基于網絡藥理學的復方血栓通膠囊治療視網膜靜脈阻塞機制研究*

陳雁君，劉求紅，劉 紅

1 廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東 廣州 510405；2 廣州中醫藥大學第一附屬醫院眼科，廣東 廣州 510405

視網膜靜脈阻塞（retinal vein occlusion，RVO）是一種視網膜循環靜脈回流受損的血管性疾病，其特征是視網膜靜脈充盈和擴張，繼發性視網膜出血、水腫和缺血，包括棉花斑、視網膜滲出和黃斑水腫［1］，是視網膜血管性失明的第二大誘因［2］。根據梗阻部位，可分為視網膜分支靜脈阻塞（branch retinal vein occlusion，BRVO）、視網膜中央靜脈阻塞（central retinal vein occlusion，CRVO），其中以BRVO 最常見。據估計［3］，世界范圍內BRVO的患病率為0.4%，CRVO 約為0.08%。RVO的發病機制尚未明確，可能是由于靜脈受壓產生Virchow's三聯征（瘀血、血管壁損傷和高凝），從而誘導靜脈血栓形成導致血流部分阻塞［4］，其主要危險因素包括高血壓、動脈硬化、糖尿病、高膽固醇。目前RVO治療主要集中在減輕RVO并發癥，通過玻璃體腔注射類固醇類藥物或抗血管內皮生長因子（vascular endothelial growthfactor，VEGF）來減少黃斑水腫、抑制新血管形成，但玻璃體腔注藥存在療效短、藥物不良反應多、病情容易復發等問題，長期治療仍具有挑戰性。近年來，中醫藥因其臨床療效而逐漸受到人們的關注，成為一種重要的輔助療法。

RVO 在中醫學中稱為“絡損暴盲”，其基本病機為脈道阻滯，血溢脈外，其中“血瘀”是根本，治療應“從瘀論治”，“活血化瘀”貫穿其中。復方血栓通膠囊是由三七、黃芪、丹參、玄參組成的中成藥制劑，其中三七化瘀止血、丹參活血通經、玄參滋陰涼血、黃芪益氣養血，4 藥合用，活血祛瘀生新且不傷正氣，共奏活血化瘀、益氣養陰功效。臨床研究表明復方血栓通膠囊能改善凝血及內皮細胞功能、抗血小板聚集，從而起減輕血液高凝狀態、抗血栓形成，改善微循環的作用，此外還可提高組織耐缺氧及抗氧化能力，對缺血再灌注損傷組織具有一定保護作用［5-8］。

網絡藥理學是從分子水平探討藥物-成分-靶點-疾病之間的關系，可預測藥物治療疾病的潛在靶點，為中醫藥防治疾病提供理論依據［9］。因此，本研究采用該方法從分子水平探究復方血栓通膠囊治療RVO 的潛在作用機制，為復方血栓通膠囊治療RVO提供理論依據。

1 研究方法

1.1 復方血栓通膠囊的有效成分及其相關靶點收集通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）分別以“三七”“黃芪”“丹參”“玄參”為關鍵詞，根據藥代動力學參數以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和藥物類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 為限定條件篩選獲得復方血栓通膠囊的有效成分及其作用靶點。然后通過UniProt 數據庫平臺（https：//www.uniprot.org），限定物種為“Homo sapiens”，獲取有效成分對應作用靶點的基因名。

1.2 RVO 疾病相關靶點收集以“retinal vein occlusion”“retinal vein obstruction”為關鍵詞分別在Gene Cards 數據庫平臺（https：//www.genecards.org）、在線孟德爾人類遺傳數據庫（online mendelian inheritance in man，OMIM）（https：//www.omim.org/）及DrugBank 數據庫平臺（https：//go.drugbank.com）進行檢索，去除重復靶點后獲得與RVO相關的靶點基因。

1.3 藥物-成分-靶點-疾病網絡構建利用R4.0.3軟件運行R語言對疾病與藥物的相關作用靶點取交集，并繪制Venn 圖，然后利用Cytoscape 3.7.2軟件制作出疾病-藥物-成分-靶點網絡圖。

1.4 蛋白-蛋白互作網絡(protein-protein interactions，PPl)構建將獲取的藥物-疾病交集的作用靶點導入String 11.0 數據庫（https：//stringdb.org），限定物種為“Homo sapiens”，最低置信度設置為≥0.700，得到交集的作用靶點之間的蛋白互作網絡信息，并通過R語言分析PPI網絡，從而獲得重要靶點信息。

1.5 復方血栓通膠囊治療RVO 作用靶點富集分析利用Metascape 平臺（https：//metascape.org/）進行藥物-疾病靶點的基因本體論功能（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，然后根據P＜0.05 分別選取排名前10的3種GO富集分析結果和排名前15 的KEGG 通路富集分析結果，借助微生信平臺（http：//www.bioinformatics.com.cn/）分別繪制柱狀圖。

2 結果

2.1 復方血栓通膠囊有效成分、靶點信息通過TCMSP 平臺篩選得到復方血栓通膠囊有效成分119個，其中三七9個、黃芪20個、丹參66個、玄參24 個，去除重復及無相應靶點信息后獲得102 個有效成分，藥物有效靶點202個。見表1。

表1 復方血栓通膠囊有效成分基本信息

2.2 RVO靶點信息RVO靶點信息通過GeneCards數據庫獲得1384個，OMIM數據庫獲得153個，DrugBank數據庫32個，合并且去除重復后共得到1538個。

2.3 藥物-成分-靶點-疾病網絡將藥物有效靶點202 個和RVO 有效靶點1538 個，運用R4.0.3 軟件運行R 語言得到藥物-疾病交集靶點115 個，并繪制出Venn圖。見圖1。

圖1 藥物有效成分靶點和疾病靶點Venn圖

將上述所得復方血栓通膠囊有效成分與藥物-疾病交集靶點信息導入Cytoscape 3.7.2 軟件繪制藥物-成分-靶點-疾病網絡，網絡包含200個節點（1種疾病名，4個中藥名，80種有效中藥活性成分，115 個靶點）和893 條邊。其中有效成分按Degree 值從高到低排序前10 名分別是A2（槲皮素，quercetin）、DS7（木犀草素，luteolin）、HQ13（山柰酚，kaempferol）、A3（黃芩素，baicalein）、DS54（β-谷甾醇，beta-Sitosterol）、HQ11（β-胡蘿卜素，beta-carotene）、DS28（隱丹參酮，cryptotanshinone）、HQ7（甲基異微凸劍葉莎醇，7-Omethylisomucronulatol）、HQ5（異鼠李素，isorhamnetin）、DS32（二氫丹參內酯，dihydrotanshinlactone），說明這10 種有效成分可能是復方血栓通膠囊治療RVO的關鍵成分。見圖2、表2。

圖2 藥物-成分-靶點-疾病網絡

表2 復方血栓通膠囊中20個關鍵活性成分

2.4 PPl 網絡將115 個藥物-疾病交集靶點導入String 11.0數據庫，利用Cytoscape 3.7.2軟件構建PPI 網絡。通過R 語言分析PPI 網絡中各靶點的連接節點數從而獲得核心靶點信息，其中排名前10 的分別是Akt1（64）、TP53（63）、MAPK1（54）、MAPK8（54）、TNF（54）、IL-6（53）、VEGFA（52）、JUN（50）、STAT3（48）、EGF（46），說明10個靶點基因在復方血栓通膠囊治療RVO中可能起重要作用。見圖3。

圖3 復方血栓通膠囊-RVO交集靶點PPI網絡

2.5 GO 和KEGG 富集分析共得到2362 個GO 富集條目，其中涉及2142 個生物過程，包括凋亡信號通路、對無機物的反應、對脂多糖的反應、對活性氧的反應，細胞成分運動的正調控、細胞遷移的正向調節、對脂質的反應等；涉及146 個分子功能，包括轉錄因子結合、激酶結合、細胞因子受體結合、核受體的活性、轉錄因子活性等；涉及74 個細胞成分，包括膜筏、小凹、轉錄因子復合物、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子復合體、核轉錄因子復合體等。KEGG富集得到171個條目，涉及癌癥相關通路、糖尿病并發癥相關AGE-RAGE、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、IL-17、TNF、PI3K-Akt、MAPK 等信號通路。依據P值排名前20 的GO 富集分析和排名前20 的KEGG富集分析分別繪制成柱狀圖。見圖4—5。

圖4 GO富集分析結果

3 討論

在RVO 的發生發展過程中，由于缺血缺氧可刺激炎癥因子和新生血管生成從而出現黃斑水腫等并發癥。本研究通過篩選得出槲皮素、木犀草素、山柰酚、黃芩素、β-谷甾醇可能是復方血栓通膠囊治療RVO 的關鍵性成分，具有抗炎、抗細胞凋亡、抗血管生成等生物活性。研究表明槲皮素可通過降低白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-18、IL-6、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）等炎癥因子的過表達來抑制炎癥反應，影響TLR4/核轉錄因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、MAPK、PI3K-Akt 等通路來減少氧化應激，并通過調控B淋巴細胞瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Caspase、Bax 等蛋白的表達從而抗細胞凋亡，具有改善缺血再灌注損傷能力［10］。木犀草素具有舒張血管作用，并可通過增加一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）mRNA 表達來保護內皮細胞免受氧化應激損害［11］，此外還可抑制血管生成和與VEGF對接作用，靶向腫瘤信號通路，并具有一定抗癌作用［12］。山柰酚可通過調控NF-κB 及核轉錄因子2（nuclear transcription factor 2，Nrf2）/血紅素氧化酶1（heme oxidase-1，HO-1）通路來抑制炎癥和氧化應激，減輕百草枯誘導的血管損傷，說明其具有保護血管免受氧化損傷作用［13］。黃芩素可通過抑制AP-1轉錄活性從而抑制c-Jun、c-Fos表達，影響異二聚體形成和DNA結合親和力，抑制THP-1CM 誘導的人臍靜脈內皮細胞遷移和侵襲，從而在炎性微環境中發揮抗血管生成作用［14］。

通過疾病PPI網絡分析得出，Akt1、TP53、MAPK1、MAPK8、TNF、IL-6、VEGFA、JUN、STAT3、EGF 等可能是復方血栓通膠囊治療RVO 的關鍵靶點，主要通過IL-17、TNF、PI3K-Akt、MAPK 等信號通路影響氧化應激、炎癥反應、新血管生成、細胞凋亡等過程，從而發揮治療作用。

蛋白質激酶B（Akt）是絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，在細胞凋亡、增殖、遷移等過程中起重要作用，其與缺血性損傷中新生血管的形成密切相關［15］。研究發現，Akt 抑制劑可有效減輕氧誘導的視網膜新生血管形成［16］，Akt 是PI3K 下游的作用靶點，也是PI3K/Akt通路的關鍵蛋白，與MAPK、NF-κB 等通路密切相關。槲皮素通過抑制MAPKs、Akt 以及PI3K 激活使NF-κB 信號失活，從而有效抑制視網膜感光細胞中VEGF 誘導的過度炎癥反應及血管平滑肌細胞增殖，抑制膠原蛋白合成和分泌［17］。可見復方血栓通膠囊可能通過上調Akt表達與影響PI3K-Akt通路達到抑制RVO產生新生血管及延緩動脈硬化的作用。

IL-6 是重要的炎癥因子，可直接或間接誘導多種其他炎性細胞因子產生。IL-6一方面可直接影響內皮細胞功能，另一方面還可誘導VEGF 表達來增加血管通透性和促進血管生成，而且還與BRVO 和CRVO 中視網膜缺血的發展有關［18］。IL-17已被證明與眼部新生血管形成有關，可通過IL-17信號通路增強VEGF、ICAM-1、IL-6、IL-8 的表達來促進內皮細胞增殖、遷移，從而增加人視網膜毛細血管形成［19］。TNF-α是由巨噬細胞和T 細胞產生，是炎癥和細胞凋亡中的主要細胞因子之一。研究發現，RVO 患者TNF-α 表達升高，在視網膜血管生成中作為重要的前血管生成因子起重要作用，可促進血管內皮細胞釋放凝血因子，增加血管內皮細胞黏附分子表達，增強局部炎癥反應［20］。槲皮素和黃芩素可有效抑制脂多糖誘導的TNF-α、IL-6轉錄和蛋白質合成，并且抑制一氧化氮的產生，從而抑制內皮細胞的炎癥反應［21］。可見復方血栓通膠囊可能通過抑制炎癥因子表達減輕RVO 引起的內皮細胞炎癥反應。

VEGF 是內皮特異性有絲分裂原，是眼內血管增殖的主要信號。當組織缺氧時，可引起VEGF過表達，一方面誘導激活PI3K-Akt 通路，加速血管內皮細胞遷移和增殖，導致新的微血管腔形成［22］；另一方面可激活NF-κB 通路，調控下游血管細胞黏附分子-1表達，協同導致白細胞淤滯，加重視網膜血管閉塞及缺血［23］。研究表明RVO 的增殖反應由VEGF驅動，其表達與新生血管形成的嚴重程度成正比，并可協同其他血管通透性增強劑加速黃斑水腫形成［24］。研究表明木犀草素可有效阻斷VEGFR 及其下游PI3K/Akt和PI3K/p70S6通路的激活，從而抑制人臍靜脈內皮細胞的增殖，也可通過穩定新生血管屏障透明質酸來抑制血管生成［12］。三七的活性成分三七總皂苷可抑制VEGF誘導的氧調節性視網膜新生血管形成，起到調節血脂的作用［25］。研究發現復方血栓通膠囊可抑制激光光栓形成，誘導RVO大鼠VEGF表達，對視網膜病變具有一定改善作用［26］。

綜上所述，復方血栓通膠囊可通過干預多種靶點、調控多種通路途徑，從氧化應激、炎癥反應、新血管生成、細胞凋亡等過程治療RVO。