采用Tamhae's T2法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況與A 組相比，其余各組大鼠體質(zhì)量、PO2、PCO2、pH、HR、MAP 差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。E 組內(nèi)關(guān)穴電針刺激后大鼠發(fā)生心臟驟停時間延長（P＜0.05）。見表1—2。

表1 各組大鼠血流動力學(xué)基礎(chǔ)值（xˉ±s）

表2 各組大鼠發(fā)生心臟驟停時間比較（xˉ±s）

2.2 大鼠心肌組織線粒體濃度與ATP含量與A組相比，B組大鼠ATP含量與心肌組織線粒體濃度降低（P＜0.05）；與B 組相比，E 組ATP 含量與心肌組織線粒體濃度升高（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠心肌組織線粒體濃度與ATP含量（xˉ±s）

2.3 大鼠心肌ROS 相對含量與A 組相比，B 組心肌ROS 相對含量升高（P＜0.05）；與B 組相比，E組ROS相對含量降低（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠心肌ROS相對含量（xˉ±s）

2.4 大鼠心肌線粒體Ca2+濃度與MPTP與A組相比，B組心肌線粒體Ca2+熒光強度及MPTP開放程度降低（P＜0.05）；與B組相比，E組心肌線粒體Ca2+熒光強度及MPTP開放程度升高（P＜0.05）。見表5。

表5 各組大鼠心肌線粒體Ca2+濃度與MPTP比較（xˉ±s）

3 討論

本研究結(jié)果顯示，BPV 可降低心肌組織線粒體濃度，減少ATP合成及ROS蓄積，使線粒體腫脹，導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生改變，產(chǎn)生心肌毒性。而電針內(nèi)關(guān)穴可有效延長大鼠發(fā)生心臟驟停的時間，提高線粒體濃度、ATP 含量，降低ROS，改善心肌損傷。

線粒體是細胞進行有氧呼吸的主要場所，氧化磷酸化和電子傳遞發(fā)生障礙，導(dǎo)致ATP 合成減少，膜電位降低，損傷線粒體結(jié)構(gòu)和功能［5］。布比卡因可通過抑制心室肌細胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流［6］，抑制Ca2+ATP 酶活性，加劇線粒體內(nèi)Ca2+降低［7］，抑制蛋白酶及鈣依賴性磷脂酶活性，破壞生物膜結(jié)構(gòu)，使心肌收縮抑制、線粒體超微結(jié)構(gòu)破壞及功能障礙［8-9］。線粒體是ROS的主要來源場所，釋放的ROS可觸發(fā)鄰近線粒體進一步釋放ROS 形成惡性循環(huán)，ROS 異常增加會導(dǎo)致線粒體通透性改變，MPTP開放異常［10］。MPTP 是由線粒體內(nèi)膜構(gòu)成的鈣離子依賴性非特異性通道，Ca2+超載使MPTP 過度開放，線粒體膜去極化與氧化磷酸化，致ATP 缺失，最終引起細胞凋亡［11］。本研究結(jié)果顯示，BPV 中毒使線粒體內(nèi)Ca2+濃度降低，MPTP 關(guān)閉，大量ROS蓄積；電針內(nèi)關(guān)穴可有效提高線粒體內(nèi)Ca2+濃度，使MPTP 開放，使多種離子和蛋白分子自由進出線粒體，維持線粒體結(jié)構(gòu)，改善線粒體功能，抑制ROS過度釋放，緩解線粒體損傷，保護心肌細胞。

內(nèi)關(guān)穴是手厥陰心包經(jīng)之絡(luò)穴，屬八脈交會穴之一，善治心胸諸疾［12］。在電針不同穴位對心肌缺血的治療中，“內(nèi)關(guān)穴”具有特異性效應(yīng)［13］。電針大鼠“內(nèi)關(guān)穴”能夠有效緩解急性心肌缺血對心肌組織及線粒體結(jié)構(gòu)的損傷［14］。電針內(nèi)關(guān)穴可改善線粒體呼吸功能、抑制炎性反應(yīng)、抑制鈣超載及細胞凋亡［15-16］，從而發(fā)揮心肌缺血再灌注免受損傷的作用；經(jīng)皮穴位電刺激內(nèi)關(guān)穴用于全身麻醉胸腔鏡手術(shù)，可減輕機體應(yīng)激反應(yīng)，減少阿片類藥物用量，促進術(shù)后康復(fù)［17］。

綜上所述，電針內(nèi)關(guān)穴能有效改善BPV 對線粒體功能的抑制作用，通過調(diào)節(jié)心肌線粒體Ca2+濃度使MPTP 開放，從而發(fā)揮對BPV 心肌損傷的保護作用。