基于藥效成分比較研究山萸肉酒制前后分別配伍入六味地黃湯對絕經后骨質疏松癥模型大鼠的干預作用＊

文 枝，于 慧，龍 瓊，譚佳穎，黃 莉，肖望重，戴 冰＊＊

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院 長沙 410007；2.祁陽市中醫醫院 永州 426100）

絕經后骨質疏松癥（Postmenopausal osteoporosis，PMOP）為骨質疏松癥中最為常見的一種，主要病因是由女性絕經后導致的雌激素水平下降[1-2]，一般發生在女性絕經后5-10 年。研究表明，女性絕經3 年內骨量下降速度明顯加快[3]，對絕經后骨量減少婦女進行早期干預，減緩骨量丟失，可有效延緩骨質疏松的發生發展，對于防治PMOP 意義重大，這與中醫歷來重視“治未病”思想不謀而合。

PMOP 歸屬為中醫“骨痿”的范疇，女子七七，任脈虛，腎精不足，是以骨髓生化乏源，骨骼失養，易發骨痿，即PMOP[4-5]。其主要病因為腎虛精虧，治法當以補腎益精為主。六味地黃湯為補腎益精經典方，其中的山萸肉為六味地黃湯之臣藥，2020 版《中國藥典》以其酒制品即酒萸肉入該方（簡稱六（酒）），但為何從其眾多炮制品中從選擇酒萸肉缺少實驗依據。本課題組前期研究發現[6-7]，該方對PMOP 模型大鼠骨亞健康狀態的早期干預作用可延緩PMOP 發生發展，（六酒）術后90 天對骨密度（Bone mineral density，BMD）對骨密度的改善作用優于六（山）；但其機理是否與其藥效成分有關？仍有待進一步研究。

因此，本實驗擬建立雙波長HPLC 法、比較研究山萸肉酒制前后配伍入六味地黃湯中藥效成分含量差異；同時，去卵巢法制備PMOP 大鼠模型，觀察POMP模型大鼠術后90天血清雌激素（E2）、鈣（Ca）、磷（P）、骨密度（BMD）值，臟器指數，體質量和骨組織微結構影響，探究山萸肉酒制前后配伍入六味地黃湯干預PMOP模型大鼠作用及其藥效物質基礎差異，為2020版藥典選用酒萸肉配伍入六味地黃丸提供一定實驗依據。

1 材料

1.1 實驗動物

6-8 月齡未孕雌性SD 大鼠（SPF 級）25 只，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2019-004，分籠飼養于湖南中醫藥大學實驗動物中心。本實驗由湖南中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準，符合實驗動物倫理委員會指導原則。

1.2 試藥及儀器

山萸肉，熟地，山藥，丹皮，澤瀉，茯苓（以上飲片均購于湖南春可回中藥飲片有限公司，由湖南中醫藥大學第一附屬醫院張裕民教授鑒定），酒萸肉自制（取山萸肉飲片：黃酒=100 kg:30 kg 拌勻，悶潤30 min 后，置于蒸具內隔水蒸360 min，取出，室溫干燥即可得紫黑色或黑色酒萸肉飲片。）；莫諾苷標準對照品（批號：11640-201808，中國食品藥品檢定研究院）；馬錢苷標準對照品（批號：111998-201703，中國食品藥品檢定研究院）；獐牙菜苷標準對照品（批號：DST200310-014，成都普思生物科技股份有限公司）；芍藥苷標準對照品（批號：110736-201943，中國食品藥品檢定研究院）；5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethyl furfural，5-HMF）標準對照品（批號：DST191211-056，成都普思生物科技股份有限公司）；丹皮酚標準對照品（批號：110708-201908，中國食品藥品檢定研究院）；沒食子酸標準對照品（批號：DST200710-008，成都普思生物科技股份有限公司）；阿侖膦酸鈉片（云南萬裕藥業有限公司，國藥準字號：J20130085）；E2診斷試劑盒（化學發光微粒子免疫檢測法，雅培愛爾蘭診斷公司，批號：H10192R01）等；

Agilent 1260 infinity Ⅱ型高效液相色譜儀（G7111A 四元泵、G7117C DAD 檢測器、G7129A 自動進樣器、美國安捷倫公司）；電子分析天平（日本SHIMADZU 公司）；雙能X 線骨密度儀（意大利LACN）；光學顯微鏡（日本Olympus）；石蠟切片機（中國Thermo Secientific公司）等。

2 方法

2.1 六（山）、六（酒）中藥效成分含量測定

2.1.1 色譜條件

流動相：乙腈（B）-0.3%磷酸（D）梯度洗脫（0-7 min，0%→8% B；7-15 min，8%→10% B；15-20 min，10%→15% B；20→30 min，15%→23% B；30→50 min，23%→45% B），流速0.6 mL·min-1，柱溫30℃，進樣量20 μL，檢測波長：240 nm（莫諾苷，馬錢苷，獐芽菜苷，芍藥苷），274 nm（沒食子酸，5-HMF，丹皮酚），溶劑空白液對圖譜無干擾，供試品各溶液色譜圖中，各峰分離度均大于1.5，色譜條件適應性良好。

2.1.2 溶液制備

（1）供試品溶液的制備：分別取六（山），六（酒）粉末（熟地：山萸肉：山藥：丹皮：澤瀉：茯苓=8∶4∶4∶3∶3∶3，下同）2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密移取25 mL 50%甲醇溶液，稱重，超聲提取40 min 后冷卻，再次稱重，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，濾液過0.45 μm 濾膜，取續濾液，即得供試品溶液。

（2）對照品溶液的配制：分別精密稱定莫諾苷、馬錢苷、獐牙菜苷、芍藥苷、沒食子酸、5-HMF、丹皮酚對照品適量，置25 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容成 質 量 濃 度 分 別 為0.7152、0.6495、0.531、0.6852、0.5092、0.6508、0.8270 mg·mL-1的對照品母液，置于4℃冰箱備用。分別精密吸取上述母液1.2 mL，置于10 mL容量瓶中，定容，即得混合對照品溶液。質量濃度分別為61.1、78.1、57.2、31.2、63.7、54.8、99.2 μg·mL-1。

2.1.3 方法學考察

（1）線性關系考察：精密移取莫諾苷，馬錢苷，獐芽菜苷及芍藥苷對照品母液各0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL分別置于同一10 mL溶液瓶中；精密移取沒食子酸，5-HMF 及丹皮酚對照品母液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL分別置于另一10 mL溶液瓶，加50%甲醇稀釋至刻度，得不同濃度梯度混合對照品溶液，按“2.1.1”項色譜條件進樣。以峰面積（Y）為縱坐標，進樣濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標進行線性回歸。沒食子酸、5-HMF、莫諾苷、馬錢苷、獐牙菜苷、芍藥苷、丹皮酚的線性方程分別為y=103.94x+70.33(R=0.9996)、y=179.88x+98.76 (R=0.9995)、y=51.46x+8.04(R=0.9993)、y=49.04x-1.08(R=0.9990)、y=41.60x+1.32(R=0.9990)、y=30.68x+4.06(R=0.9999)、y=133.19x+85.36(R=0.9993)。結果表明，沒食子酸、5-HMF、莫諾苷、馬錢苷、獐牙菜苷、芍藥苷、丹皮酚在測定濃度范圍內線性關系良好。

（2）精密度考察：精密移取莫諾苷、馬錢苷、獐牙菜苷、芍藥苷、沒食子酸、5-HMF、丹皮酚混合對照品溶液，相同色譜條件測定，進樣量20l，平行測定6 次，測定峰面積，得RSD 分別為1.35%、1.71%、1.38%、2.00%、0.68%、1.36%、1.24%，可知RSD≤2.00%，表明此儀器精密度較好。

（3）穩定性考察：同一份供試品溶液，分別放置0、2、4、6、8、24 h，相同色譜條件分別進樣，測定莫諾苷、馬錢苷、獐牙菜苷、芍藥苷、沒食子酸、5-HMF、丹皮酚峰面積，得RSD 分別為1.06%、1.27%、1.45%、1.17%、1.62%、1.42%、1.41%，可知RSD≤2.00%，表明供試品放置24 h內基本穩定。

（4）重復性實驗：取同一份六味地黃湯樣品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項色譜條件分別進樣，測定莫諾苷、馬錢苷、獐牙菜苷、芍藥苷、沒食子酸、5-HMF、丹皮酚峰面積，計算其含量，得各成分含量RSD 分別為1.57%、1.38%、0.48%、0.34%、0.52%、1.58%、0.33%，可知RSD≤2.00%，表明本方法重復性較好。

（5）加樣回收率實驗：取已知莫諾苷、馬錢苷、獐牙菜苷、芍藥苷、沒食子酸、5-HMF、丹皮酚含量的六味地黃湯樣品粉末1 g，精密稱定，平行稱取6 份，每份加入等量混合對照品溶液，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項色譜條件分別進樣，測定峰面積，并計算平均回收率與RSD 值，結果見表1，表明該方法準確度較高。

表1 六味地黃湯中七種藥效成分平均回收率及RSD

表2 六（山）及六（酒）中7種有效成分含量（±s，n=6）

表2 六（山）及六（酒）中7種有效成分含量（±s，n=6）

注：方差分析，與六（山）組比較，fP＜0.05。

7種成分總量（mg·g-1）5.77±0.09 6.13±0.06f組別六（山）六（酒）莫諾苷1.72±0.03 1.54±0.02f馬錢苷（mg·g-1）1.13±0.01 1.13±0.01獐牙菜苷（mg·g-1）0.10±0.01 0.11±0.01芍藥苷（mg·g-1）0.96±0.02 0.97±0.02沒食子酸（mg·g-1）0.45±0.01 0.64±0.03f 5-HMF（mg·g-1）0.05±0.01 0.36±0.01f丹皮酚（mg·g-1）1.37±0.01 1.38±0.01

2.1.4 六（山）、六（酒）中七種藥效成分含量測定

分別取六（山）及六（酒）供試品粉末，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項色譜條件分別進樣，平行進樣6次，分別得六（山），六（酒）HPLC圖譜及各藥效成分的峰面積，記錄并分別計算六（山），六（酒）中七種藥效成分含量。

2.2 動物實驗

2.2.1 藥液制備

六味地黃湯（熟地黃24 g、山萸肉（酒或生）12 g、山藥12 g、牡丹皮9 g、澤瀉9 g、茯苓9 g），6 倍量水浸泡30 min 后武火煮沸，后文火再煎30 min，趁熱過濾，重復煎煮兩次，合并濾液后用旋轉蒸發儀濃縮，得生藥濃度為1.125 g·mL-1藥液，4℃冰箱保存備用。

2.2.2 分組

所有大鼠編號、稱重后采用隨機數字表法將大鼠隨機分為5組，每組大鼠5只，即假手術組（K組），模型組（M 組），陽性藥物阿侖膦酸鈉片組（Y 組），六（山）組（LS組）和六（酒）組（LJ組）。

2.2.3 造模

適應性喂養1周后，行去卵巢術，禁食不禁水24 h，腹腔注射1%的戊巴比妥鈉；麻醉成功后，大鼠俯臥位固定，脫毛并消毒后，于雙側肋后緣切縱形切口，順Y形子宮一側向遠端探查，找到梅花狀的卵巢后摘除，止血后還納入腹腔，另一側操作同（注：假手術組暴露卵巢后，取鄰近卵巢大小的脂肪組織切除）。術后肌注10萬單位青霉素鉀以預防感染，連續3天。術后24 h，大鼠恢復正常飲食。

2.2.4 給藥

造模手術完成后，于術后第5天開始灌胃給藥。Y組（6.3 mg·kg-1），LS組（6.75 g·kg-1）和LJ組（6.75 g·kg-1）分別灌胃給藥相應的劑量藥物，K 組、M 組大鼠給予等體積水灌胃（煎藥用水）。每日1 次，給藥后每周稱量體質量1次，并根據各組大鼠體質量調整給藥量，持續給藥90天。

2.2.5 標本采集

5 個實驗組分別于術后90 天取大鼠5 只，禁食不禁飲24 h，稱重后以4%戊巴比妥鈉麻醉，用碘伏消毒手術部位，脫毛開腹，腹主動脈采血后，取大鼠子宮、心、肝、脾以及雙腎稱重，并剝離大鼠兩側股骨（保留骨膜）。血液靜置2 h 后，以3500 r·min-1離心15 min，移液槍移取上層澄清血清并置于-80℃保存；取每只大鼠右側股骨頭，4%多聚甲醛固定48 h，用于HE 染色，左側股骨與剩余右側股骨置于-80℃冰箱保存備用。

2.2.6 指標檢測

（1）PMOP 模型大鼠骨組織HE 染色：取“2.2.5”項下4%多聚甲醛固定股骨頭，10% EDTA 慢脫脫鈣液對骨組織脫鈣處理，每5 天換1 次脫鈣液，至骨組織變軟針刺可入且無阻力感則表示脫鈣完成。脫鈣完全后取出股骨頭，PBS沖洗后進行骨組織脫水，二甲苯透明處理，石蠟包埋，切片（厚度：2-4 mm），HE 染色，光鏡下觀察股骨頭形態改變。

（2）PMOP 模型大鼠的血鈣、磷以及血清E2 測定：使用全自動生化儀檢測模型大鼠血清中的Ca、P水平，采用化學發光免疫分析法檢測血清中的E2。

（3）PMOP 模型大鼠BMD 值測定：從-80℃冰箱取模型大鼠左側股骨，除去肌肉、筋膜等并用紗布包裹置于離心管中，由湖南中醫藥大學第一附屬醫院骨密度室進行測量。

（4）PMOP 模型大鼠的臟器指數以及體質量測定：每周測:1 次大鼠體質量，記錄體質量變化。除去模型大鼠心、肝、脾、雙腎以及子宮的脂肪組織，稱重。臟器指數=模型大鼠器官（子宮、心、脾、肝、腎）重量（g）/模型大鼠處死前體質量（g）×100%

2.2.7 統計學分析

采用SPSS 25.0 統計軟件進行統計分析，所有數據用均值±標準差（±s）表示，PMOP 模型大鼠體重數據為多時點重復測量分析，采用兩因素重復測量方差分析法；六味地黃湯中七種藥效成分含量和PMOP模型大鼠血清中E2、血磷、血鈣水平、骨密度及子宮指數，數據進行正態性、方差齊性檢測，滿足采用單因素方差分析法，組間比較采用LSD-t檢驗。不滿足則用非參數檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。實驗過程中，由于術后感染、實驗操作不當等原因，部分組大鼠出現死亡現象，除去離群值后，每組大鼠計4 只。

3 結果

3.1 六（山），六（酒）中七種藥效成分含量測定

可知，六（山）、六（酒）中均含有莫諾苷、馬錢苷、獐牙菜苷、芍藥苷、沒食子酸、5-HMF、丹皮酚7種有效成分，且六（酒）中七種有效成分的總含量高于六（山）（P＜0.01），其中，六（酒）沒食子酸、5-HMF 含量較六（山）高，而莫諾苷含量較六（山）低（P＜0.01）見圖1。

圖1 混合對照品（A）、山萸肉入方的六味地黃湯（B）酒萸肉入方的六味地黃湯（C）、HPLC圖譜

3.2 PMOP大鼠模型的評價

術后90天，與K組比較，M組大鼠的BMD值，以及血清中E2、Ca、P 水平較低（P＜0.01），結果見表3-4；骨組織結構不完整，骨小梁排列稀疏，部分骨小梁斷裂，骨髓腔內可見大量脂肪細胞，見圖2，提示造模成功。

圖2 HE染色觀察六味地黃湯對PMOP模型大鼠術后90天股骨微結構變化（x100）

表3 六味地黃湯對PMOP模型大鼠術后90天血清中E2、BMD的影響（±s，n=4）

表3 六味地黃湯對PMOP模型大鼠術后90天血清中E2、BMD的影響（±s，n=4）

注：方差分析，與K組比，dP＜0.05；與M組比，eP＜0.05；與LS組比，fP＜0.05。

BMD（g·cm-2）0.29±0.01 0.18±0.02d 0.23±0.01de 0.23±0.02de 0.26±0.02def組別K組M組Y組LS組LJ組劑量--6.3 mg·kg -1 6.75 g·kg -1 6.75 g·kg -1 E2（pg·mL-1）11.6±1.14 5.50±1.29d 9.00±1.39e 7.50±1.29de 9.25±0.96def

3.3 六味地黃湯對PMOP 模型大鼠術后90 天股骨微結構的影響

光鏡下觀察可知，術后90 天，脂肪細胞明顯增多且骨小梁數量減少，間隙增大，骨微結構惡化最為嚴重。與模型組比較，LS，LJ 組脂肪空泡較少見，或骨小梁排列較為整齊，間隙變大和斷裂情況較少，但六（山）、六（酒）組無明顯區別。

3.4 六味地黃湯對PMOP 模型大鼠術后90 天血清中的E2水平、BMD的影響

與M 組比較，術后90 天，LS 組及LJ 組E2 水平、BMD 值明顯升高（P＜0.01)，且LJ 組＞LS 組（P＜0.05），結果見表3。提示六味地黃湯可有效升高PMOP 模型大鼠血清E2 水平、有效減少大鼠去卵巢后的骨量丟失，升高PMOP模型大鼠BMD值，LJ療效優于LS。

3.5 六味地黃湯對PMOP 模型大鼠術后90 天的Ca、P水平的影響

與M 組比較，術后90 天，LS 及LJ 組PMOP 模型大鼠血清Ca、P 水平均明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），結果見表4。提示六味地黃湯可有效升高PMOP 模型大鼠血清Ca、P水平。

表4 六味地黃湯對PMOP模型大鼠術后90天的血清中Ca、p水平的影響（±s，n=4）

表4 六味地黃湯對PMOP模型大鼠術后90天的血清中Ca、p水平的影響（±s，n=4）

注：方差分析，與K組比，dP＜0.05；與M組比，eP＜0.05；與LS組比，fP＜0.05。

血磷（mmol·L-1）1.21±0.02 0.91±0.03d 1.22±0.01de 1.26±0.01de 1.25±0.02de組別K組M組Y組LS組LJ組劑量--6.3 mg·kg -1 6.75 g·kg -1 6.75 g·kg -1血鈣（mmol·L-1）2.08±0.04 1.82±0.05d 2.07±0.05e 2.01±0.04de 2.05±0.02de

表5 六味地黃湯對PMOP模型大鼠術后90天的子宮指數影響（-x s，n=4）

3.6 六味地黃湯對PMOP 模型大鼠術后90 天的臟器指數的影響

術后90 天，LS 及LJ 組大鼠子宮指數均高于M 組（P＜0.05），LJ 組大鼠肝，脾指數高于M 組（P＜0.05）；但LS、LJ組大鼠的心、腎指數變化無統計學意義；結果見圖3、表2。提示去卵巢術對大鼠子宮的形態和功能的影響較大，六味地黃湯可延緩PMOP 模型大鼠雌激素缺乏引起的子宮萎縮，改善其肝、脾功能。

圖3 六味地黃湯干預對術后90天模型大鼠子宮形態影響

3.7 六味地黃湯對PMOP 模型大鼠術后90 天的體質量影響

采用兩因素重復測量的方差分析法研究六味地黃湯對大鼠體質量的影響，由圖4可知，隨著術后時間的延長，除空白組外，各組大鼠體質量均呈上升趨勢，且以模型組最為明顯；但六味地黃湯對PMOP 模型大鼠的體質量影響無顯著性差異。

圖4 六味地黃湯對PMOP模型大鼠體質量的影響

4 討論

目前研究表明，山萸肉主含有機酸，環烯醚萜苷及苷元、多糖等成分[8-10]，其中沒食子酸、5-HMF、莫諾苷、馬錢苷、獐牙菜苷均有一定的抗骨質疏松作用，可能與沒食子酸可明顯增強成骨細胞堿性磷酸酶活性，促進成骨細胞增殖分化有關[11]；5-HMF 可刺激礦化結節的形成，促進成骨細胞增殖分化[12-13]，莫諾苷可減輕骨丟失并改善骨微結構[14]，莫諾苷、馬錢苷、獐牙菜苷均明顯表現出對大鼠成骨細胞的促增殖作用[15-18]有關；但其炮制后配方入六味地黃丸后對上述成分影響較大[19-20]。六味地黃湯中丹皮的主要藥效成分之一的丹皮酚可激活Wnt2/β-catenin 通路，增加去卵巢大鼠椎骨骨密度，減輕PMOP[21]；Tsai 等[22]發現丹皮酚抑制破骨細胞分化因子誘導的破骨細胞生成、抑制骨吸收；楊立宇等[23]研究發現芍藥苷能通過上調成骨分化基因，促進成骨分化，改善骨質疏松模型小鼠的骨微結構，從而發揮抗骨質疏松作用。可見，山萸肉酒制前后配伍入六味地黃湯中均含有上述7 種藥效成分，且均與骨質疏松癥及其機理相關。

本研究發現，山萸肉酒制前后配伍入方六味地黃湯后均含有莫諾苷、馬錢苷、獐牙菜苷、芍藥苷、沒食子酸、5-HMF 以及丹皮酚7 種藥效成分，可在絕經早期即可有效干預PMOP，從而延緩PMOP 發生發展；且酒萸肉入方的六味地黃湯抗骨質疏松作用優于山萸肉入方的六味地黃湯，其機制可能與六（酒）中7 種有效成分的總含量高于六（山），該7種成分與成骨細胞、破骨細胞增殖分化密切相關，從而可調節骨代謝失調、提高骨密度、改善PMOP 有關。可為2020 版藥典六味地黃丸選用酒萸肉入方及臨床上應用六味地黃湯防治PMOP提供一定的實驗依據。