郭巖山自然保護區絲栗栲天然林分土壤微生物群落沿海拔梯度變化

汪運祥，吳航湦，何冬梅，蘇 儀，王子楊，潘 龍，廖曉麗，靳少非，鄭德祥＊

(1.福建農林大學林學院，福建 福州 350002；2.順昌縣官墩國有林場，福建 順昌 353200；3.閩江學院地理與海洋學院，福建 福州350108)

山地生態系統常常被視為研究土壤微生物群落和氣候變化的天然場所[1]，山地海拔梯度變化會改變植被類型、影響土壤性質，從而對微生物多樣性和群落組成產生重要影響[2]。土壤微生物驅動著土壤有機質周轉和養分循環，在污染物轉化與分解、溫室氣體產生和消減等過程中起著重要作用，直接影響著生物地球化學循環等生態過程[3]。在未來全球變暖的背景下，土壤微生物的作用至關重要[1]，氣候變暖導致溫度、二氧化碳升高，很可能造成土壤微生物群落組成和功能發生變化[4]。因此，研究土壤微生物的海拔分布格局及其驅動機制將為未來氣候變化的響應和預測提供重要依據[5]。

目前，對于土壤微生物在海拔梯度上的多樣性模式及驅動因素研究仍無統一定論，前人研究表明微生物多樣性呈單調型[6]、駝峰型或U 型[7]、獨立趨勢[8]等，不同因素影響著土壤微生物的海拔梯度分布，如Kou 等[9]發現土壤pH、植物豐富度是影響貢嘎山土壤微生物組成的重要因素。上述研究多集中在溫帶高山凍原區、青藏高原高山氣候區及溫帶季風氣候區等[10-11]，具有大跨度海拔梯度不同生態系統的研究特點。已有研究表明微生物取樣的尺度將強烈影響觀察到的模式[12]，然而目前罕見在同一生態系統的小跨度海拔梯度內的研究。常綠闊葉林是南方亞熱帶典型地帶性森林類型，天然垂直分布于海拔1 000～2 000 m 以下的中低山丘陵區域[13]，具有海拔間隔和垂直距離相對較小的特點。已有亞熱帶森林土壤微生物研究多集中在針葉林中開展，如Huang 等[14]發現SOC 和全氮是影響針葉林土壤微生物群落變化的主要因素，對于小跨度海拔梯度的亞熱帶常綠闊葉林同一森林生態系統土壤微生物研究甚少，已有的大跨度海拔梯度的高山地區、不同氣候帶或植被類型等的土壤微生物研究結果是否同樣適用于亞熱帶小跨度海拔梯度分布的常綠闊葉林林分尚不得而知。

郭巖山地處亞熱帶地區，其分布的絲栗栲（Castanopsis fargesiiFranch.）天然林具有典型的亞熱帶植被帶分布特征[15]。絲栗栲是亞熱帶常綠闊葉林中的常見優勢樹種，也是我國東南林區重要建群樹種，該樹種分布廣泛，具有較高的經濟、生態和科學價值[16]。已有絲栗栲的研究多集中在葉片酚類化合物[16]、種群分化的生態足跡[17]，葉和根CNP 的差異[18]、土壤有機碳[19]、外生菌根[20]等方面，僅有Qiao 等[16]研究了絲栗栲土壤微生物群落不同生長季節的變化，對絲栗栲天然林分土壤微生物生態地理學的詳細研究尚未見報道。因此本研究擬采用高通量測序技術對500～900 m 海拔分布的絲栗栲天然林分土壤微生物群落進行研究，以期解決以下科學問題：（1）亞熱帶小跨度海拔梯度的天然林分土壤微生物多樣性和群落組成變化是否與其他地區大跨度海拔梯度的變化相似？（2）影響亞熱帶小跨度海拔梯度的絲栗栲天然林分土壤微生物群落分布的主要因素是什么？

1 研究區概況

郭巖山自然保護區（27°06'～27°18' N，118°00'～118°30' E；海拔500～900 m），坐落于福建省南平市順昌縣，隸屬于南平市與三明市的交接地帶，主峰高達1 383.7 m，是順昌縣第一高峰。郭巖山自然保護區地處亞熱帶地區，屬海洋性季風氣候，四季分明[18,21]，無酷暑與嚴寒，年降雨量和日照充足，無霜期305 d，土壤類型以黃紅壤（500 ～700 m、900 ～1 000 m）、 黃棕壤（700～900 m）為主。獨特的地理位置和優越的水熱條件使郭巖山自然保護區植物資源豐富，其中待土壤采樣的絲栗栲林為海拔500～900 m 主要優勢建群樹種。

2 研究方法

2.1 樣品采集

在南平市順昌縣郭巖山海拔500～900 m 每間隔100 m 設置3 個20 m × 20 m 的重復樣地，樣地間距大于15 m，以避免樣地之間相互干擾，選取的樣地地形、地貌、坡度和坡向基本一致，樣地基本情況詳見表1。在每個樣地內選擇5 個采樣位置，并使用土壤取樣器采集0～10 cm 的土壤樣品，混勻后現場過篩，之后分成兩份，用于土壤DNA 提取和基本理化性質測定。

表1 樣地基本信息Table 1 Basic information of the sample plots

2.2 土壤理化性質測定

參照《土壤農化分析》[22]進行基礎土壤理化性質測定。土壤理化性質基本情況詳見表2。

表2 不同海拔土壤理化性質Table 2 Soil physicochemical properties in different altitude

2.3 土壤DNA 提取和高通量測序

根據美吉生物醫藥科技有限公司的方案，采用Omega DNA 試劑盒從0.5 g 土壤中提取土壤DNA。使用引物338F(ACTCCTACGGGAGGC AGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAA T)進行靶向V3-V4 區的細菌16S rRNA 的PCR 擴增[23]；使用引物ITS1F(CTTGGTCATTTAGAGG AAGTAA)和ITS2R(GACGCTTCTCCAGACTACA AT)擴增真菌ITS1 區域[24]，然后基于Illumina Miseq 平臺進行15 個土壤樣本的測序。

2.4 數據分析

用Mothur 軟件計算土壤微生物群落的α 多樣性，并用Origin 軟件繪圖表示；用SPSS 軟件進行單因素方差分析和Spearman 分析，探究土壤性質之間及其與土壤微生物多樣性之間的相關性；基于Bray-Curtis 算法開展NMDS 分析和ANOSIM 分析，探究土壤微生物群落的β 多樣性在不同海拔間的差異；分別使用R（3.3.2）生成微生物群落Bar 圖，來確定不同海拔梯度下微生物群落結構組成情況；進行冗余分析（RDA）及繪制微生物菌門與各土壤性質相關性熱圖來確定影響微生物群落沿海拔梯度分布的重要因素；生成VPA 圖，來定量研究相關因子對微生物群落的貢獻度。

3 結果與分析

3.1 土壤微生物多樣性及群落組成分析

經過測序，從15 個絲栗栲土壤樣品中共獲得3 887 404 條優質細菌序列和4 760 165 條優質真菌序列，每個樣品的細菌序列范圍為203 934～300 220 條，真菌序列范圍為272 355～387 205條。如圖1 所示，郭巖山細菌的α 多樣性沿海拔梯度呈現無趨勢變化，而真菌的α 多樣性沿海拔梯度呈現先減后增。對郭巖山海拔500～900 m 之間微生物群落的α 多樣性和豐富度指數進行單因素方差分析表明，細菌群落各指數差異均不顯著（P＞0.05），而不同海拔真菌群落的Sobs 指數和Chao1 指數存在極顯著差異（P≤0.01）。海拔500 m 的細菌和真菌群落多樣性最高，海拔800 m 時細菌群落多樣性最低，海拔700 m 時真菌群落多樣性最低。

圖1 絲栗栲林土壤細菌（a）和真菌（b）α 多樣性隨海拔的變化Fig.1 Alpha diversity of bacterial (a) and fungal (b) diversity in Castanopsis fargesii forests soils with the elevations

由圖2 NMDS 分析表明，細菌和真菌群落沿海拔梯度具有高度的變異性，不同的微生物群落在高度相近的海拔梯度上聚集為一類，ANOSIM 分析的結果表明，不同海拔之間細菌和真菌β 多樣性均存在顯著差異。隨著海拔升高，細菌β 多樣性有明顯的海拔分布格局，而真菌β 多樣性未呈現規律性變化。

圖2 土壤微生物β 多樣性隨海拔的變化Fig.2 Variation in soil microbial beta diversity with the elevations

本研究中，細菌群落包括在38 門，121 綱，269 目，437 科，752 屬，真菌群落包括在16 門，68 綱，166 目，381 科，879 屬。在郭巖山5 個海拔所有采樣點中，變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria ） 和放線菌門（Actinobacteria）是細菌群落的3 個主要菌門，norank_f_norank_o_subgroup_2、norank_f_xanthobacteraceae是細菌群落的兩個主要菌屬（圖3a、c）；擔子菌門（Basidiomycota）、子囊菌門（Ascomycota）是真菌群落的兩個主要菌門，Russula、Lactifluus是真菌群落的兩個主要菌屬（圖3b、d）。不同海拔微生物各菌門、屬存在差異，但未呈現明顯的海拔分布模式。

圖3 優勢微生物菌門（a、b）和屬（c、d）相對豐度隨海拔梯度變化Fig.3 Variation in relative abundance of dominant microbial phyla and genera with the elevations

3.2 微生物多樣性及群落組成對土壤性質的響應

由Spearman 相關分析可知（表3），郭巖山細菌α 多樣性與土壤理化性質無顯著相關關系，而土壤全磷與真菌α 多樣性具有極顯著相關關系；細菌和真菌β 多樣性與海拔梯度（Altitude）和堿解氮存在顯著相關關系，此外全磷和土壤pH 僅與細菌β 多樣性存在顯著相關關系，而全鉀和土壤密度僅與真菌β 多樣性具有顯著相關關系。

表3 土壤性質與微生物多樣性指數相關分析Table 3 Correlation analysis between soil physicochemical properties and microbial diversity

由圖4 冗余分析（RDA）可知，郭巖山的海拔（Altitude）梯度變化使其林分土壤所處的氣候（如溫度、降水）與土壤性質隨之發生變化，進而影響了土壤微生物的群落組成，在所測定的土壤性質中，土壤pH、全磷和堿解氮是影響郭巖山不同海拔細菌群落組成的最重要因素；而土壤密度、全磷、速效鉀和全氮是影響郭巖山不同海拔真菌群落組成的最重要因素。由圖5a、c 可知，髕骨菌門和WPS-2 菌門分別與土壤pH 顯著負相關；變形菌門、疣微菌門和norank_f _xanthobacteraceae屬分別與土壤全磷顯著正相關，而酸桿菌門、髕骨菌門和norank_f _norank_o_subgroup_2屬分別與土壤全磷顯著負相關。對于真菌群落（圖5b、d），土壤密度與真菌群落無顯著相關關系；梳霉菌門、球囊菌門、羅茲菌門、Saitozyma菌屬、unclassified_p_Ascomycota菌屬、unclassified_k_Fungi菌門和屬分別與土壤全磷顯著正相關；而子囊菌門與土壤速效鉀顯著正相關。上述結果表明，土壤性質對各菌群的顯著影響并不統一。

圖4 土壤理化性質與微生物群落結構的冗余分析Fig.4 Redundancy analysis of soil physicochemical properties and microbial community structure

圖5 相對豐度排名前10 位微生物菌門(a、b)和屬（c、d）與土壤理化性質的spearman 相關性分析Fig.5 Spearman correlation analysis of the top 10 microbial phyla and genera in relative abundance and soil physicochemical properties

由圖6 方差分解分析（VPA）發現，土壤性質是造成土壤細菌、真菌群落差異的主要因素，分別解釋了30.2%和16.2%的群落差異。海拔高度只能解釋微生物群落差異的一小部分，如海拔高度僅僅解釋了真菌群落2.5%的差異。

4 討論

郭巖山自然保護區絲栗栲天然林分土壤細菌α 多樣性呈無規律變化的分布模式，土壤真菌α 多樣性和豐富度指數沿海拔先下降后上升，且不同海拔梯度之間真菌群落豐富度指數存在顯著差異（圖1），這一結果與姚蘭等[25]和周煜杰等[26]在亞熱帶黃山地區和秦嶺地區發現土壤微生物多樣性海拔分布模式相似，不同的是本研究發現土壤全磷是真菌α 多樣性主要影響因素（表3），而上述研究結果表明影響微生物多樣性海拔分布的因素是土壤pH，產生差異的原因可能是本研究是在較小跨度的海拔梯度上開展的，不同的海拔梯度導致了土壤具有不同的物理和化學性質，沿著海拔梯度土壤性質對微生物群落起著重要作用，影響著微生物多樣性分布過程[27]。通過NMDS 分析發現細菌和真菌群落在不同海拔梯度之間存在相異的聚類模式，隨海拔升高，細菌β 多樣性海拔分布模式較明顯，而真菌的β 多樣性海拔分布格局不明顯（圖2），這與Meng 等[28]對土壤微生物多樣性海拔分布格局在亞熱帶森林中的研究相似，相關分析表明海拔梯度和堿解氮顯著影響了細菌和真菌β 多樣性，說明了土壤微生物β 多樣性海拔分布格局受海拔梯度和堿解氮的共同影響。此外，隨著海拔梯度的變化，土壤pH 值和全磷僅與細菌β 多樣性具有顯著相關關系（表3），而全鉀和土壤密度僅與真菌β 多樣性具有顯著相關關系，這與叢靜等[29]對湖北省神農架自然保護區的主要森林類型土壤微生物的研究結果有所不同，原因可能是本研究在同一優勢樹種森林類型且海拔跨度范圍（500～900 m）較小，而神農架的研究涉及不同植被類型且海拔高、跨度大（1 000～2 800 m），其微生物群落組成直接被不同的凋落物和根系分泌物影響[30]，并被變化較大的有機質、土壤pH、微氣候等間接影響[2,31]，從而導致了土壤微生物多樣性對土壤性質出現差異性響應。

本研究表明郭巖山自然保護區不同海拔間土壤微生物既有自身特異性，亦具有物種的相似性，在郭巖山五個海拔所有采樣點中，變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）是細菌群落的3 個主要菌門，norank_f_norank_o_subgroup_2、norank_f_xanthobacteraceae是細菌群落的兩個主要菌屬（圖3a、c）；擔子菌門（Basidiomycota）、子囊菌門（Ascomycota）是真菌群落的兩個主要菌門，Russula、Lactifluus是真菌群落的兩個主要菌屬（圖3b、d），這與Huang 等[14]和Zhou 等[32]分別在大跨度海拔梯度的中亞熱帶森林和秦嶺亞熱帶銳齒櫟林的研究結論相似，說明了海拔跨度不會顯著影響優勢微生物菌門和屬的變化。變形菌門、酸桿菌門和放線菌門的主要功能為有機質分解作用[33]，而擔子菌門和子囊菌門也主要起代謝和分解有機質的作用[34]。郭巖山自然保護區地處具有豐富水熱條件的亞熱帶季風氣候區，雨熱同期的先天條件促進了土壤有機質積累和凋落物分解，這為喜營養類的細菌和真菌類群提供了豐富的底物供給，促使土壤中與代謝和分解作用有關的微生物在各海拔梯度上的相對豐度均占據優勢地位[35]。稀少群落的疣微菌門（Verrucomicrobia）、WPS-2 菌門在土壤細菌群落中占比小，對大量養分的競爭能力非常有限且需求量少[36]，而更傾向于對微量元素（磷）的獲取以維持自身群落機制和養分平衡[35]。

本研究結果表明，不同海拔梯度使土壤理化性質發生轉變，進而導致土壤微生物群落組成存在明顯的差異，整個細菌群落的組成和優勢門及屬的相對豐度與土壤pH、全磷和堿解氮密切相關；而土壤全磷和速效鉀是影響真菌群落組成和優勢門及屬相對豐度的最重要因素（圖4，圖5）。土壤性質解釋了細菌和真菌30.2% 和16.2% 的群落差異，是森林土壤微生物群落聚集的主要驅動因素之一，在以往研究中已得到廣泛驗證，Yuan 等[37]觀察到降水和土壤 NH4+是影響土壤細菌群落的主要環境因素；Cui 等[10]研究發現海拔、碳氮比、土壤溫度是影響細菌和真菌群落的主要環境因素，其中全磷是影響細菌群落主要驅動因素，本研究結果與前人對于較大跨度海拔土壤微生物的研究結論相似，這說明土壤性質可以很好地預測土壤微生物群落組成的變化，即使在小跨度海拔梯度上亦是如此。前人研究表明土壤養分（如總碳、全氮、全磷、有效磷、堿解氮和有機碳）對微生物群落組成有很大影響，并且可以解釋土壤微生物群落的大多數變化[11,25]。本研究發現堿解氮與Patescibacteria 細菌門的相對豐度呈顯著正相關關系，堿解氮是森林生態系統中細菌的重要氮來源，參與了細菌的蛋白質合成，并促進微生物從富含木質素和纖維素的植物中獲得C[38]，因此微生物需從土壤中獲取更多的堿解氮，以實現生物量元素的化學計量平衡[10]。本研究發現，隨著海拔升高全磷含量逐漸減少（表2），這是因為高海拔處天然絲栗栲林趨于矮小和稀疏，凋落物歸還較少，這增加了土壤養分淋失的風險[27]，從而造成了全磷養分含量減少。此外，研究還發現Patescibacteria 細菌門的相對豐度隨土壤pH 和全磷的升高而降低，但同時隨堿解氮的升高而增加，Patescibacteria 門的菌群具有固定CO2和水解碳水化合物的能力，且因為有簡化的膜結構從而避免了被噬菌體入侵，以適應變化的土壤環境[39]。由此可見，土壤pH 和氮磷養分是影響土壤Patescibacteria 門發揮固碳作用和分解作用的重要驅動因素，并間接影響絲栗栲的生長和繁殖。土壤微生物群落的海拔分布規律體現了環境變量的重要性[11]，海拔高度和土壤性質的空間變化對微生物群落組成有很大的影響[40]。本研究證實了海拔高度和土壤性質共同影響了郭巖山土壤微生物的生態地理學分布，但因為在高山生態系統中，海拔梯度主要通過影響森林土壤的性質，如pH、養分含量、植被類型和微氣候等，間接對土壤微生物群落產生影響[2]，導致海拔高度只能解釋微生物群落差異的極少部分（圖6）。而無法解釋的微生物群落差異可能是由于本研究中未測量的其他因素，如土壤銨態氮、硝態氮、MBC、MBN 等，未來將繼續對此開展研究和驗證。

5 結論

（1）在小跨度海拔梯度的郭巖山自然保護區天然絲栗栲林分中，土壤細菌α 多樣性沿海拔梯度呈無規律的海拔分布格局，而真菌的α 多樣性沿海拔梯度先下降后上升，土壤全磷是真菌α 多樣性主要影響因子，這與大跨度海拔梯度的研究存在差異，原因是不同跨度的海拔梯度導致了土壤具有不同的理化性質，影響著微生物多樣性分布過程；（2）變形菌門、酸桿菌門和放線菌門是土壤細菌群落的三個主要菌門，norank_f_norank_o_subgroup_2、norank_f_xanthobacteraceae是細菌群落的兩個主要菌屬；擔子菌門、子囊菌門是真菌群落的兩個主要菌門，Russula、Lactifluus是真菌群落的兩個主要菌屬，這與大跨度海拔梯度的研究相似，說明了小跨度的海拔梯度不會顯著影響優勢微生物菌門和屬的變化；（3）土壤性質解釋了細菌和真菌30.2%和16.2%的群落差異，是森林土壤微生物群落聚集的主要驅動因素之一，整個細菌群落的組成和優勢門及屬的相對豐度與土壤pH、全磷和堿解氮密切相關，而全磷和速效鉀是影響真菌群落組成和優勢門及屬相對豐度的最重要因素，這與前人在較大跨度海拔梯度上的研究結果相似，說明了土壤性質可以很好地預測土壤微生物群落組成的變化，即使在小跨度海拔梯度上亦是如此。