基于“腸-腦”相關(guān)理論的針刺對偏頭痛模型大鼠腸道菌群及中樞炎癥的影響＊

孫銘聲，陳星宇，2，周夢荻，劉 一，鄭宇琦，黃思瑩，蔡定均，趙 凌＊＊

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院 成都 610075；2.成都市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 成都 610041）

偏頭痛是一種通常多伴有惡心、嘔吐等消化系統(tǒng)兼癥的慢性陣發(fā)性神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1]，是世界上最普遍和最致殘的疾病之一[2]。全世界偏頭痛年平均患病率約為14.4%[3]，女性終生患病率則可高達(dá)33%[4]。在我國，偏頭痛年患病率約為9.3%[5]。腦和腸功能異常是偏頭痛的常見病理特征，也是其出現(xiàn)頭痛主癥和消化系統(tǒng)兼癥的關(guān)鍵病理機制。前期基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，偏頭痛頻繁發(fā)作，會反復(fù)激活三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)，使三叉神經(jīng)頸復(fù)合體及丘腦等核團中的中樞性三叉神經(jīng)血管神經(jīng)元敏化，可表現(xiàn)為異位性疼痛、痛覺超敏等癥狀[6-8]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對于偏頭痛多為對癥治療，大多數(shù)偏頭痛患者都會給予簡單的止痛藥（例如非甾體類抗炎藥和撲熱息痛等）[4]。但止痛藥物的使用與許多不良反應(yīng)密切相關(guān)（例如胃腸道反應(yīng)、心臟和腎臟毒性[9]）。針刺防治偏頭痛臨床療效顯著、副作用少、不良事件發(fā)生率低，療效持續(xù)時間長，已被國際醫(yī)學(xué)界初步認(rèn)可[10]。2021 年一項網(wǎng)狀META分析結(jié)果證實針刺治療可有效減輕偏頭痛患者的每月頭痛天數(shù)，與肉毒桿菌神經(jīng)毒素A、托吡酯的療效相當(dāng)，且具有不良事件少等優(yōu)勢[11]。

“腸-腦”相關(guān)理論是以“腸-腦”軸為基礎(chǔ)的用以闡釋腸道與大腦之間的雙向神經(jīng)體液溝通交流的理論，而腸道菌群在其溝通中扮演了關(guān)鍵角色[12]。三代Pacbio全長微生物多樣性測序技術(shù)是一種全新的腸道菌群檢測技術(shù)[13]，其結(jié)合了一代Sanger 測序的讀長優(yōu)勢和二代Illumina測序的高通量優(yōu)勢，將細(xì)菌16S全長完全測通，在細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析中具有：覆蓋度廣、讀長長、通量高、物種注釋準(zhǔn)，能夠注釋到“種”水平（種水平平均注釋率≥60%）等優(yōu)勢[14]。前期已有研究發(fā)現(xiàn)三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)的持續(xù)激活可能與腸道菌群紊亂密切相關(guān)，通過調(diào)節(jié)腸道菌群可升高偏頭痛大鼠痛閾，緩解痛覺過敏癥狀，提示腸道菌群在偏頭痛的治療過程中起到了重要作用[15]，而針刺研究也發(fā)現(xiàn)針刺可針對腸道菌群的豐度及多樣性進行有效調(diào)節(jié)[16-17]。且前期研究發(fā)現(xiàn)[18]，偏頭痛患者腸道和大腦的相互作用機制與炎癥介質(zhì)（IL-6和TNF-α）密切相關(guān)。

因此，本研究采用全新的三代Pacbio 全長微生物多樣性測序技術(shù)，在明確針刺對偏頭痛大鼠鎮(zhèn)痛效應(yīng)的基礎(chǔ)上，探討針刺對偏頭痛大鼠腸道菌群與中樞炎癥的作用，以期為針刺防治偏頭痛的機制提供新的科學(xué)證據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物

雄性同月齡健康SPF 級Sprague Dawley（SD）大鼠共21 只，體重200±20 g，購于成都恩斯維爾生物科技有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（湘）2019-0004，合格證號：430727200101073785。大鼠飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理學(xué)三級實驗室動物房，保持12 h 日夜光線循環(huán)，自由進食。實驗遵照科技部頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》規(guī)定。實驗方案經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（倫理編號：2019-23）。

1.2 試劑與儀器

硝酸甘油注射液（北京益民藥業(yè)有限公司），0.18 mm×13 mm 一次性無菌針灸針（蘇州華佗醫(yī)療用品有限公司），電子VonFrey 測痛儀（type 2392，IITC Life Science，Woodland Hills，CA，USA），大鼠IL-6、TNF-α 酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司），24孔離心機（德國Eppendorf公司，5424EQ7667 51 型）， 96 well PCR 儀（美國Applied Biosystems 公司，9902 型）等。三代Pacbio 全長微生物多樣性測序委托北京百邁客生物科技有限公司完成。

2 實驗方法

2.1 動物分組與模型建立

實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 天后，測定21 只大鼠的足底機械痛閾值，排除痛閾值距中位數(shù)最遠(yuǎn)的3只大鼠后，采用區(qū)組隨機法，將18只大鼠隨機分為空白組（CONT組）、模型組（NTG組）與針刺組（ACU組），每組各6只。參照Bertels 等[19]及項目組前期較為成熟[20]的造模方法，于第1、3、5、7、9 日采用濃度為5 mg·mL-1的硝酸甘油注射液，以2 mL·kg-1的劑量于NTG 組、ACU 組大鼠頸背部進行皮下注射；共注射5 次，即可成功建立模型；CONT組大鼠皮下注射等劑量生理鹽水。

2.2 針刺操作

為避免ACU 組動物針刺后過度掙扎，采用懸掛固定的方式固定大鼠，同時選取雙側(cè)“率谷”（位于耳廓尖上方與頂骨結(jié)節(jié)連線的中點）、雙側(cè)“陽陵泉”（后三里上外側(cè)5 mm 處）穴進行針刺干預(yù)，取穴標(biāo)準(zhǔn)參照鄧春雷等主編的《實驗針灸學(xué)》[21]等。率谷穴沿皮向頸部刺、陽陵泉直刺，針刺深度約1-2 mm，以每分鐘120 次頻率小幅度捻轉(zhuǎn)1 min 后，每5 min 行針1 次，共留針15 min，每天1次，連續(xù)進行9天。

對NTG 組、CONT組僅進行同樣的捆綁固定，不進行針刺。

2.3 觀察指標(biāo)及檢測方法

2.3.1 電子VonFrey測定足底機械痛閾值

參照Martinov 等[22]的方法，在實驗開始前及第1、5、9 天[19]進行足底機械痛閾測定。采用電子VonFrey測痛儀，用硬質(zhì)針頭自下而上垂直刺激大鼠左后爪或右后爪的中央（無肉墊位置），逐漸增加壓力，直至觀察到大鼠出現(xiàn)明確的疼痛反應(yīng)（如縮足、抬足、舔舐刺激部位、跳起等）后記錄讀數(shù)。每只大鼠重復(fù)測量5 次，然后對最接近5次測量值中位數(shù)的3個數(shù)值取平均值。

2.3.2 ELISA檢測中樞IL-6、TNF-α

第9天治療結(jié)束后，取各組大鼠三叉神經(jīng)脊束核，冰浴預(yù)冷提取緩沖液中研磨勻漿。勻漿50 000 rpm，離心15 min。取上清置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｖ髧?yán)格按酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）試劑盒說明測定吸光度值，計算各樣本IL-6、TNF-α含量。

2.3.3 三代Pacbio全長微生物多樣性測序腸道菌群

第9 天治療結(jié)束后，采集各組大鼠糞便樣本，使用PowerSoil?DNA Isolation kit 試劑盒提取腸道菌群DNA，檢測DNA 濃度＞10 ng·μL-1，并檢測抽提的DNA 質(zhì)量，主帶清晰無降解，將提取合格的DNA 作為模板，采用帶有Barcode 的16S 全長引物27F 和1492R，以16S rDNA 全長為目的進行PCR 擴增（見表1）。對擴增產(chǎn)物進行定量、純化、均一化后形成測序文庫并進行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫上機采用PacBio Sequel 上機測序。采用SMRT Link 對下機數(shù)據(jù)進行校正，得到環(huán)形一致性序列（Circular consensus sequencing，CCS）。 再 使 用 Lima 和cutadapt 軟件對CCS 進行質(zhì)量控制，篩除不包含barcode 及長度不在1200-1650 bp 之間的序列，再使用UCHIME 鑒定并去除嵌合體序列，最終完成測序數(shù)據(jù)的處理。

表1 測序引物名稱及序列列表

表2 各組大鼠在不同時間點足底機械痛閾對比（±s，n=6）

表2 各組大鼠在不同時間點足底機械痛閾對比（±s，n=6）

注：與CONT組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與NTG組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組別治療后DAY9 31.03±5.23▲▲18.76±2.53**27.50±2.70▲▲CONT組NTG組ACU組治療前32.31±3.60 28.84±5.75 32.84±5.53 DAY1 28.30±2.54▲▲19.49±3.98**21.05±6.07**DAY5 30.02±6.79▲▲20.56±1.97**25.13±2.23

2.4 數(shù)據(jù)處理方法

腸道菌群測序數(shù)據(jù)，根據(jù)97%相似度水平采用USEARCH 對CCS 進行一致性等級聚類以劃分OTU。基于OTU 豐度，采用Mothur 分析Alpha 多樣性指數(shù)（Shannon）。采用Bray-Curtis 算法對所有樣本的腸道菌群特征進行Beta 多樣性距離計算。采用R 語言進行主坐標(biāo)分析。在種分類水平上，以SILVA 為參考數(shù)據(jù)庫，利用QIIME 軟件生成種水平上的物種豐度表，再利用R 語言繪制物種分布柱狀圖。采用Lefse（Line discriminant analysis effect size，Lefse）進行組間差異顯著物種分析，LDA 閾值設(shè)定為4.0，分類水平選擇從phylum到species。

采用SPSS 24 軟件進行分析，計量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組數(shù)據(jù)經(jīng)過正態(tài)檢驗和方差齊性檢驗后，組間比較采用單因素方差分析，選用LSD 法對存在的差異進行兩兩比較；若不符合正態(tài)分布或方差不齊時采用非參數(shù)方差分析（Tamhane’s T2）法，并采用Boferroni 法對存在的差異進行比較；當(dāng)P＜0.05 時認(rèn)為數(shù)據(jù)有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠足底機械痛閾比較

測定大鼠造模前足底機械痛閾，各組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。測定大鼠開始造模后第1日足底機械痛閾，結(jié)果如表1.圖1 顯示，與CONT 組相比，NTG 組及ACU 組大鼠痛閾顯著下降（P＜0.01）；與NTG 組相比，ACU 組痛閾無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。測定大鼠開始造模后第5 日足底機械痛閾，結(jié)果顯示，與CONT 組相比，NTG 組大鼠痛閾顯著降低（P＜0.01），ACU 組痛閾升高，未出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；與NTG 組相比，ACU 組痛閾升高，未出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。測定大鼠開始造模后第9 日足底機械痛閾，結(jié)果顯示，與CONT 相比，NTG 組大鼠痛閾顯著降低（P＜0.01），ACU組痛閾無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；與NTG 組相比，ACU組痛閾顯著升高（P＜0.01）。

圖1 各組大鼠在不同時間點的足底機械痛閾對比（±s）

3.2 各組大鼠中樞IL-6、TNF-α含量比較

與CONT組相比，NTG組中樞三叉神經(jīng)脊束核IL-6、TNF-α 含量顯著升高（P＜0.01），ACU 組中樞三叉神經(jīng)脊束核IL-6、TNF-α 含量均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與NTG 組相比，CONT 組及ACU 組中樞三叉神經(jīng) 脊 束 核IL-6、TNF- α 含 量 均 顯 著 降 低（P＜0.01）（圖2）。

圖2 各組大鼠中樞IL-6、TNF-α含量對比

3.3 各組大鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)及豐度比較

3.3.1 物種分類學(xué)分析

對篩選后CCS序列在97.0%的相似度水平下進行聚類，最終得到579 個OTU，其中NTG 組509 個OTU，CONT 組489個OTU，ACU 組457個OTU。采用稀釋性曲線及評估測序數(shù)據(jù)質(zhì)量，結(jié)果顯示，本次測序的樣品豐富度與均勻度足夠，可以認(rèn)為測序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中所有的物種，測序質(zhì)量合格（如圖3）。

圖3 稀釋性曲線圖

通過構(gòu)建種水平物種分布柱狀圖，發(fā)現(xiàn)鼠乳桿菌、嗜酸乳桿菌等為種分類水平下大鼠腸道菌群的主要組成部分（如圖4）。進一步通過統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)：與CONT 組相比，NTG 組狄氏副擬桿菌（Parabacteroides_distasonis）、Romboutsia_ilealis、羅 伊 氏 乳 桿 菌（Lactobacillus_reuteri）、顫桿菌（Oscillibacter_sp）的相對豐度顯著升高（P＜0.05），鼠乳桿菌（Lactobacillus_murinus）、大腸桿菌（Escherichia_coli）、Parasutterella_excrementihominis、丁酸單胞菌屬_sp（Butyricimonas_sp）的相對豐度顯著降低（P＜0.05）；與NTG 組相比，ACU 組鼠乳桿菌（Lactobacillus_murinus）的相對豐度有 明 顯 升 高（P＜0.05），腸 乳 桿 菌（Lactobacillus_intestinalis）的相對豐度顯著降低（P＜0.01）（圖5）。

圖4 種水平物種分布柱狀圖

圖5 種水平物種豐度熱圖

3.3.2 Alpha多樣性分析

采用Shannon 指數(shù)以衡量各組物種多樣性。研究結(jié)果顯示，相較于CONT組，NTG 組菌群多樣性有上升趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與NTG 組對比ACU組Alpha多樣性顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖6）。

圖6 Alpha多樣性分析（Shannon指數(shù)）

3.3.3 Beta多樣性分析

在OTU 分類水平上，采用Bray-Curtis 算法對三組樣本進行主坐標(biāo)分析法（Principal coordinates analysis，PCoA）。通過圖7 可發(fā)現(xiàn)，CONT 組各樣本間較為聚集，具有較高的相似度，且與NTG 組相比具有較大的差異度；NTG 組與ACU 組各樣本間距離較遠(yuǎn)，物種組成有一定相似度，但也具有較大的差異度。

圖7 PCoA分析-PC1 vs PC2

3.3.4 組間差異顯著性LEfSe分析

通過線性判別分析方式在不同組間尋找具有統(tǒng)計學(xué)差異的生物標(biāo)志物，如圖8 所示，三組共得到29 個具有顯著差異的物種。其中，NTG 組的優(yōu)勢物種主要為梭狀芽孢桿菌、梭菌目、嗜酸乳桿菌、毛螺菌科等；ACU 組的優(yōu)勢物種主要為桿菌、乳酸桿菌目、乳酸桿菌科、乳酸桿菌、羅伊氏乳桿菌等。

圖8 Lefse差異貢獻分析圖

4 討論

偏頭痛患者常表現(xiàn)為頭部一側(cè)或兩側(cè)疼痛，屬于中醫(yī)學(xué)“頭風(fēng)”的范疇，按經(jīng)絡(luò)辯證當(dāng)屬少陽經(jīng)病變。《冷廬醫(yī)話·頭痛》云：“頭痛屬少陽者，上至兩角，痛在頭角……少陽經(jīng)行身之側(cè)。”中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，經(jīng)絡(luò)“內(nèi)屬于臟腑，外絡(luò)于肢節(jié)”，由于經(jīng)絡(luò)與相應(yīng)臟腑、器官、部位之間的特殊絡(luò)屬和聯(lián)絡(luò)關(guān)系。循經(jīng)取穴是基于針灸的治療作用具有“經(jīng)脈所過，主治所及”這一最基本規(guī)律，選擇經(jīng)過疾病部位或與疾病關(guān)系最為密切的經(jīng)脈上的穴位進行針灸治療的取穴方法。《黃帝內(nèi)經(jīng)》中運用循經(jīng)取穴原則的處方多達(dá)356 首，占其處方總數(shù)的86.4%[23]。課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)[10]，循少陽經(jīng)選穴治療偏頭痛可顯著減少無先兆偏頭痛發(fā)作次數(shù)，且針刺對偏頭痛的治療具有持續(xù)效應(yīng)（至少可持續(xù)至治療后20 周）。因此，由于偏頭痛顯著的少陽經(jīng)病變特征，針灸治療多循經(jīng)選取少陽經(jīng)穴位以疏調(diào)少陽經(jīng)氣。本研究在前期臨床研究經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，選取率谷、陽陵泉為治療主穴。率谷為足少陽膽經(jīng)腧穴，位于頭部，屬選穴原則中的近部選穴，《類經(jīng)圖翼》云“率谷……主治腦病，兩頭角痛，胃膈寒痰，煩悶嘔吐”，因此，率谷不單可治療局部偏頭痛，還兼可治療偏頭痛所伴發(fā)的惡心、嘔吐等消化系統(tǒng)兼癥。陽陵泉是足少陽經(jīng)合穴，是經(jīng)氣深而入里，進而會合于臟腑的部位，其不僅可用于經(jīng)脈循行所過部位的經(jīng)絡(luò)肢節(jié)痛，如《備急千金要方·頭面第一》所云“陽陵泉主頭痛寒熱”；還可調(diào)節(jié)臟腑功能，如《靈樞·順氣一日分為四時》云“經(jīng)滿而血者，病在胃，及以飲食不節(jié)得病者，取之于合”。率谷與陽陵泉兩穴合用，可調(diào)和氣血、活絡(luò)止痛，體現(xiàn)了近治與遠(yuǎn)治相結(jié)合的治療原則，共同起到疏通少陽經(jīng)脈以止痛的功效；又兼可調(diào)節(jié)胃腸道功能，改善胃腸道癥狀。

在本研究中，項目組采用前期深入闡釋其模型機制的硝酸甘油偏頭痛大鼠模型[20]，以隔天皮下注射硝酸甘油的方式模擬偏頭痛反復(fù)發(fā)作，從而誘發(fā)偏頭痛中樞敏化；并以針刺為干預(yù)手段，研究了針刺對偏頭痛模型大鼠痛覺超敏及腸道菌群的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示，隨著針刺治療的持續(xù)，ACU 組大鼠足底機械痛閾由第一天檢測后的與NTG 組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），到第五天檢測后的與CONT 和NTG 組均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），再到第九天檢測后的與CONT 組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），但與NTG 組具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），體現(xiàn)了針刺隨著治療次數(shù)的增加，針刺的累積性效應(yīng)顯著。

前期研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群多樣性可能與疼痛密切相關(guān)[24-25]。本研究結(jié)果顯示，偏頭痛模型大鼠腸道菌群多樣性增加，中樞IL-6、TNF-α 含量顯著升高（P＜0.05），而針刺可降低偏頭痛大鼠腸道菌群多樣性，顯著增加鼠乳桿菌豐度（P＜0.05），降低腸乳桿菌豐度（P＜0.01），同時顯著降低偏頭痛大鼠中樞IL-6、TNFα 水平（P＜0.05），使偏頭痛大鼠的痛覺超敏得到有效緩解，提示針刺可降低偏頭痛模型大鼠腸道菌群多樣性，以及調(diào)控中樞炎癥狀態(tài)，發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，鼠乳桿菌豐度下降可導(dǎo)致腸道通透性增加，病原菌增殖、活性增強，糖脂代謝紊亂，細(xì)胞因子TNF-α、IL-6 分泌水平升高，誘發(fā)三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)的激活[26-27]。而腸乳桿菌則與TNF-α、IL-6 的較高水平密切相關(guān)[28]，通過攝入腸乳桿菌會導(dǎo)致小鼠血漿IL-6 水平的明顯升高[29]。通過服用含乳酸桿菌的益生菌制劑可減少偏頭痛發(fā)病天數(shù)，緩解偏頭痛癥狀[30-33]。而針對本研究中發(fā)現(xiàn)的針刺后具有明顯增加趨勢的阿克曼氏菌的最新研究[34]也指出，阿克曼氏菌具有降低TNF-α、IL-6 等促炎細(xì)胞因子的作用，與本研究針刺后可降低IL-6、TNF-α含量的研究結(jié)果吻合。

綜上，硝酸甘油誘導(dǎo)的偏頭痛模型大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)與豐度以及中樞炎癥狀態(tài)與正常大鼠具有顯著差異，針刺可對偏頭痛模型大鼠腸道菌群發(fā)揮良性調(diào)節(jié)作用，并顯著抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的激活，緩解偏頭痛。但本研究主要從腸道菌群多樣性及組成的角度探討了針刺治療偏頭痛的中樞抗炎鎮(zhèn)痛作用，而其“腸-腦”作用途徑的中間環(huán)節(jié)尚不明確。在后續(xù)的研究中可引入對腸道菌群的特異性調(diào)控手段，并結(jié)合宏基因組或代謝組學(xué)，進一步明確針刺治療偏頭痛的“腸-腦”作用機制，以深入闡釋針刺鎮(zhèn)痛的作用新機制。