基于網絡藥理學和分子對接技術探討蒼膝通痹膠囊治療骨關節炎的作用機制

張正則，馬吉智，孫 然，孟 凱

1 山東中醫藥大學，山東 濟南 250000； 2 山東中醫藥大學附屬醫院創傷骨科，山東 濟南 250000

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是以關節軟骨退行性病變和繼發性骨質增生為特征的慢性關節疾病，其臨床表現主要為關節僵硬、疼痛、無力、畸形、腫脹等［1］。OA是常見的慢性關節疾病，近年來發病率持續升高，已成為影響人類生活質量的重要問題［2］。OA與年齡密切相關，全球約2.4億人患病，且在過去數十年中其發病率總體呈增長態勢［3］。

OA 屬中醫“痹證”“骨痹”等范疇，其病機是以肝腎虧虛為本，風寒濕邪痹阻經絡為標，形成本虛標實，虛實夾雜的證候［4］。中醫治療OA 以補益肝腎、舒筋活絡、溫補腎陽、祛風除濕為主，具有獨特的優勢。山東中醫藥大學附屬醫院院內制劑蒼膝通痹膠囊（原名關節止痛膠囊，魯藥制字Z20130043），主要由獨活、威靈仙、蒼術、萆薢、雞血藤、桑寄生、川牛膝、骨碎補、續斷9 味藥物組成。蒼膝通痹膠囊在治療OA，特別是在保護關節軟骨方面具有一定療效［5-6］。但蒼膝通痹膠囊中成分多，涉及靶點通路復雜，其藥理機制尚不明確。

網絡藥理學具有系統性、整體性特點，注重藥物間的相互作用，這與中醫學整體觀、辨證論治觀念不謀而合［7］。本研究運用網絡藥理學方法篩選蒼膝通痹膠囊的活性成分及作用靶點，并進行網絡分析，構建藥物-活性成分-疾病靶點網絡，通過數據庫進行信號通路分析，進一步預測其治療OA的作用機制。

1 研究方法

1.1 數據庫、軟件及分析平臺生物信息學和數據挖掘技術使用數據庫、軟件及分析平臺，見表1。

表1 數據庫、軟件及分析平臺

1.2 蒼膝通痹膠囊活性成分及其作用靶點篩選運用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）獲取蒼膝通痹膠囊中各中藥的活性成分，依據中藥成分ADME 信息（吸收、分布、代謝及排泄）篩選有效活性成分，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30% 和 類 藥 性（drug-likeness，DL）≥0.18［8］。通過TCMSP 數據庫查詢活性成分對應的靶點蛋白，利用Unitprot 數據庫，選擇物種為“人類”（Homo sapiens），剔除重復、非人源與不規范靶點，將靶點蛋白名轉換為靶點基因名。

1.3 蒼膝通痹膠囊治療OA 的靶點預測利用Drugbank、GeneCards、TTD 及CTD 數據庫，以“osteoarthritis”為關鍵詞，檢索OA 的相關治療靶點，將所有篩選結果合并去重后得到OA 的相關靶點信息。使用Unitprot 進行基因名標準化。運用Venny 平臺將蒼膝通痹膠囊的活性成分調控靶點與OA 治療靶點取交集，得到蒼膝通痹膠囊治療OA的靶點。

1.4 中藥-成分-靶點-疾病網絡構建運用Cytoscape 3.7.2 軟件中Network Analyzer 插件進行拓撲學分析，計算節點度值（degree）、介度中心性（betweenness centrality，BC）和緊密中心性（closeness centrality，CC），設置閾值為BC值中位數和CC值中位數，按degree值大小排序篩選滿足上述參數的活性成分作為蒼膝通痹膠囊治療OA的關鍵活性成分。

1.5 蛋白質相互作用關系構建將蒼膝通痹膠囊治療OA的潛在作用靶點導入STRING數據庫，設置物種為“Homo sapines”，靶點蛋白置信度＞0.4，獲得蛋白-蛋白互作網絡（protein-protein interactions，PPI）。在Cytoscape 3.7.2 軟件中構建靶點蛋白PPI 網絡。使用Cytoscape 3.7.2中的CytoHubba 工具進行拓撲分析，篩選出關鍵靶點，作為蒼膝通痹膠囊治療OA的核心靶點。

1.6 GO富集分析與KEGG富集分析將交集靶點導入DAVID 數據庫。運用DAVID 數據庫進行基因本體論（gene ontology，GO）富集分析，包括生物過程（biological process，BP）、細胞組分（cellular component，CC）、分 子 功 能（molecular function，MF）；京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析。設置閾值P＜0.05，排除非特異性GO 功能以及KEGG 通路，按P值大小以及核心靶點篩選與OA 關聯度較大的條目，將分析結果可視化。應用Cytoscape 3.7.2 軟件構建活性成分-靶點-通路網絡。

1.7 分子對接按照Degree 值排序篩選出排名前5的活性成分，將其與PPI網絡篩選出的核心靶點進行分子對接驗證。從RCSBPDB 數據庫獲取靶點的晶體結構文件，從Pubchem 數據庫獲取活性成分的結構文件，利用AutoDock vina 軟件計算靶點與活性成分之間的最低結合能并將分子對接驗證結果可視化。

2 結果

2.1 活性成分及潛在作用靶點通過TCMSP 數據庫，共篩選得到86個活性成分，包括獨活11個，骨碎補18 個，桑寄生2 個，威靈仙8 個，萆薢2 個，雞血藤24個，蒼術9個，續斷8個，川牛膝4個。其中威靈仙、獨活、雞血藤、川牛膝、骨碎補、續斷交集活性成分1 個，威靈仙、雞血藤、骨碎補交集活性成分1個，雞血藤、骨碎補交集活性成分2個，川牛膝、桑寄生交集活性成分1 個，桑寄生、續斷交集活性成分1 個。刪除重復數據后剩余活性成分75 個，由于篩選結果過多，僅列出共有活性成分及每味藥OB值前5的活性成分。見表2。

表2 蒼膝通痹膠囊活性成分信息

通過TCMSP數據庫對75個活性成分進行進一步預測，初步獲得個1187 靶點，將相同靶點歸一，結合Uniprot數據庫確認并轉換，最終得到140個蒼膝通痹膠囊藥效靶點。

2.2 蒼膝通痹膠囊治療OA靶點預測共得到OA相關靶點469 個。運用Venny 平臺將蒼膝通痹膠囊藥效靶點與OA的治療靶點取交集，得到52個蒼膝通痹膠囊治療OA的靶點。見圖1。

圖1 活性成分靶點與疾病靶點Venn圖

2.3 藥物-成分-靶點-疾病網絡構建及拓撲分析利用Cytoscape 3.7.2 構建蒼膝通痹膠囊的藥物-成分-靶點-疾病網絡。以不同顏色或形狀表示，粉色圓形節點代表藥物，藍色六邊形節點代表疾病，綠色三角形節點代表成分，紫色圓形節點代表靶點。該網絡共含有122個節點和639條邊，涉及60 種活性成分和52 個潛在靶點。其同一成分對應多個靶點和多個成分對應同一靶點的關系，體現了蒼膝通痹膠囊多成分、多靶點治療OA的作用特點。見圖2。

圖2 藥物-成分-靶點-疾病網絡圖

根據網絡拓撲值進行關鍵活性成分確定，Network Analyzer 計算結果顯示degree 中位數倍 值 為6，BC 中 位 數 為0.0145，CC 中 位 數 為0.411569，篩選同時符合BC中位數以上及CC中位數以上的靶點，按Degree 值排序選取前5 名作為蒼膝通痹膠囊治療OA的關鍵活性成分。見表3。

表3 關鍵活性成分信息

2.4 PPl 網絡構建及拓撲分析將獲得的52 個交集靶點上傳STRING 數據庫，構建PPI 網絡。圖中節點表示蛋白，邊表示功能相關性，共涉及52個節點，509 條邊，平均節點數為19.6，平均局部聚類系數為0.679。見圖3。

圖3 PPI網絡

使用CytoHubba 工具進行拓撲分析，篩選出10 個關鍵蛋白基因，分別是IL-1B、IL-6、VEGFA、MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAPK14、JUN、CCL2、PTGS2。這10 個蛋白基因在整個網絡中起關鍵作用，這些基因對應的靶點可能是蒼膝通痹膠囊治療OA 的關鍵靶點。見圖4。

圖4 PPI網絡關鍵節點

2.5 GO 和KEGG 富集結果GO 分析共得到190 個生物進程、32個細胞組分、39個分子功能；KEGG分析得到78 條信號通路。排除非特異性條目，按P值排序以及核心靶點篩選與OA 關聯度較大的條目，繪制氣泡圖。Y 軸代表名稱，X 軸代表所占百分比，氣泡面積代表富集基因數。其中，生物過程主要是氧化還原過程、衰老、轉錄的正調控、骨化調節、凋亡、對機械刺激的反應、細胞增殖的正調控等。細胞組分主要是細胞質、線粒體、高爾基體、細胞外區域、胞質溶膠、外泌體等。分子功能主要是蛋白結合、酶結合、受體結合、轉錄調節區DNA 結合、細胞因子活性、轉錄因子結合、類固醇激素受體活性、類固醇結合、蛋白質同源二聚活性等。KEGG 富集通路分別是MAPK 信號通路、PI3KAkt信號通路、TNF信號通路、HIF-1信號通路、NOD樣受體信號通路、FoxO 信號通路、NF-κB 信號通路等。富集結果表明，蒼膝通痹膠囊可能通過上述功能及信號通路發揮治療作用。根據PPI 篩選得到的10 個關鍵靶點與KEGG 通路的關系，利用Cytoscape 3.7.2 軟件，構建中藥-成分-靶點-通路網絡。見圖5—6。

圖5 GO和KEGG富集分析氣泡圖

圖6 藥物-成分-靶點-通路網絡

2.6 分子對接驗證結果按照Degree 值排序篩選出排名前5 的活性成分為槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、柚皮素。將其與核心靶點IL-1β、IL-6、VEGFA、MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAPK14、JUN、CCL2、PTGS2 進行分子對接驗證，靶點信息見表4。利用Auto vina軟件計算靶點與活性成分之間的最低結合能，分值≤-5 表示具有潛在活性，分值≤-7表示具有較強穩定性，并將分子對接驗證結果可視化。結果表明主要活性成分和核心靶點在分子對接過程中均進入了活性位點，這表示兩者具有較強的結合能力。見圖7—8。

圖7 分子對接熱圖

圖8 分子對接圖

表4 靶點蛋白信息

3 討論

本研究運用網絡藥理學方法探究蒼膝通痹膠囊治療OA的作用機制。得到有效活性成分60個、作用靶點140 個、OA 疾病靶點469 個，蒼膝通痹膠囊與OA 的交集靶點52 個。分子對接結果顯示蒼膝通痹膠囊的活性成分與OA 的核心靶點具有較好的結合活性，這表示活性成分可能作用于上述靶點從而影響OA的發展變化。

藥物-成分-靶點-疾病網絡結果顯示，蒼膝通痹膠囊的核心活性成分包括槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、豆甾醇等。豆甾醇是一種能夠與軟骨細胞膜結合的植物甾醇，具有潛在抗炎和抗分解代謝特性。GABAY等［9］研究發現，豆甾醇可發揮抑制多種基質降解和炎癥介質的功能，減少OA 導致的軟骨退變，并且可以通過抑制白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）表達，靶向作用于對OA重要的核轉錄因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路?；|金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）在OA 發展過程中發揮關鍵作用，可造成關節畸形、降解細胞外基質、加速關節軟骨破壞。CHEN等［10］發現豆甾醇能抑制MMPs表達，延緩關節軟骨降解，延緩OA 病程發展。LEYVA 等［11］研究顯示槲皮素能減少IL-1β、IL-6、TNF-α等的表達，下調MMP-13 表達。并且可上調超氧化物歧化酶表達，以清除炎癥部位所產生的自由基［12］，從而保護關節軟骨，延緩OA 發病進程。曾麗萍等［13］研究顯示，β-谷甾醇可增高成骨細胞護骨素和破骨細胞分化因子的比值，增加雌二醇分泌，上調成骨作用并下調破骨作用，從而調節骨代謝平衡。LIAO 等［14］發現，β-谷甾醇可通過抑制炎癥小體激活以抑制MAPK 信號通路活化，減少IL-1β、IL-6、TNF-α的生成，起抗炎作用。木犀草素具有良好的抗炎抗氧化作用，可保護軟骨細胞，從而延緩關節軟骨變性。FEI等［15］發現木犀草素可降低IL-1β誘導的前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、TNF-α、環氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、MMPs 產生，逆轉由IL-1β誘導的Ⅱ型膠原蛋白降解。在體外木犀草素還可下調IL-1β誘導的NF-κB 磷酸化，預防OA 大鼠體內軟骨破壞并增強膠原蛋白Ⅱ表達。

PPI 結果表明，核心靶點有IL-6、IL-1β、JUN、MAPK1、MAPK14、VEGFA 等。這些靶點在蒼膝通痹膠囊治療OA 的進程中可能起重要作用。JIKKO等［16］發現IL-1β和IL-6在介導軟骨降解或膠原降解方面有協同作用。JENEL 等［17］發現IL-1β可通過影響軟骨、滑膜、軟骨基質來干預OA 發病進程。IL-1β可影響軟骨細胞中IL-6、TNF-α、PGE2、NO、COX-2 等炎癥介質或iNOS 的分解代謝過程，并激活滑膜成纖維細胞和免疫細胞來促進滑膜炎癥，使軟骨組織降解永久化［18］。IL-6 可誘導MMP-3、MMP-13 和ADAMTS 表達，介導軟骨退變［19］。還可抑制成骨細胞活性，同時增加破骨細胞活性，導致骨質流失［20］。研究顯示VEGFA 可調節成骨細胞和破骨細胞分化和增殖［21］，增強軟骨細胞MMP-9 和MMP-13表達，從而導致軟骨退變、滑膜肥大、血管侵入軟骨和加速骨溶解、軟骨下囊腫和骨贅形成［22］。同時VEGFA 的表達可通過促進病理性血管生成，導致感覺神經順著軟骨、骨贅、滑膜和半月板中新生成的血管向內生長，導致發生疼痛［23］。JUN 可激活對OA 至關重要的FoxO、MAPK 和PI3K-Akt 信號通路［24-25］，通過調節軟骨細胞合成代謝和分解代謝基因表達，對OA 軟骨破壞起作用［26］。雌激素可通過抑制破骨細胞分化，促進腸道鈣吸收來調節骨骼系統，對于關節軟骨有潛在保護作用，從而對OA 的病程產生影響［27］。李健等［28］研究顯示雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）可刺激轉化生長因子α（transforming growth factor alpha，TGF-α）和胰島素樣生長因子1（insulinlike growth factor-1，IGF-1）以促進軟骨細胞增殖，抑制IL-1、IL-6、TNF-α 等促炎性細胞因子以保護軟骨組織，同時ESR1 還可調控IL-1β誘導的軟骨細胞中MMPs 表達。MAPK1 和MAPK14 參與調控MAPK 通路、細胞增殖、凋亡和炎癥［29］，對損傷有重要影響，在軟骨細胞中的高表達與OA 相關性較高［30］。

KEGG 富集分析結果顯示核心通路有MAPK 信號通路、PI3K-Akt通路、TNF通路、HIF-1通路、NOD樣受體通路、FoxO 通路、NF-κB 通路等。提示蒼膝通痹膠囊可能通過以上途徑對OA 進行調控。PI3K-Akt 通路是經典的抗凋亡通路，在細胞代謝、增殖、凋亡、轉錄以及蛋白質合成等過程中發揮作用。PI3K-AkT 通路與IL-1β誘導的炎癥反應密切相關。PI3K 和AkT 選擇性抑制劑還可降低MMPs 表達［31］。PI3K-AkT 通路會影響下游凋亡相關蛋白活性，從而介導細胞分化、增殖、凋亡，是調節OA 軟骨細胞凋亡的重要通路［32］。MAPK 通路與PI3K-Akt 通路同為破骨細胞分化通路［33］，可調控軟骨細胞凋亡及骨破壞等進程［34］。激該通路活可增強MMPs 和ADAMTS 表達，導致軟骨基質丟失［35］。ZHANG 等［36］研究顯示PI3K-Akt 通路和MAPK 通路均能增加促凋亡因子Casp-3、Casp-8 和抑制抗凋亡因子Bcl-2 表達以促進軟骨細胞凋亡，從而影響OA。NF-κB 信號通路是誘導破骨細胞分化的重要信號通路，通過激活破骨細胞和促進破骨前體細胞成熟以調控關節軟骨退變［37］。JI 等［38］研究顯示NF-κB信號通路單獨作用或與BMP、Wnt等通路聯合作用，可抑制軟骨細胞合成代謝，觸發MMPs、ADAMTS、PEG2、iNOS、COX-2 等的表達，導致關節軟骨侵蝕，加快OA的發生和軟骨細胞凋亡。LEPETSOS等［39］發現在肥大的軟骨細胞中，NF-κB 信號通路可 誘 導BMP2、CXCL8 和GADD45-β產 生，它 們 與ELF3 和HIF-2α通路一起促進MMPs、VEGF 和骨鈣素肥大標志物產生，導致軟骨細胞鈣化和骨贅形成。ESR 通路可通過調控雌激素促使成骨細胞表達骨保護素，以促進骨膜形成，減少破骨細胞數量［40］，干擾NF-κB 因子和配體結合，調控MMPs 表達［41］，實現抑制骨吸收。王健等［42］發現NF-κB 信號通路還可對炎癥因子、細胞因子、生長因子產生抑制作用，從而保護關節軟骨。FOXO 是MAPK 和PI3K-Akt 通路下游的轉錄因子，可保護軟骨細胞功能，調節軟骨細胞生長成熟和基質合成［43］。FOXO通路可通過上調FOXO轉錄因子，抑制軟骨細胞的氧化應激速率［44-45］，調控OA病理過程。

綜上所述，蒼膝通痹膠囊調控OA 靶點存在復雜的相互作用關系，蒼膝通痹膠囊可通過多成分、多靶點、多通路調控OA 的病理進程。在促進血管生成、調節軟骨細胞增殖、干預炎癥進程等方面發揮作用。

網絡藥理學作為一種新興的研究方法，可為中藥的臨床應用提供了方向。但仍存在局限性，在后續研究中，可通過質譜、液相色譜等方法鑒別蒼膝通痹膠囊的有效成分，并對本研究篩選出的靶點和通路進行驗證。