基于ROS-ASK1-JNK/NF-κB通路探討三才連梅顆粒調控2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝肝細胞凋亡水平的研究＊

王勝菊，秦 帥，郭銀雪，謝 恂，陳一丁，韓栩珂，高 陽，詹繼紅＊＊，陳 秋＊＊

（1.貴州中醫藥大學第一附屬醫院 貴陽 550001；2.成都中醫藥大學附屬醫院 成都 610072；3.陜西中醫藥大學針灸推拿學院 咸陽 712046）

糖尿病在全球范圍內迅速增長，其相關的并發癥及全因死亡風險也隨之增加[1-2]，并且伴隨代謝功能持續惡化，其中與代謝功能障礙密切相關的非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）已成為二十一世紀全球第一大慢性肝病[3]。NAFLD 是脂肪變性向脂肪性肝炎（Non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、肝硬化、甚至肝癌的觸發因素[4]。NAFLD 作為常見肝病常與2 型糖尿?。═ype 2 diabetes mellitus，T2DM）相伴發病。T2DM 合并NAFLD 進一步加大糖尿病控制難度及并發癥發病風險較單純T2DM 更高，易發生肝病不良進展，增加死亡風險[5]。

T2DM 高血糖狀態下使ROS（Reactive oxygen species）自由基產生過多，可代償性的增加糖及脂質代謝，從而使血糖進一步增高，加重胰島素抵抗及氧化應激反應[6-7]。脾虛是糖尿病胰島素抵抗的主要病機，脾虛可致痰濕、瘀血堆積體內，減弱胰島素在機體內的正常功能，促使糖脂代謝紊亂終致肝臟脂肪變性。脾氣虛弱，脾運化功能失職、土壅木塞，肝失疏泄，能導致肝臟內血脂升高，發展為脂肪肝。因此，T2DM 合并NAFLD 基本機制為脾氣虧虛。三才連梅顆粒（人參、天冬、生地、黃連、肉桂、烏梅）是由《溫病條辨》三才湯和長期臨床實踐衍化而來，具有益氣健脾、清胃熱、調中焦氣機、生津潤燥、滋陰降火的功效。盡管全方可針對T2DM 合并NAFLD 的基本病機而發揮治療作用，課題組前期臨床試驗也證實三才連梅顆?？捎行Э刂蒲呛驼{節血脂，降低炎癥因子（TNF-α、IL-6等）水平[2,8-10]、還可有效調節氧化應激因子（MDA、SOD）水平[11-12]。但其具體作用機制尚不清楚。

研究顯示ROS 可通過多種途徑介導細胞凋亡的發生[13]。其中，ROS 介導的ASK1-JNK/NF-κB 途徑是誘導肝細胞凋亡一個重要途徑[14-15]。因此，本研究在前期研究的基礎上，通過建立T2DM 合并NAFLD 的動物模型，用三才連梅顆粒進行干預，從動物層面探索三才連梅顆粒通過影響ASK1、JNK、NF-κB 等靶點來治療T2DM合并NAFLD的主要效應機制。

1 材料

1.1 藥物

三才連梅顆粒（質量控制由成都中醫藥大學附屬醫院藥劑科監督完成[16]，每克顆粒含1.475 g 生藥）。鹽酸二甲雙胍（陽性對照組用藥，成都恒瑞制藥有限公司，批號：國藥準字H20030952，商品名：倍順）。

1.2 實驗動物

SD 成年雄性大鼠50只，體質量（200±20）g，在21-25℃及40%-70%濕度環境下飼養，每天光照12 h，普通飼料適應性喂養1 周后，大鼠隨機分組（正常組n=10，造模組n=40）。

1.3 主要試劑

ELISA Kit、TP 測定試劑盒、T-SOD 測試盒、MDA測 定 試 劑 盒、RNA TRIzol Reagent、Bax、Bcl-2、caspase3、β-actin 抗 體；引 物 序 列：β-actin：上 游GAAGATCAAGATCATTGCTCC、下游TACTCCTGCTT GCTGATCCA；ASK1：上游GCTGTTGATAGACCACCGC TTCC、下游TGCCCTGTTCCTCTGCCTTCC；JNK：上游CCACCACCAAAGATCCCTGACAAGCA、下游ACGCCA TTATTAGTTCGCTCCTCCAA；NF-kB：上游TGGCTAC ACGGGACCAGGAACAGT、下游GGCTTGCTCCAGGT CTCGCTTCTT。

1.4 主要儀器

Western blot及IP細胞裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、酶標儀、實時熒光定量（RT-PCR）儀、透射電子顯微鏡、垂直電泳槽JY-SCZ4+、電泳儀JY200C。

2 實驗方法

2.1 糖尿病合并NAFLD大鼠模型制備

本次實驗在成都中醫藥大學附屬醫院倫理委員會監督下進行。造模組經8周的高脂高糖飼料喂養后按體質量一次性腹腔注射40 mg·kg-1的1% STZ 溶液，3 天后，測量尾靜脈血糖＞16.9 mmol·L-1則糖尿病合并NAFLD模型大鼠造模成功[17-18]。

2.2 動物分組及給藥

造模成功的大鼠隨機分為模型組、三才連梅顆粒組、陽性藥物組（n=10）。正常組：在同等條件下，正常普通喂養，不處置；模型組：同等條件下，給予等量蒸餾水灌胃；三才連梅顆粒組：同等條件下，予以三才連梅顆粒（每天4 g·kg-1，此劑量參考前期藥理學實驗得出[19-20]）進行干預，每天1 次，連續干預8 周；陽性藥物組：同等條件下，予以二甲雙胍（200 mg·kg-1）進行干預，每天1 次，連續干預8 周。實驗期間各模型組大鼠仍高脂高糖喂養。

2.3 標本的留取和血清指標的測定

各組大鼠干預8 周后，禁食不禁水過夜10 h，次日清晨，尾靜脈測0 min血糖。后以大鼠體質量2.0 g·kg-1予以腹腔注射50%葡萄糖后測15、30、60、120 min血糖。

實驗結束后，大鼠禁食8 h，腹主動脈采血，離心后將血清儲存于-20℃，并迅速分離出肝臟；采用Rat INS ELISA KIT測定大鼠INS濃度（實驗步驟按照試劑盒說明書進行操作）。ELISA 測定血清GHb（糖化血清蛋白）、血脂四項，ELISA 測定肝臟勻漿丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等指標（實驗步驟按試劑說明書進行操作），計算胰島素抵抗指數（HOMA-IR=FBG（空腹血糖，mmol·L-1）×FINS（空腹胰島素，pmol·L-1）/22.5）。取肝臟組織進行肝臟病理觀察。

2.4 Real-time PCR 檢測

肝組織總RNA 提取、逆轉錄、PCR 引物擴增。將得到的每個PCR 反應的Ct 值，用2-△△Ct值計算各組大鼠ASK1、JNK、NF-κB的相對表達量。

2.5 肝臟組織Western blot檢測

肝組織蛋白經過上樣、電泳、轉膜、孵育（一抗濃度：Bax 1∶5000；Bcl-2 1∶1000；caspase3 1∶2000；β-actin 1∶100000，4℃孵育過夜；二抗稀釋濃度：1∶5000，室溫孵育2-3 h）、顯影，進行圖像分析。

2.6 肝細胞TUNEL檢測

課題組采用TUNEL 法檢測肝臟組織切片中肝細胞凋亡情況，在顯微鏡下計數凋亡細胞個數，然后計算出每高倍鏡下平均凋亡細胞數并進行統計分析。

3 統計分析

通過SPSS 20.0 統計軟件進行數據均值±標準差（±s）分析，主要采用One-Way ANOVA 檢驗，多組比較事后分析采用SNK-q 檢驗，P＜0.05 認為差異有顯著性；肝臟病理觀察結果采用描述性分析。

4 結果

4.1 給藥后各組大鼠體質量、GHb、INS 及HOMA-IR的變化

因在喂養過程中大鼠有死亡及獲取標本過程中獲取失敗、標本污染等情況，最終選取各組大鼠合格標本各7 例（n=7）進行數據分析。如表1 所示：三才組與二甲雙胍組大鼠體質量、GHb、INS、HOMA-IR 值較模型組大鼠下降。

表1 給藥后各組大鼠體質量GHb、INS及HOMA-IR的變化（±s，n=7）

表1 給藥后各組大鼠體質量GHb、INS及HOMA-IR的變化（±s，n=7）

注：HOMA-IR 取其對數Ln（HOMA-IR）進行比較；與正常組相比，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別正常組模型組二甲雙胍組三才組體質量（g）245.0±27.4 375.2±37.5##320.5±39.5*322.2±46.3*GHb（ng·mL-1）39.1±4.4 52.3±6.3##42.5±8.9*43.0±6.0*INS（pmol·L-1）7.0±0.8 11.5±1.0##8.8±1.2**8.6±1.2**HOMA-IR 0.7±0.1 2.4±0.1##1.5±0.2**1.6±0.2**

4.2 各組大鼠腹腔葡萄糖耐量實驗（IPGTT）后血糖變化

如圖1 所示，模型組大鼠各時間點血糖高于正常組，說明模型大鼠存在葡萄糖耐量受損；三才連梅組與二甲雙胍組大鼠血糖波動曲線同正常對照組相似，各時間點血糖水平低于模型組（P＜0.01），說明三才連梅顆粒可改善T2DM合并NAFLD模型大鼠糖耐量。

圖1 各組大鼠IPGTT后血糖變化情況

4.3 各組大鼠血脂變化情況

如表2 所示，模型組大鼠甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平高于正常組（P＜0.01），高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平低于正常組（P＜0.01）；與模型組對比，三才組與二甲雙胍組大鼠TG、TC、LDL-C 水平下降，HDL-C 升高，其中三才連梅組大鼠血脂改善情況較二甲雙胍組更顯著。

表2 給藥后各組大鼠血脂情況（±s，n=7）

表2 給藥后各組大鼠血脂情況（±s，n=7）

注：與正常組相比，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別正常組模型組二甲雙胍組三才組血脂（mmol·L-1）HDL-C 1.2±0.3 0.6±0.1##0.9±0.3*1.0±0.2**TG 0.6±0.3 2.3±0.9##1.2±0.3**1.1±0.2**TC 1.5±0.4 2.5±0.7##1.6±0.4**1.3±0.2**LDL-C 0.4±0.1 1.1±0.4##0.9±0.3 0.7±0.3*

4.4 各組大鼠肝酶的變化情況

如表3 所示，模型組大鼠肝酶丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）水平較正常組明顯升高（P＜0.01）；藥物干預后，三才組與二甲雙胍組大鼠肝酶水平明顯下降（P＜0.01）。

表3 給藥后各組大鼠肝酶變化情況（±s，n=7）

表3 給藥后各組大鼠肝酶變化情況（±s，n=7）

注：與正常組相比，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

AST（U·L-1）91.5±11.8 195.5±23.7##114.4±35.1**105.4±15.2**組別正常組模型組二甲雙胍組三才組ALT（U·L-1）55.6±12.1 116.5±13.7##87.0±7.8**73.4±12.6**

4.5 各組大鼠肝臟炎癥指標變化情況

如表4所示：模型組肝臟組織IL-1β、IL-6、TNF-α濃度高于正常組（P＜0.01），說明模型大鼠肝臟組織存在明顯炎癥反應；經過藥物干預后，二甲雙胍組和三才連梅顆粒組大鼠肝臟組織IL-1β、IL-6、TNF-α 濃度與模型組比明顯降低（P＜0.01）。

表4 給藥后各組大鼠肝臟炎癥指標情況（±s，n=7）

表4 給藥后各組大鼠肝臟炎癥指標情況（±s，n=7）

注：與正常組相比，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別正常組模型組二甲雙胍組三才組IL-1β（pg·mL-1）5.8±0.4 7.6±0.7##6.4±0.8**6.0±0.4**IL-6（pg·mL-1）21.6±0.8 26.7±1.9##22.7±1.5**22.1±1.7**TNF-α（pg·mL-1）51.1±4.0 65.8±5.0##54.8±3.4**52.6±2.5**

4.6 各組大鼠肝臟氧化應激產物指標變化情況

如圖2 所示：模型組大鼠SOD 濃度低于正常組，MDA 高于正常組（P＜0.01）；藥物治療組（三才組、二甲雙胍組）大鼠SOD 濃度較模型組升高，MDA 濃度下降（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠肝臟SOD、MDA指標變化情況

4.7 各組大鼠肝臟組織病理觀察結果

如圖3所示：正常組肝臟組織完整正常，模型組可見肝細胞空泡變性或脂肪變性及脂滴；與模型組對比，三才組可見少許脂滴及細胞空泡變性，二甲雙胍組可見些許脂滴。

圖3 大鼠肝臟組織病理變化（HE染色，×100）

4.8 各組大鼠肝組織中ASK1、JNK、NF-κB mRNA 表達情況

如圖4 所示，模型組大鼠肝臟組織ASK1、JNK、NF-κB mRNA 表達較正常組明顯升高（P＜0.05），三才連梅顆粒組大鼠肝臟組織ASK1、JNK、NF-κB mRNA表達明顯下降（P＜0.05）。

4.9 各組大鼠肝臟組織中凋亡蛋白表達情況

如表5 所示，模型組大鼠肝臟組織中Bax、caspase-3表達升高，Bcl-2表達下降；三才連梅組Bax、caspase-3表達下降，Bcl-2表達升高，見圖5。

表5 各組大鼠肝臟組織中凋亡蛋白Bax、Bcl-2、caspase3的表達（±s，n=7）

表5 各組大鼠肝臟組織中凋亡蛋白Bax、Bcl-2、caspase3的表達（±s，n=7）

注：與正常組相比，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別正常組模型組二甲雙胍組三才組Bax/β-action 1.0±0.0 1.4±0.1##1.2±0.3 1.1±0.3*caspase3/β-action 1.0±0.0 1.6±0.3##1.3±0.1**1.2±0.2**Bcl-2/β-action 1.0±0.0 0.6±0.0##0.8±0.1**0.9±0.2**

4.10 三才連梅顆粒對肝細胞凋亡的影響

如圖6所示，模型大鼠存在顯著肝細胞凋亡情況。經過三才連梅干預后，模型大鼠肝細胞凋亡情況顯著改善。

圖6 各組大鼠肝臟組織各凋亡蛋白表達

5 討論

本實驗結果提示經過高脂喂養后模型組大鼠體質量明顯高于正常組，檢測模型組大鼠血脂也是高于正常組，肝臟組織病理學觀察提示模型組大鼠肝臟存在明顯脂肪變性及炎癥改變。檢測模型大鼠糖耐量結果提示模型大鼠存在明顯糖耐量異常，與血清胰島素水平升高情況相符，提示模型組大鼠存在胰島素抵抗。同時，模型組大鼠肝酶明顯高于正常組，提示模型大鼠存在肝損傷。以上結果說明，高脂飲食喂養加小劑量STZ 腹腔注射，T2DM 合并NAFLD 大鼠模型建立成功。本研究通過此研究進一步證實三才連梅顆粒可有效改善模型大鼠糖脂代謝紊亂，改善胰島素抵抗，此結果與課題組前期研究結果一致[9,11-12]。

在糖尿病機體各種組織中，氧化反應增強，產生過量的ROS[21]。在此過程中，機體促氧化因子MDA 增加，抗氧化因子SOD 消耗。該研究通過檢測肝臟勻漿MDA和SOD濃度來反應肝臟組織氧化應激情況，間接反應ROS 的生成情況。研究結果顯示，模型組大鼠肝臟組織SOD 濃度與模型組對比顯著下降、而MDA 濃度明顯升高，說明模型大鼠肝臟氧化應激反應明顯增強，提示ROS 生成增多；藥物干預后，三才組大鼠肝臟組織SOD 濃度與模型組對比明顯上升，而MDA 水平明顯下降，說明三才連梅顆?？捎行Ц纳颇Ｐ痛笫蟾闻K氧化應激。

ROS 通過激活多種信號通路介導炎癥反應及細胞凋亡。其中，凋亡信號調節激酶1（ASK1）級聯通路主要以ROS 依賴的方式被激活，進一步激活其下游信號通路MAPK 的磷酸化，從而啟動JNK 信號通路[22]，致使JNK持續激活，參與NAFLD的發生發展。有研究表明機體在各種應激狀態下ASK1-JNK的持續激活可介導線粒體依賴途徑的細胞凋亡[23]。機體應激狀態下損害NF-κB 通路的相關調節機制，促進炎癥因子（IL-6、IL-1β、TNF-α 等）的釋放，使機體發生持續低度炎癥，參與肝臟炎癥、脂肪變性及纖維化[24-25]。動物實驗發現NF-κB 的過度激活在肝臟持續的炎癥反應、肝臟胰島素抵抗及肝臟脂肪變性等病理過程中發揮著重要作用[26-27]。本研究結果也證實，模型組大鼠體肝臟組織內ASK1、JNK、NF-κB 表達均顯著上調，相關炎癥因子水平升高，出現非酒精性脂肪性肝炎表現（ALT、AST 升高）；正常組大鼠無此變化。提示機體在氧化應激增強情況下，ASK1-JNK/NF-κB通路被激活，促使肝臟炎癥反應增強。在此過程中，肝臟細胞自我調節機制受損，促使肝細胞凋亡增加。而藥物干預后，ASK1-JNK/NFκB通路可被抑制，從而減輕肝臟炎癥反應。

細胞凋亡作為機體的一種自我調節機制之一[28-29]，受到多種相關基因的調控，其中Bcl-2、Bax、caspase-3 是調節細胞凋亡最重要的基因[30]。本研究通過檢測肝細胞Bcl-2、Bax、caspase-3 基因的表達來反應肝細胞凋亡情況。本研究Western blot結果顯示，模型組大鼠促凋亡蛋白Bax、caspase-3 的表達是上調的，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達是下調的。說明T2DM合并NAFLD 大鼠機體內肝細胞凋亡增加。經過藥物干預后，治療組大鼠Bax、caspase-3 蛋白明顯下降，而Bcl-2 蛋白表達明顯升高，TUNEL 結果進一步證實藥物干預后肝細胞凋亡減輕。說明三才連梅顆粒可調節模型大鼠肝細胞凋亡蛋白的表達，抑制肝細胞凋亡。因此，課題組推測三才連梅顆粒可通過抑制ROS-ASK1-JNK/NF-κB 通路來調節細胞凋亡而防止或逆轉NAFLD病程進展。

中醫藥多成分、多靶點和副作用低等特點，是近年來臨床和科學研究的熱點。三才連梅顆粒是由《溫病條辨》經典方劑“三才湯”和長期臨床實踐衍化而來。由人參、天冬、生地、黃連、肉桂、烏梅組成。方中人參，補益脾氣，鼓動津液輸布運行，滋養機體。天冬，甘苦，養陰益胃生津、滋腎降火。生地黃，養陰生津，本品又補腎水真陰，伍與人參金水相生。黃連，清熱燥濕解毒，其燥濕，利于脾氣健運，化痰除濕；解毒，利于瘀毒、濁毒等的排出；瀉火，清心火以解渴除煩。烏梅伍與人參，取其酸甘化陰之效，増強養陰益氣、生津止渴之效。方中黃連量大味苦，與烏梅之酸，苦酸相配，可增收斂氣陰之效。肉桂為佐使之用，溫經通脈，使氣機調暢，補而不滯，滋陰又兼升陽。全方肉桂之用，亦能制約天冬、黃連、生地黃的苦寒之性，溫補腎陽，寓意“陽中求陰”。黃連配肉桂，可得水火既濟之效。因久病傷津耗氣損陽。因此，全方針對T2DM合并NAFLD“脾氣虧虛”的基本病機，以“健脾益氣、兼養陰清熱、化痰除濕”為主要治法，輔以溫通，調和陰陽，兼顧五臟而發揮治療作用。

本研究通過肝臟研究三才連梅顆粒在改善T2DM合并NAFLD 胰島素抵抗及氧化應激中的相關機制靶點。課題組通過高脂高糖飲食+STZ 誘導T2DM 合并NAFLD 大鼠模型。T2DM 合并NAFLD 大鼠模型誘導成功后，大鼠分為四組，分別予不同的干預方式。干預8周后，比較T2DM合并NAFLD各相關指標的變化。結果發現：三才連梅顆粒可減輕T2DM 合并NAFLD 模型大鼠體質量；改善模型大鼠葡萄糖耐量受損、胰島素抵抗、血脂代謝紊亂及脂肪性肝炎，同時改善模型大鼠肝臟氧化應激，從而保護肝臟功能，改善肝臟脂肪變性。本研究還發現三才連梅顆?？赏ㄟ^下調ASK1、JNK、NF-κB mRNA 表 達，調 節T2DM 合 并NAFLD模型大鼠肝細胞凋亡水平，保護肝臟功能。

綜上，課題組初步證實，三才連梅顆粒通過干預ROS-ASK1-JNK/NF-κB 信號軸調節肝細胞凋亡而發揮改善T2DM 合并NAFLD 大鼠脂肪肝性肝炎及氧化應激反應，逆轉或減輕NAFLD進展。