抑制細胞衰老在骨關節炎軟骨再生治療中的研究進展

葉啟程 聶萍

【提要】 近年來，細胞衰老在骨關節炎發生、發展中的作用已成為研究熱點，現有證據已基本明確軟骨細胞衰老、間充質細胞（Mesenchymal cells，MSCs）衰老與軟骨修復異常及骨關節炎（Osteoarthritis，OA）的發生與發展存在一定因果關系。定向清除衰老細胞，促進干細胞的年輕化可有效延緩OA。本文針對細胞衰老在骨關節炎發生、發展中的病理作用及潛在治療靶點進行綜述。細胞衰老是OA 發生、發展中的重要生物學現象及潛在治療靶點，深入研究其生物學機制有助于OA 的早期防治。

骨關節炎（Osteoarthritis，OA）是一種以軟骨細胞肥大和凋亡、軟骨細胞外基質降解、滑膜炎性浸潤，以及軟骨下骨重塑作為主要病理特征的慢性退行性疾病。臨床表現為關節軟骨退化、軟骨下骨硬化、骨贅形成，并伴有關節疼痛、腫脹、畸形及活動障礙等，且多發于膝、髖等負重關節。OA 不是一種獨特的疾病，而是一種具有不同臨床表型和分子生物學的異質性綜合征，經不斷演變，最終導致上述臨床表現[1]。

針對OA 的治療手段目前大多僅為對癥處理，缺乏疾病干預的有效藥物，絕大部分患者最終仍需通過關節置換來緩解疼痛并恢復關節功能。對調控OA 發生、發展分子信號網絡的研究，有望從根本上解決OA 的防治難題[2]。本文將從細胞衰老和OA 的機制，目前已被研究的治療靶點與藥物進行綜述，并對潛在的治療靶點進行簡單的介紹。

1 細胞衰老

倫納德·海夫里克（Leonard Hayflick）和保羅·摩爾黑德（Paul Moorhead）于 1961 年首次提到“細胞衰老”一詞，它是指在特征性的細胞倍增后出現的不可逆的細胞生長停滯現象。細胞衰老被認為是一種信號轉導過程，可導致細胞進入穩定的生長停滯狀態，但能保持代謝活性，現被擴展描述為不同應激因素誘導的持久性增殖停滯狀態，是對許多不同的觸發因素的反應，包括DNA 損傷、端粒功能障礙、癌基因激活和細胞器應激，并與腫瘤抑制、組織修復、胚胎發生和器官老化等過程相關[3]。

細胞衰老可分為復制性衰老和早衰。復制性衰老是指端?？s短導致的復制能力降低的狀態，而氧化應激和DNA 損傷導致細胞周期停滯的過早衰老。這類細胞衰老的典型特征包括p21、p16和p53 的表達增加，衰老相關的β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）活性和活性氧水平升高。同時，衰老細胞中衰老相關分泌表型（Senescence-associated secretory phenotype，SASP）和促炎細胞因子的代謝活性和分泌水平也會隨之發生變化[4]。

1.1 軟骨細胞衰老與OA

軟骨細胞是關節軟骨（Articular cartilage，AC）中的獨特細胞，對細胞外基質（Extracellular matrixc）的產生和周轉至關重要，細胞外基質占AC 的95%。

軟骨細胞衰老可能是由兩方面因素共同決定的，包括應激誘導（DNA 損傷、氧化應激、炎性衰老以及表觀遺傳等）和有限的原位復制能力。OA 的病理機制涉及多種關節組織和細胞類型，但軟骨細胞一直是衰老研究的重點。

目前關于細胞衰老和OA 的分子機制研究主要集中于三個方面：①衰老發生共同通路的上游調控機制；②衰老細胞產生SASP 的調控機制；③衰老細胞影響周圍健康細胞的機制。

1.1.1 細胞衰老的兩條上游調控機制

p53、p16 和p21 在細胞衰老中的重要作用已被廣泛研究，可分為兩種主要的信號通路：p53/p21 和Rb/p16。許多應激刺激可以激活不同的信號通路，并最終通過p53/p21 和/或Rb/p16 通路導致細胞周期停滯[4]。盡管這兩種途徑共享幾種常見的調節因子，但p16/pRB 途徑誘導的細胞生長停滯被認為是不可逆的，而p53/p21 途徑誘導的生長停滯是可逆的[5]。

Diekman 等[6]通過小鼠及人體研究發現，p16的表達僅僅是軟骨細胞增殖能力缺失的標志之一，而衰老細胞產生的SASP 才是衰老軟骨細胞與OA之間的驅動因素。

1.1.2 SASP 的調控機制

衰老的細胞不僅表現出生長停滯的特征，而且促進SASP的產生。SASP影響周圍的細胞和組織。SASP 中包含一系列細胞因子、生長因子、蛋白酶、氧化應激物質等，這些物質會對周圍細胞的增殖、分化和代謝等產生影響[7]。

SASP 的影響主要包括兩個方面：①SASP 中的一些細胞因子和生長因子可以誘導周圍細胞進入增殖狀態或者促進細胞分化；②SASP 中的一些蛋白酶和氧化應激物質可以誘導周圍細胞凋亡或者損傷[8-9]。

1.1.3 衰老細胞（Senescent cells，SNCs）對周圍健康細胞活性的影響

SNCs 通過SASP 對周圍健康細胞產生影響。SASP 中含有多種生物活性分子，如細胞因子、生長因子、基質金屬蛋白酶等，這些分子可以對周圍的健康細胞產生廣泛的影響，包括細胞周期的停滯、細胞凋亡、DNA 損傷修復、細胞枯萎等，最終影響組織的功能和結構[10]。

膝關節中的間充質細胞（Mesenchymal cells，MSCs）具有自我更新的能力，可根據組織特異性分為滑膜、脂肪源性和骨髓源性間充質細胞。已有研究表明，衰老軟骨細胞可以抑制骨髓間充質干細胞的分化潛能和增殖，從而促進OA 的產生。

此外，近年還發現一些其他的潛在靶點。Liu等[11]提 出，細 胞 外 小 泡（Extracellular vesicles，EVs）可以攜帶供體細胞的遺傳物質，并介導細胞通信，從而在OA 疾病的發展中發揮一系列作用，如傳播炎癥、改變代謝和促進細胞衰老，有望作為OA 早期診斷和評估病理類型、嚴重程度的生物標志物。經修飾和未經修飾的EVs 擁有治療OA的潛力，但是仍然面臨許多挑戰。

內質網（Endoplasmic reticulum，ER）應激是指ER 中蛋白質錯誤折疊/未折疊的積累。Wen 等[12]在最近的研究中發現，內質網應激通過影響一系列細胞的生理功能，參與了OA 的病理變化。靶向ER 應激已被證明能夠在體外和體內緩解OA 進展，ER 應激是OA 的一個有吸引力和有前途的靶點。

2 治療策略

細胞衰老在OA 發生、發展中的重要作用，為研發靶向衰老細胞治療OA 的藥物提供了理論依據。根據作用方式的不同，目前常用藥物有通過誘導衰老細胞凋亡的Senolytics（槲皮素、達沙替尼、USP7抑制劑、ABT263）和通過阻斷SASP 旁分泌的Senmorphics（Nutlin-3a、Canakinumab、CL82198）。此外，近年還有研究提出干細胞、間充質細胞等新的治療靶點。

2.1 靶向清除衰老細胞

衰老細胞相關的藥物目前主要有三種：Senolytics、SASP 抑制劑和營養信號調節劑，其中以Senolytics 應用最為廣泛。

Senolytics 是一種選擇性消除衰老細胞的藥物，包括達沙替尼、槲皮素、navitoclax、A1331852、A1155463、非西汀、木犀草素、HSP90 抑制劑等[9]。作為第一代Senolytics 的達沙替尼，是一種用于治療白血病的化療藥物，后續被用于治療細胞衰老[4]。Jeon 等[13]的研究結果表明，Senolytics 類藥物UBX0101 可以從OA 軟骨細胞培養物中選擇性去除SNCs。

Miura 等[14]用ABT-263 預處理OA 患者的滑膜MSCs，結果表明，在軟骨形成過程中，預處理的細胞產生了更多的糖胺聚糖和Ⅱ型膠原，衰老標志物（p16 和p21）和SASP 因子（MMP-13 和IL-6）及Ⅰ型膠原的表達降低。同樣，Yang 等[15]也發現ABT263 關節內注射，改善了創傷后OA 大鼠軟骨和軟骨下骨的病理變化。

此外，近年還發現一些新的潛在靶點。如軟骨祖細胞（Cartilage progenitor Cells，CPC）被定義為干細胞樣細胞，具有優異的自我更新和多向分化潛力，被認為是OA 中的主要軟骨修復劑。CPC在體外或體內也可以獲得衰老表型[16]。Dai 等[17]證明了CPC 的衰老和SASP 的形成是相互依賴的，并與關節牽張成形術的不良結果相關，通過Senolytics 消除衰老的CPC 可以降低SASP 的形成。

2.2 靶向拮抗SASP

衰老細胞分泌一些因子或釋放信號分子主動改變周圍環境，引起組織細胞發生衰老，這種現象稱為復制性衰老相關分泌表型[18]。與Senolytics優先誘導衰老細胞凋亡不同，Senmorphics 通過抑制SASP 信號通路，以減少旁分泌炎癥因子的釋放和組織損傷來治療OA。目前已發現多種化合物可以抑制與SASP 相關的通路而不誘導細胞凋亡[3]。Schieker 等[19]發現，抗IL-1β 抗體卡納單抗可以顯著降低心血管事件高風險人群的膝關節和髖關節置換率。Coryell 等[20]證明了IL-6 受體抑制劑拖珠單抗在治療OA 中有效，目前已經進入Ⅲ期臨床試驗。Wang 等[21]發現，注射MMP-13 抑制劑CL82198 可以明顯緩解小鼠半月板韌帶損傷OA 模型中的軟骨退變，提高關節軟骨中Ⅱ型膠原水平，可抑制軟骨細胞死亡。此外，還有更多靶向SASP的藥物正在被發現，例如通過清除活性氧達到拮抗SASP 效果的石斛堿、鈰納米顆粒等[22-23]。

2.3 激活內源性干細胞再年輕化

干細胞是未分化的細胞，具有調節免疫、抵抗炎癥、促進血管生成和修復再生的作用。其他三種類型的干細胞，胚胎干細胞（Embryonic stem cell，ESCs）、誘導多能干細胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs）和間充質干細胞，是OA 治療軟骨再生的潛在候選細胞。ESCs 和iPSCs 都具有本質上的多能性特征，可以分化為其他細胞類型，包括軟骨細胞。

Murphy 等[24]研究了與年齡相關的常駐骨骼干細胞（Skeletal stem cells，SSCs）群體的再生軟骨能力，發現通過微創手術刺激成年小鼠四肢關節軟骨表面區域，可以引發SSCs 的局部擴張和再生反應。

間充質干細胞在過去幾十年中作為治療OA的一種新興技術被廣泛探索。根據現有研究，間充質干細胞可通過干擾細胞免疫和分泌大量活性化學物質來限制OA 中的軟骨降解[25]。研究發現，旁分泌機制是間充質干細胞的主要作用方式。外泌體是已知最小的膜結合納米囊泡。Zhang 等[26]在小鼠OA 模型中發現，骨髓間充質干細胞衍生的外泌體可以通過促進滑膜巨噬細胞從M1 到M2 的表型轉化來緩解骨關節炎。Jin 等[27]在大鼠OA 模型關節內注射人骨髓間充質干細胞（Bone marrow MSCs，BM-MSC）外泌體，BM-MSC 和BM-MSC衍生的外泌體均減輕了軟骨破壞和軟骨下骨重塑。

?amernik 等[28]的研究表明，原發性骨關節炎的病理過程伴隨著骨間充質干細胞衰竭，軟骨下骨MSCs 耗竭與原發性骨關節炎在病理學上相關。通過其潛在的軟骨分化能力、旁分泌作用及免疫調節作用，為OA 治療提供了可能[29]。MSCs 對OA 治療的作用是雙重的，包括軟骨生成和免疫調節活性。MSCs 不僅具有分泌多種細胞因子、趨化因子和生長因子的能力，還具有免疫調節作用[30]。

Wei 等[31]也提出關節內注射MSCs 可改善膝關節OA 患者的功能并減輕疼痛。不同來源的MSCs 的治療對組織再生有積極影響。同時，多個薈萃分析證明了用于治療OA 的MSCs 移植的安全性和有效性，Peeters 等[32]對治療OA 的自體MSCs進行了系統分析，包括平均隨訪21 個月的844 名患者，結果表明骨髓間充質干細胞的關節內注射在治療骨關節炎中是有效和安全的。

根據目前的信息，就MSCs 的最終有效性得出結論還為時過早。仍需要額外的放射學和組織學數據，以及更多的臨床試驗數據支持。同時，間充質干細胞對OA 的潛在治療機制需要進一步研究。

2.4 靶向Sirtuins 治療OA

沉默信息調節蛋白（Silent information regulator proteins，Sirtuins）是NAD+依賴性脫乙酰酶家族，從細菌到人類高度保守，控制各種細胞過程，包括DNA 修復、細胞周期、線粒體穩態和細胞衰老。已經有證據表明，Sirtuin 家族成員（sirt1、sirt6）與OA 的發展相關，可能是治療OA 的新靶點。Yan 等[33]通過細胞實驗發現，二甲雙胍通過microRNA-34a/SIRT1 途徑調節軟骨細胞的衰老和增殖。此外，Wu 等[34]發現，Sirt6 的過度表達可以通過減少炎癥反應和軟骨細胞衰老來阻止OA 的發展。同樣，Ji 等[35]使用來自OA 患者和對照組的臨床樣本，發現Sirt6 在軟骨組織和軟骨細胞中顯著降低，并在動物模型中驗證了Sirt6 可以預防OA，并強調了Sirt6 在軟骨細胞衰老中的關鍵作用，表明Sirt6 可能是OA 的新的潛在治療靶點。

3 總結與展望

現有研究表明，衰老細胞可能通過SASP 和改變關節內環境來參與OA 的發病和進展。此外，關節內衰老的骨骼細胞和滑膜細胞之間的相互作用對OA 的發生至關重要。但是，目前相關機制的研究并不完善，例如關節組織中負責 OA 發生、發展的特異衰老細胞和特異SASP因子尚未完全闡明[11]。

OA 的傳統治療包括非手術治療以及外科治療，但是并不能降低疾病早期的發病率，也不能防止軟骨退化或促進再生。新興療法（如干細胞治療）也存免疫排斥和致瘤性等風險。最近，包括Senolytics 和Senmorphics 在內的幾種治療藥物已成功研發，并陸續在細胞和動物實驗中驗證。越來越多的證據表明，靶向衰老細胞將有助于治療OA 這類與年齡相關的慢性疾病。