8 個油橄欖品種扦插苗苗期耐寒性評價

吳文俊，戚建莉，金高明，張 榮，姚玉芳，馬成艷，姜成英

(甘肅省林業科學研究院 國家林業和草原局油橄欖工程技術研究中心 甘肅省油橄欖工程技術研究中心，甘肅 蘭州 730020)

油橄欖（Olea europaeaL.）是木樨欖屬（Olea）常綠喬木，世界四大木本油料作物之一，野生油橄欖起源于小亞細亞，主產區在地中海區域[1]，但南、北半球的40 多個亞熱帶國家都有引種栽培，植物油產量居世界第六位[2]。油橄欖與其他亞熱帶常綠經濟林樹種一樣，冷脅迫一方面影響其地理分布，另一方面造成產量的巨大損失[3]，希臘和意大利就曾在2004 年和2008 年遭遇寒冷天氣，導致油橄欖園受災，鮮果減產[4]。我國西秦嶺南坡的油橄欖主產區，位于北亞熱帶北緣，低溫是限制該區域油橄欖地理分布和鮮果減產的重要因素[5]，而引種和篩選耐低溫品種能一定程度上解決低溫對油橄欖栽培帶來的不利影響[6]。

植物可以通過在低溫條件下激活抗氧化酶系統抵御超氧自由基的毒害[7]；通過調節組織中可溶性蛋白、非結構性碳水化合物以及游離脯氨酸含量來提高細胞液滲透勢，提高對寒冷的忍耐力[8]；低溫下植物凈光合速率、氣孔導度、蒸騰速率和胞間CO2濃度等指標的變化能夠反映植物光合器官受損程度，也與耐寒能力間有一定關系[9]。因此耐寒生理指標、植物光系統在低溫下的破壞程度都可以作為耐寒性評價的方法，但由于各生理指標對低溫敏感性差、實驗數據可重復性低等因素，使植物耐寒能力定量化評價變得尤為復雜。在油橄欖適應性育種工作中，有許多科研人員致力于研發可靠的油橄欖耐寒性評價技術，用于篩選耐低溫品種。地中海油橄欖主產區，M.Gómez 等人通過對10 個油橄欖品種越冬（-10.5 ～ -6.5 ℃）表現進行觀測，發現油橄欖嫩枝抗凍性與發芽能力呈線性相關[10]，品種間抗凍性存在顯著差異，品種‘Cornicabra’和‘Arbequina’低溫后嫩枝損傷率低，再生能力強，而‘Empeltre’、‘Frantoio’和‘Hojiblanca’耐寒性差。Cansev 等人研究了9 個油橄欖品種抗氧化酶的變化規律與耐寒性的關系，發現品種‘Domat’、‘Lecquest’、‘Ascolona’、‘Hojoblanca’和‘Gemlik’的組織通過增加過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）和還原型輔酶II（NADPH）等酶的活性來激活抗氧化系統和脫氫酶的表達，增強了低溫下細胞膜結構的穩定性，具有較強的耐寒能力[11]。在我國油橄欖作為引進樹種，許多研究人員期望通過耐寒性評價來獲得適合北亞熱帶高緯度、高海拔區域發展的品種，來擴大適生區。80 年代，在油橄欖適應性研究過程中，就發現葉片節間短、葉片厚而濃綠、葉緣反卷等葉片形態與耐寒性呈正相關[12]。近幾年，令凡等人也通過低溫脅迫試驗，對6 個油橄欖品種1 年生扦插苗耐寒能力的大小進行了評價，由強到弱依次為：‘Picholine’＞‘Pendolino’＞‘Leccino’＞‘Ascolana’＞‘Ez-8’＞‘Frantoio’，但是采用油橄欖離體植物葉片進行低溫脅迫試驗所評價耐寒能力大小與活體樣本有所偏差[5]。此外，低溫脅迫對光系統破壞與植物耐寒性的關系在甘蔗、油菜等植物中已有研究報道[13-14]，低溫不耐寒品種的光系統損傷較大，葉綠素熒光參數、葉綠素含量均明顯較耐寒品種低，但利用葉綠素熒光參數和氣體交換參數結合評價油橄欖耐寒性的研究方法比較少見。試驗以活體植株進行冷脅迫，以期揭示不同品種油橄欖幼苗膜系統、滲透調節物質、抗氧化酶系統、光系統對低溫脅迫的響應，評價不同油橄欖品種幼苗耐寒性，為篩選耐寒品種提供方法和依據。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為2 年生油橄欖無性系扦插苗，由油橄欖國家林木種質資源庫提供，地點位于甘肅省隴南市武都區兩水鎮段河壩村，地理坐標（104°47′59″～104°49′02″ E，33°23′45″～33°24′57″ N），屬于北亞熱帶半濕潤氣候，年平均氣溫14.9 ℃，絕對最高溫40 ℃，極端低溫-8.6 ℃，年日照1 911.7 h，無霜期150～270 d，年降水量474～900 mm，年平均濕度61%～71%，供試品種見表1（木質化程度基本一致）。

表1 供試油橄欖材料基本情況Table 1 Information of the test materials of olive seedlings

1.2 試驗處理

2021 年3 月，每個供試品種挑選健壯且長勢基本一致的30 株2 年生無性系扦插苗，盆栽于3 L容器中（肥水條件一致），至11 月中旬大田溫度降至20 ℃左右時，參照Ben-Ari[15]、Davide Guerra[16]等人冷脅迫方法，每個品種挑選21 株置于人工氣候室中，在22 ℃/18 ℃條件下適應14 d（光照時間為8:00—18:00，光照強度800 μmol·m-2·s-1、濕度50%～60%，溫度控制誤差為 ± 0.5 ℃），3 株作為對照（CK），其余18 株保持與之前相同的光強和光周期，以1 ℃·h-1降溫速度進行低溫處理，分別在達到16、12、8、4、0、-4 ℃時維持24 h，在各溫度脅迫結束前3 h 進行采樣和測試。

1.3 方法

脅迫結束前3 h 每個品種隨機選取3 株，每株選取枝條頂端至基部方向第2～4 對葉片中葉形、大小較為一致的3 片葉，進行光合和熒光參數測定。隨機摘取枝條頂端至基部方向第2～4 對葉片中5～6 片，根據李玲等[13]人的方法進行葉綠素含量（Chl）、可溶性糖（SS）、可溶性蛋白（SP）、脯氨酸（Pro）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等指標參數測定。

光合參數測定利用LI-6 400 便攜式光合作用分析系統；葉綠素熒光參數測定采用CF-imager 葉綠素熒光圖像分析儀進行離體測定；電導率用DDS-11A 型電導率儀測定。

1.4 數據處理

采用Excel 2010 整理數據和SPSS 23.0 進行數據處理，用Duncan 多重比較檢驗不同處理間的差異顯著性（ɑ=0.05），用origin2019 作圖。

2 結果與分析

2.1 相對電導率及半致死溫度（LT50）

如圖1a 所示，溫度從22 ℃降到0 ℃時，所有供試品種相對電導率逐漸增高，說明細胞膜透性緩慢增加，電解質在緩慢滲出。當溫度降低至-4 ℃時，‘柯基’、‘佛奧’、‘阿爾波薩納’和‘鄂植8 號’葉片相對電導率分別升高至76.63%、72.50%、73.27%和73.00%，說明其葉片細胞膜受損嚴重，而‘豆果’、‘皮瓜爾’、‘科拉蒂’和‘萊星’相對電導率均小于70%，細胞膜受到傷害較小。通過Logistic 方程對各品種不同處理溫度和葉片相對電導率進行擬合，確定了LT50。發現8 個油橄欖品種葉片相對電導率與半致死溫度間呈較強正相關，供試品種的LT50介于-16.359～-9.715 ℃之間表2，耐寒性排序如下：‘豆果’＞‘皮瓜爾’＞‘科拉蒂’＞‘萊星’＞‘佛奧’＞‘鄂植8 號’＞‘阿爾波薩納’＞‘柯基’。

圖1 低溫脅迫過程中8 個油橄欖品種生理指標變化Fig.1 The change characteristics of physiological indices in eight olive seedlings under low-temperature stress

表2 參試品種半致死溫度Table 2 Semi-lethal temperature of tested varieties

2.2 低溫脅迫下各品種油橄欖生理響應及耐寒性排序

2.2.1 生理指標響應

2.2.1.1 葉綠素含量的變化 8 個油橄欖品種葉片葉綠素含量隨溫度的下降而減少。從22 ℃降至-4 ℃，‘豆果’和‘皮瓜爾’的葉片葉綠素含量降幅較小，分別為18.31%和18.21%，而‘佛奧’和‘柯基’降幅最大，分別為26.88%和41.37%（圖1b）。

2.2.1.2 丙二醛含量的變化 ‘豆果’、‘皮瓜爾’、‘科拉蒂’和‘萊星’葉片丙二醛（MDA）含量總體低于其他品種，在低溫脅迫加劇的過程中呈先升高后降低的趨勢，都在0 ℃達到高峰。0 ℃降低至-4 ℃的過程中，‘柯基’和‘佛奧’降幅度最大，為20.60%和22.61%（圖1c）。

2.2.1.3 低溫脅迫下脯氨酸含量的變化 供試品種葉片脯氨酸含量隨著低溫脅迫加劇總體呈升高的趨勢，在-4 ℃均達到峰值，與0 ℃相比，‘皮瓜爾’增幅較大，為7.58%，而‘柯基’和‘佛奧’增幅較小，分別為0.46%和1.05%（圖1d）。

2.2.1.4 低溫脅迫下可溶性糖含量的變化 葉片可溶性糖含量隨著脅迫加劇總體呈升高趨勢，在-4 ℃達到峰值，‘豆果’可溶性糖含量顯著高于其他品種。在0～-4 ℃，‘柯基’和‘佛奧’的可溶性糖含量均有所下降，‘柯基’降幅明顯（圖1e）。

2.2.1.5 低溫脅迫下可溶性蛋白含量的變化 ‘豆果’可溶性蛋白含量顯著高于其他品種，葉片可溶性蛋白含量隨溫度降低而升高。-4 ℃脅迫下，‘皮瓜爾’的增幅最大，為54.14%，‘豆果’次之，而‘柯基’的增幅僅為1.67%，說明其受低溫影響較大（圖1f）。

2.2.1.6 SOD 活性的變化 隨著處理溫度的降低，各油橄欖品種葉片的SOD 活性總體呈先升高后降低的趨勢，同一品種在不同低溫脅迫下均存在顯著差異（P＜0.05）。在0 ℃均達到峰值，其中‘豆果’的SOD 活性最高，為235.19 U·g-1，‘科拉蒂’次之。與室溫CK相比，-4 ℃時，‘萊星’和‘科拉蒂’的增幅最大，‘豆果’次之，而‘柯基’和‘佛奧’增幅最小，分別為197.46%和193.70%（圖1g）。

2.2.1.7 POD 活性的變化 8 個油橄欖品種葉片的POD 活性隨著處理溫度的降低總體呈先升高后降低的趨勢。除‘鄂植8 號’在 -4 ℃達到峰值，而其余品種均在0 ℃達到峰值，0～-4 ℃活性降低，其中‘豆果’的POD 活性總體高于其他品種，而‘柯基’最小（圖1h）。

2.2.1.8 CAT 含量的變化 隨著處理溫度的降低，‘豆果’、‘皮瓜爾’、‘科拉蒂’和‘萊星’的CAT 活性均呈上升趨勢，在-4 ℃達到峰值，而‘鄂植8 號’、‘阿爾波薩納’、‘佛奧’和‘柯基’均呈先升高后降低的趨勢，在0 ℃達到峰值（圖1i）。

2.2.2 基于生理響應數據的耐寒性排序 以相對電導率、葉綠素含量、可溶性糖含量和可溶性蛋白質含量等9 個參數，計算各參數的平均隸屬函數值，并進行耐寒能力綜合評價，‘豆果’、‘皮瓜爾’、‘科拉蒂’和‘萊星’的平均隸屬函數值差異不顯著，但與其它品種之間存在顯著差異（P＜0.05）。8 個品種油橄欖耐寒性由強到弱見表3，依次為：‘豆果’＞‘皮瓜爾’＞‘科拉蒂’＞‘萊星’＞‘鄂植8 號’＞‘阿爾波薩納’＞‘佛奧’＞‘柯基’。

表3 低溫脅迫下8 種油橄欖幼苗測定指標的隸屬函數值Table 3 Membership function values of the eight olive seedlings under low-temperature stress

2.3 低溫脅迫對油橄欖光合熒光特性的影響

2.3.1 低溫脅迫對油橄欖幼苗光合氣體交換參數的影響 參試油橄欖品種在室溫下（22 ℃），各光合參數就有所差異（圖2）。隨著低溫脅迫加劇，參試油橄欖品種葉片凈光合速率（Pn）整體呈下降趨勢，-4 ℃與對照（CK，22 ℃）相比，‘皮瓜爾’降幅最小為84.79%，其他品種降幅都在90%以上。低溫脅迫過程中，氣孔導度（Gs）在4 ℃前整體呈下降趨勢，4 ℃與CK 相比，‘皮瓜爾’和‘科拉蒂’的降幅最小，分別較CK 下降了49.57%和78.37%；‘阿爾波薩納’降幅最大，達到96.02%。胞間CO2濃度（Ci）在8 個品種中呈現出不同的變化規律，-4 ℃時‘阿爾波薩納’和‘柯基’較CK 降低了5.36%和12.33%，其他品種都有所上升，其中‘佛奧’增幅最大為119.35%。隨著低溫脅迫的加劇，蒸騰速率（Tr）在-4 ℃出現明顯下降，相較于CK 各品種降幅基本一致，介于93.76%～96.80%。低溫加劇過程中氣孔限制值（Ls） 呈現先升后降再升的趨勢，增加時峰值集中出現在16 ℃和12 ℃， ‘皮瓜爾’和‘阿爾波薩納’增幅最大，分別為153.49%和137.04%（12 ℃）。水分利用效率（ WUE ）呈現先升后降再升的趨勢，再次上升的拐點溫度出現在4℃，相比對照‘阿爾波薩納’降幅最大為56.04%。

圖2 低溫脅迫過程中8 種油橄欖幼苗氣體交換參數的變化特征Fig.2 The change characteristics of gas-exchange parameters in eight olive seedlings under low-temperature stress

2.3.2 低溫脅迫對油橄欖葉綠素熒光參數的影響

由圖3 可見，在低溫脅迫下，8 個供試油橄欖品種的最大光化學效率（Fv/Fm）整體呈下降趨勢。-4 ℃時，‘鄂植8 號’較CK 降幅較小為33.26%，而‘柯基’較CK 降幅最大為50.55%。從16 ℃到4 ℃脅迫過程中，‘佛奧’和‘萊星’變化趨勢一致且較為緩和。

圖3 低溫脅迫過程中8 種油橄欖幼苗葉綠素熒光參數的變化特征Fig.3 The change characteristics of chlorophyll fluorescence parameters in eight olive seedlings under lowtemperature stress

經低溫脅迫，實際光化學效率（ΦPSⅡ）在0 ℃前變化趨勢較為緩和，0 ℃至-4 ℃出現明顯下降，‘阿爾波薩納’、‘豆果’、‘鄂植8 號’、‘佛奧’、‘萊星’和‘科拉蒂’、‘皮瓜爾’和‘柯基’降幅分別為63.20%、60.81%、56.70%、55.01%、62.15%、64.32%、60.35%、64.56%。

各參試品種的化學淬滅系數（qP）整體呈“W 形”趨勢，最低值出現在8 ℃和0 ℃，4 ℃時有上升趨勢，在-4 ℃時驟升出現峰值。‘阿爾波薩納’、‘豆果’、‘鄂植8 號’、‘佛奧’、‘萊星’和‘科拉蒂’、‘皮瓜爾’和‘柯基’增幅分別為24.35%、24.09%、24.35%、13.41%、29.77%、28.69%、23.24%、30.11%。

隨溫度脅迫的加劇，各供試油橄欖品種的非化學淬滅系數（NPQ）值在22 ℃至0 ℃變幅度不大，介于1.558～3.118，0 ℃至-4 ℃出現急劇下降，降低至0.05 左右。

2.3.3 基于光合及葉綠素熒光參數的耐寒性排序

采用隸屬函數法對8 個供試品種光合和葉綠素熒光參數的10 個指標進行耐寒性綜合評價。由表4可知，8 個油橄欖品種的平均隸屬度在0.41～0.71 之間，從隸屬函數綜合評價值可得出耐寒性依次為‘科拉蒂’＞‘豆果’＞‘柯基’＞‘鄂植8 號’=‘佛奧’=‘萊星’＞‘皮瓜爾’＞‘阿爾波薩納’。‘科拉蒂’的綜合評價值高達0.71，耐寒性最強；‘阿爾波薩納’的綜合評價值僅為0.41，耐寒性最差。

表4 低溫脅迫下8 種油橄欖幼苗測定指標的隸屬函數值（光合參數）Table 4 Membership function values of the eight olive seedlings under low-temperature stress (photosynthetic parameters)

3 討論

3.1 膜系統對低溫的響應

冷脅迫時，植物細胞中細胞膜最先受到傷害，導致細胞膜電解質外滲，且隨著傷害程度的增加，離子滲出率升高，利用相對電導率結合Logistic 曲線方程獲得植物的半致死溫度是一種有效且簡便的耐寒性評價方法，該方法已在金光杏梅、花椒、葡萄等諸多植物的耐寒性評價中得到應用[17-19]。本試驗中，隨著溫度從22 ℃降到0 ℃時，油橄欖葉片電解質在緩慢滲出（相對電導率35% 左右），當溫度從0 ℃降低到-4 ℃時，‘柯基’、‘佛奧’、‘阿爾波薩納’和‘鄂植8’號葉片相對電導率分別升高至76.63%、72.50%、73.27% 和73.00%，說明這4 個品種細胞膜受到傷害較大，而‘豆果’、‘皮瓜爾’、‘科拉蒂’和‘萊星’葉片相對電導率均在70%以下。通過Logistic 方程對不同品種的處理溫度和葉片相對電導率進行擬合，試驗中8 個油橄欖品種，半致死溫度（LT50）介于-16.359～-9.715 之間，‘豆果’耐寒性最好，‘柯基’最差，供試品種中‘萊星’、‘鄂植8 號’、‘佛奧’的耐寒性排序與令凡等人的研究結果一致[20]。

MDA 是植物脂膜過氧化的重要產物之一，積累會使脂膜在逆境中的損傷加劇[21]，通過比較MDA 含量及其變化程度，可以反映出8 個油橄欖品種在低溫中的受損程度。本研究中，8 ℃之后‘柯基’MDA 含量上升幅度顯著高于其它7 個品種，說明‘柯基’細胞膜氧化程度更大，符合半致死溫度以及耐寒性綜合評價結果。

3.2 滲透調節物質和抗氧化酶活性對低溫脅迫的響應

Chl、SS、SP、Pro、POD、SOD、CAT 等指標雖然都與植物耐寒性關系密切，但是由于植物是一個有機整體，遭受低溫脅迫而引起生理生化指標變化也是錯綜復雜的，因此用單一指標來評價植物耐寒性太過片面。當然，想要準確評價某一種植物耐寒性所應用的指標體系也有所不同，例如細胞膜系中不飽和脂肪酸的變化就不能用于評價蘋果(Malus pumilaMill.) 、 菜 薊 （Cynara scolymus）、西蕃蓮屬（PassifloraL.）植物的耐寒性；脯氨酸含量的累積無法用來評價柑橘屬植物的抗冷性。冷脅迫條件下，植物體內會積累大量超氧自由基，從而破壞植物膜系統，抗氧化酶系統可以清除超氧自由基，從而避免植物膜系統在冷害下遭到破壞[22]。本研究中，8 個油橄欖品種抗氧化酶活性隨著溫度的降低呈先上升后下降的趨勢，說明抗氧化酶系統在油橄欖耐低溫過程中作用明顯，但當溫度降低到0 ℃以下時，其抗氧化酶系統逐漸失去作用，從而導致活性降低。從本研究中抗氧化酶活性的上升幅度看，‘柯基’上升幅度均最小，說明抗氧化酶系統對低溫的響應最不敏感，這可能是導致‘柯基’耐寒性表現不佳的原因之一。相反，耐寒性表現良好的‘豆果’和‘皮瓜爾’等抗氧化酶活性的上升幅度更大。為克服單一指標在耐寒性鑒定中的不足，試驗采用8 個生理指標利用隸屬函數法對其耐寒性進行綜合評價，耐寒性強弱順序為：‘豆果’＞‘皮瓜爾’＞‘科拉蒂’＞‘萊星’＞‘鄂植8 號’＞‘阿爾波薩納’＞‘佛奧’＞‘柯基’。

3.3 光系統對低溫脅迫的響應

光系統的破壞程度也可以用來判定植物的耐寒性。隨著低溫脅迫加劇，‘鄂植8 號’和‘萊星’的qP呈下降趨勢，NPQ呈上升趨勢，說明低溫脅迫嚴重破壞了‘鄂植8 號’和‘萊星’的光合電子傳遞途徑，使得光合電子傳遞能力不斷降低，用于光化學反應的光能部分減少，而以熱形式耗散掉的光能部分不斷增加。但其熱耗散增加緩解了光抑制對其光合功能產生的破壞，增強了光合反應中心的穩定性，從而能減輕低溫脅迫對其葉片光合器官的損傷。本研究通過測定8 種油橄欖幼苗的光合及葉綠素熒光等相關指標，并利用隸屬函數法對其耐寒性做了初步評價，結果為：‘科拉蒂’＞‘豆果’＞‘柯基’＞‘鄂植8 號’=‘佛奧’=‘萊星’＞‘皮瓜爾’＞‘阿爾波薩納’。

3.4 耐寒性評價體系對比

低溫是限制油橄欖在我國北亞熱帶擴區發展的主要因素。研究油橄欖幼苗膜系統、滲透調節物質、抗氧化酶系統、光系統對低溫脅迫的響應，是低溫適應性品種選育至關重要的一步。從評價結果來看，電導率擬合半致死溫度評價方法和耐寒相關生理指標隸屬函數法評價結果接近，更符合各品種采樣區越冬情況。而以光合和葉綠素熒光指標體系的耐寒性評價方法與前2 種方法評價結果差異較大，可能與油橄欖葉片近軸表皮角質膜較厚，蠟質結晶致密，氣孔密度小等葉片重要形態特征有關[23]。因此評定油橄欖耐寒性時，需多方面綜合評價，同時結合田間觀察，才能使結果更加準確、科學。

4 結論

通過Logistic 方程擬合半致死溫度，滲透調節物質、保護酶活性參數，光合和葉綠素熒光參數等指標分析，對8 個油橄欖品種進行耐寒性評價，發現油橄欖幼苗膜系統、滲透調節物質、抗氧化酶系統、光系統對低溫脅迫的響應并不一致。滲透調節物質、保護酶活性參數隸屬函數法所得出耐寒性綜合排序與應用電導法配合Logistic 方程求出半致死溫度的排序基本一致，且符合各品種田間越冬表現，該方法更適合作為油橄欖苗期耐寒性評價方法。利用光合及葉綠素熒光參數10 個指標的隸屬函數評價方法，很難準確評價油橄欖苗期耐寒性，尤其是難以區分耐寒性差異較小的品種。