基于TLR4信號通路探討補腎利咽方治療IgA腎病作用機制＊

鄒 迪，張守琳，張洪寶，王銀萍

（長春中醫藥大學附屬醫院 長春 130021）

IgA 腎病（IgA nephropathy，IgAN）是腎活檢免疫病理顯示在腎小球系膜區以IgA 為主的免疫復合物沉積，以腎小球系膜增生為基本組織學改變，臨床表現多種多樣，主要表現為血尿，可伴有不同程度的蛋白尿、高血壓和腎臟功能受損[1]。IgA 腎病是我國最常見的原發性腎小球疾病，也是導致尿毒癥的首要病因，在我國腎活檢檢出率高達50.7%-58.2%，且近年來發病率逐漸上升[2-4]，多發于青壯年[5]。IgAN病情進展快，腎活檢確診10-20 年后約15%-39%的患者進展至終末期腎病（End-stage renal disease，ESRD）[6-7]，需要透析或者腎移植等腎臟替代治療。

現代醫學認為，對于以血尿為主的IgA 腎病，只能定期復查，且單純血尿的患者20年后仍可發展為尿毒癥；對于有蛋白尿的IgA 腎病，可應用血管緊張素轉換酶抑制劑/血管緊張素受體拮抗劑（ACEI/ARB），但效果有限；對于快速進展型IgA 腎病，應用糖皮質激素及免疫抑制劑有一定療效，但安全性仍存在爭議，可出現致死性感染或其他不良反應；IgA 腎病一旦腎小球濾過率（GFR）下降超過50%-60%或血肌酐（SCr）＞250 μmol·L-1，只能等待腎臟替代治療。反復扁桃體感染誘發的IgA 腎病患者，可選擇抗炎或扁桃體切除的方法減少本病復發，但臨床試驗樣本量較少，且無前瞻性RCT支持[8-9]。

盡管IgA 腎病的發病機制尚未完全清楚，但是發作性血尿之前常常有上呼吸道感染或腸道感染，說明粘膜免疫系統在IgAN中起重要作用，尤其是咽部感染所導致的自身免疫反應紊亂可能是重要的發病機制之一[10-11]，很多中醫學者也注重從咽論治IgAN，取得了較好的臨床療效[12-13]。但目前的研究多以臨床研究為主，缺乏對從咽論治IgAN療效作用機制的探討。

國醫大師任繼學教授認為IgA 腎病的病機關鍵為腎與脾。腎虛脾虧是發病之本，毒聚咽喉是發病之關鍵。這與現代醫學感染導致IgA 腎病加重的觀點一致。任老將“喉腎相關”理論用于系統診治IgA腎病，認為IgA 腎病的復發以及演變與咽喉關系密切，運用補腎健脾，解毒利咽法治療IgA 腎病40 余年，可有效減輕患者血尿、蛋白尿。本實驗采用經典的IgA 腎病大鼠模型，以黏膜感染、TLR4 信號傳導系統激活誘發免疫反應、IgA1 糖基化異常為研究主線，進一步探討補腎健脾、解毒利咽法調節天然黏膜免疫機制及干預IgA1 糖基化異常，從而闡明補腎健脾、解毒利咽法在本病發病及腎小球系膜區損傷中的分子調控機制。

1 材料

1.1 實驗動物

選取SPF 級雄性SD 大鼠80 只作為研究對象，體質量180±20 g，常規飼養于長春中醫藥大學SPF 級動物房，室溫（22±2）℃，自然晝夜節律光照，相對濕度（55%±5%）。大鼠普通飲食，自由飲水。

1.2 實驗藥物及制備

實驗組：給予補腎利咽方中藥湯劑（黃芪、生地黃、馬勃、紫荊皮、金蕎麥、木蝴蝶等）。由我院中醫藥研究中心提供；對照組：鹽酸貝那普利片（洛汀新），北京諾華制藥有限公司，批準文號：國藥準字H20030514，規格：10 mg/片。

1.3 主要儀器及試劑

正置顯微鏡（徠卡顯微系統有限公司，型號DM1000）；組織破碎機（上海般諾生物科技有限公司，型號BIO-950）；生物組織包埋機-冷凍機（泰維科技，型號TB-718L）；全自動生化分析儀（東莞市健威醫療器械有限公司，型號BS-380）；高速冷凍離心機（杭州奧盛，型號Icen-24R）；PCR 儀（杭州柏恒，型號GE48527）；熒光定量PCR 儀（Bio-Rad，型號CFXConnect 96）；鼓風干燥箱（上海一恒，型號DHG-9240A）；數顯恒溫水浴鍋（中國金南，型號HHW600）；超微量分光光度計（杭州奧盛，型號Nano-300）；全自動尿沉渣分析儀（Sysmex，型號UF-1000i）。熒光素標記兔抗鼠IgA 抗體（北京博奧森生物技術有限公司，批號bs-10491R，規格100 μL）；牛血清白蛋白、脂多糖、蓖麻油（美國sigma 公司，批號分別為A1933，SMB00610，259853）；四氯化碳（北京化學試劑廠，批號C112040）；DAB 濃縮型試劑盒（Solarbio，貨號DA1010-2×3 mL）；蘇木素（Solarbio，貨號G1140）；中性 樹 脂（Solarbio，貨 號G8590）；封 閉 山 羊 血 清（Solarbio，貨號SL038-10 mL）。

2 方法

2.1 分組及造模

采用分層隨機方法將80 只SD 大鼠分為空白組15 只，造模組65 只，每籠10 只分開喂養。參照陸慧渝[14]等的方法復制IgA腎病大鼠模型。

空白組：0.9%氯化鈉注射液4 mL·kg-1，灌胃，隔日1 次，持續8 周；0.9%氯化鈉注射液每只0.4 mL，皮下注射，每周1 次，持續9 周；第6 周0.9%氯化鈉注射液每只0.2 mL，尾靜脈注射。

造模組：將牛血清白蛋白結晶粉以蒸餾水配成100 g·L-1濃度的稀釋液體，以4 mL·kg-1，灌胃，隔日1 次，持續8 周；將CCl4與蓖麻油，以1∶3 的比例混合均勻，每只0.4 mL，皮下注射，每周1次，持續9周；第6周將脂多糖與0.9%氯化鈉注射液配成0.25 g·L-1的溶液，每只0.2 mL，尾靜脈注射。造模周期為9周。

驗證模型：第9 周末，空白組及模型組各隨機抽取3 只大鼠處死，免疫熒光法觀察IgA 在腎組織沉積情況，以驗證模型是否成功：空白組腎小球未見IgA免疫熒光染色，模型組腎小球可見大量IgA 熒光信號，呈顆粒狀沉積。將造模成功大鼠隨機分為模型組、洛丁新對照組、補腎利咽方高、中、低劑量組，每組10 只。

2.2 給藥

各組大鼠灌胃給藥如下，每天1 次，連續6 周。①空白組：生理鹽水4 mL·kg-1；②模型組：生理鹽水4 mL·kg-1；③洛汀新組：4 mL·kg-1，洛汀新1.041 mg；④補腎利咽方低劑量組：4 mL·kg-1，含生藥量10.4 g；⑤補腎利咽方中劑量組：4 mL·kg-1，含生藥量20.81 g；⑥補腎利咽方高劑量組：4 mL·kg-1，含生藥量41.62 g。

2.3 觀測指標

2.3.1 一般狀態

觀察大鼠一般狀態并記錄，包括活動次數、毛色、光澤度、進食情況、二便顏色、尿量、死亡情況。

2.3.2 檢測尿紅細胞計數（RBC）及24 小時尿蛋白（UTP）

于實驗前、造模后及給藥后將大鼠單個置于代謝籠中24 h，觀察尿色，記錄尿量，所收集尿液標本行尿沉渣法檢測尿RBC，行磺基柳酸法檢測UTP。

2.3.3 檢測腎功能

實驗結束時，用1%戊巴比妥鈉40 mg·kg-1麻醉大鼠，從腹主動脈采血，分離血清備檢。應用全自動生化分析儀檢測血清尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）。

2.3.4 免疫組化法檢測各組腎組織Toll 樣受體4（TLR4）、髓樣分化因子（MyD88）、核因子-κB（NFκB）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）的表達

取腎組織處理后，按常規步驟脫水浸蠟包埋；切片、展片、烤片，并進行免疫組化染色。通過烤片、脫蠟、水化、抗原修復、阻斷、封閉，滴加一抗，濕盒孵育，4℃孵育過夜。PBS溶液沖洗3 min×3次。隨后二抗孵育，滴加二抗，濕盒孵育，37℃孵育30 min。PBS 溶液沖洗3 min×3 次。之后進行顯色、蘇木素染色、脫水，透明和封片，最后進行圖像采集。

2.3.5 PCR 檢測外周血β1,3 半乳糖轉移酶（C1GALT 1）及Cosmc mRNA表達

實時熒光定量PCR檢測C1GALT1及Cosmc mRNA的表達RNA提取；用分光度計測定樣品總RNA濃度和純度；逆轉錄；定量PCR擴增；Cosmc、C1GALT1基因和內參照GAPDH基因引物序列；PCR擴增程序：PCR反應程序；使用雙deltaCT法來分析目的基因的相對表達量。

2.3.6 Western blot檢測血清中TLR4、NF-κB、白介素-6（IL-6）含量

通過組織蛋白的提取，聚丙烯酰胺凝膠電泳，免疫印跡操作-轉膜，一抗與靶蛋白的結合，酶標記二抗與一抗的結合，化學發光等實驗方法，將掃描獲得的圖片，在Quantity One 軟件（Bio-Rad）下進行分析。β-actin作為內參照，再將各組的目的蛋白相對值除以β-actin相對值，即各組目的蛋白的相對表達量。

2.4 統計學處理

計量資料均以均值±標準差（±s）表示，采用SPSS 22.0 軟件進行統計學處理，組間差異采用單因素方差分析法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 一般情況

造模過程中造模組共死亡5 只大鼠，空白組及造模組每組取3 只大鼠用于驗證模型是否成功，共計死亡11 只大鼠。空白組大鼠狀態始終良好。造模組大鼠4 周后出現活動減少、進食減少、毛色晦暗、體質量減輕、尿色變深，8 周癥狀加重，給藥后洛丁新組及補腎利咽方組大鼠進食增多、活動增加、體質量增加。

3.2 補腎利咽方對IgA腎病大鼠尿液檢查的影響

表1 顯示，與空白組比較，模型組大鼠10 周、12 周、16 周尿紅細胞、24 h 尿蛋白定量增多（P＜0.05）；與模型組比較，補腎利咽方組和洛汀新組從10周起尿RBC、UTP 均明顯減少，隨給藥時間延長，尿RBC、UTP減少更為明顯（P＜0.05）。與洛丁新組比較，補腎利咽方組尿RBC、UTP減少（P＜0.05），其中，補腎利咽方高、中劑量組效果最好（P＜0.01）。

表1 各組大鼠各時相尿RBC（/HP）、UTP（mg·24 h-1）的比較（±s）

表1 各組大鼠各時相尿RBC（/HP）、UTP（mg·24 h-1）的比較（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與洛丁新組比較，3）P＜0.01。

組別空白組模型組洛丁新組高劑量組中劑量組低劑量組n 10周12周16周UTP 9.83±0.72 280.32±32.271）168.42±24.461）2）156.34±21.331）2）3）163.24±19.221）2）3）174.36±20.681）2）12 9 10 9 10 9尿RBC 2.21±0.12 26.18±2.331）15.22±0.921）2）15.24±0.981）2）18.06±1.041）2）19.25±1.241）2）UTP 11.29±0.83 242.41±23.321）198.41±16.621）2）161.15±21.351）2）3）158.61±14.311）2）3）164.57±15.271）2）3）尿RBC 2.72±0.27 28.81±2.931）17.28±1.451）2）17.82±0.681）2）16.36±0.841）2）17.95±1.141）2）UTP 8.23±0.48 268.42±42.151）156.64±26.161）2）132.83±19.121）2）3）164.25±21.321）2）149.82±30.521）2）尿RBC 3.53±0.73 28.53±1.231）11.53±0.581）2）10.33±1.331）2）3）9.52±0.731）2）3）12.13±0.741）2）

3.3 補腎利咽方對IgA腎病大鼠血清腎功能的影響

表2顯示，與空白組比較，模型組大鼠SCr、BUN略有上升；與模型組比較，洛丁新組及補腎利咽方組大鼠血SCr、BUN略下降，但無統計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠給藥后血清BUN、SCr比較（±s）

表2 各組大鼠給藥后血清BUN、SCr比較（±s）

注：與空白組比較，1）P＞0.05；與模型組比較，2）P＞0.05。

組別空白組模型組洛丁新組高劑量組中劑量組低劑量組n SCr（μmol·L-1）28.14±5.54 31.63±3.931）31.23±4.232）29.98±4.822）28.27±4.922）29.91±3.832）12 9 10 9 10 9 BUN（mmol·L-1）4.23±1.27 5.34±1.111）5.47±0.952）5.33±0.752）4.94±0.672）5.23±0.752）

3.4 補腎利咽方對IgA腎病大鼠腎組織TLR4、MyD88、NF-κB、MCP-1的影響

表3 顯示，與空白組比較，模型組大鼠腎組織TLR4、MyD88、NF-κB、MCP-1 升高（P＜0.05）；與模型組比較，洛丁新組及補腎利咽方組大鼠腎組織TLR4、MyD88、NF-κB、MCP-1下降（P＜0.05）。

表3 各組大鼠給藥后腎組織TLR4、MyD88、NF-κB、MCP-1（±s）

表3 各組大鼠給藥后腎組織TLR4、MyD88、NF-κB、MCP-1（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

組別空白組模型組洛丁新組高劑量組中劑量組低劑量組n 12 9 10 9 10 9 TLR4（mmol·L-1）23.4±0.37 29.89±0.511）22.85±0.132）23.10±0.462）23.11±0.202）22.89±0.222）MyD88（μmol·L-1）26.52±0.20 32.33±0.071）25.94±0.132）26.94±0.382）25.79±0.272）25.96±0.782）NF-κB（pg·mL-1）28.92±0.32 41.9±0.161）28.97±0.302）29.55±0.422）28.66±0.332）29.54±0.242）MCP-1（pg·mL-1）22.07±0.26 34.29±0.121）22.48±0.392）22.72±0.292）22.49±0.232）22.85±0.142）

3.5 補腎利咽方對IgA 腎病大鼠外周血C1GALT1 及Cosmc mRNA表達的影響

表4 結果表明：與空白組比較，模型組大鼠C1GALT1、Cosmc mRNA 表達明顯升高（P＜0.05）。與模型組對比，洛丁新組及補腎利咽方組C1GALT1、Cosmc mRNA 的表達降低（P＜0.05）。與洛丁新組比較，補腎利咽方組C1GALT1、Cosmc mRNA 降低，其中中劑量組、低劑量組降低明顯（P＜0.05）。

表4 各組大鼠給藥后外周血C1GALT1及Cosmc mRNA表達（（±s，pg·mL-1）

表4 各組大鼠給藥后外周血C1GALT1及Cosmc mRNA表達（（±s，pg·mL-1）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與洛丁新組比較，3）P＜0.01。

Cosmc 24.97±0.16 30.12±0.151）28.74±0.121）2）26.70±0.151）2）3）24.67±0.061）2）3）24.03±0.101）2）3）組別空白組模型組洛汀新組高劑量組中劑量組低劑量組n 12 9 10 9 10 9 C1GALT1 21.90±0.11 27.36±0.141）25.68±0.101）2）23.45±0.071）2）3）21.70±0.181）2）3）21.06±0.061）2）3）

3.6 補腎利咽方對IgA 腎病大鼠血清TLR4、NF-κB、IL-6含量的影響

表5 表明：與空白組比較，模型組大鼠血清TLR4、NF-κB、IL-6 明顯升高（P＜0.05）。與模型組對比，洛丁新組及補腎利咽方組TLR4、NF-κB、IL-6 的表達明顯減少（P＜0.05）。與洛丁新組比較，補腎利咽方組TLR4、NF-κB、IL-6減少（P＜0.05）。

表5 各組大鼠給藥后血清TLR4、NF-κB、IL-6含量（±s，pg·mL-1）

表5 各組大鼠給藥后血清TLR4、NF-κB、IL-6含量（±s，pg·mL-1）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與洛丁新組比較，3）P＜0.01。

IL-6 156.35±23.64 734.24±52.421）210.42±32.321）2）197.42±52.431）2）3）199.32±32.311）2）3）203.03±42.421）2）3）組別空白組模型組洛丁新組高劑量組中劑量組低劑量組n 12 9 10 9 10 9 TLR4 104.03±0.13 302.32±0.231）133.43±0.311）2）129.57±0.581）2）3）127.25±0.351）2）3）130.36±0.371）2）3）NF-κB 92.34±32.21 203.94±29.531）103.44±28.231）2）99.23±19.231）2）3）102.45±32.251）2）3）106.49±29.321）2）3）

4 討論

沉積在腎小球系膜區的IgA以IgA1和異常糖基化的IgA1聚合體形成的免疫復合物為主，主要來源于黏膜分泌系統，黏膜（包括扁桃體）感染所致的免疫功能紊亂、IgA1 分子糖基化的異常是導致IgA 腎病發病的重要機制[15]。

越來越多研究證明，抗原（細菌、病毒或食物等）侵襲扁桃體后，黏膜組織產生抗體及免疫反應，從而引起IgA 的沉積[15-17]。黏膜感染可使TNF-α、IL-6 升高，誘發IgA1 分子糖基化異常，也可使扁桃體淋巴細胞產生人半乳糖缺乏IgA1 增多[18]。黏膜感染后，病原微生物相關分子模式被跨膜蛋白Toll 樣受體家族（TLRs）識別，而激活并能誘導特異性免疫應答，介導信號轉導引起炎癥反應，引起IgAN。TLR4 可識別革蘭陰性細菌脂多糖（LPS），黏膜感染時脂多糖可激活TLR4，通過MyD88 依賴途徑及非MyD88 依賴途徑引起細胞內信號轉導，進而激活NF-κB 等引起炎癥反應[19-21]，從而引起系膜細胞損傷。而異常糖基化的IgA1 免疫復合物與IgAN 病情進展密切相關，其血清水平高預示不良預后[22-23]。IgA1 的糖基化修飾過程中，C1GalT1 在特異性分子伴侶Cosmc 的輔助下，將半乳糖（Gal）轉移至IgA1 的乙酰半乳糖胺殘基上，若C1GalT1 及Cosmc 異常，可導致異常糖基化的IgA1 增多[24]。在C1GalT1 等關鍵酶的調節過程中，黏膜感染、多種細胞因子等起到重要作用[25-27]。在腎小球系膜區，異常糖基化的IgA1 為主的免疫復合物沉積，釋放細胞因子以及炎癥驅化因子，如MCP-1 等，使系膜細胞增殖，細胞外基質過量合成，對腎臟造成損傷，同時進一步加重IgA1的異常糖基化，形成惡性循環。

國醫大師任繼學教授指出IgA 腎病的病機關鍵在腎虛脾虧，而咽喉是IgA 腎病發病之源。咽在喉后，主納食，胃之系也；喉在咽前，主氣出入，為肺之系也。胃、腎、肝三脈循喉。任脈至咽喉。咽喉與腎之間的關系非常密切。因此，外邪侵淫，由咽喉及肺，瘀毒內生，由經絡而侵及腎臟；若腎氣不足，衛外不固，邪毒外侵，容易侵及咽喉，形成咽喉→肺→腎的惡性循環。因此，IgA腎病的發病及進展與咽喉關系密切。

任老認為，生地黃滋陰養腎，清熱涼血，黃芪補氣健脾，兩藥共用補腎陰，健脾氣，共為君藥；金蕎麥為治療咽喉腫痛之要藥，可清熱解毒、健脾利濕；馬勃利咽、清熱、止血，共為臣藥，解毒利咽清其源。紫荊皮活血通經、解毒消腫；木蝴蝶能清肺利咽，可治療喉痹、喑啞；共為佐使藥。再配合補腎、利咽、化濕、通絡藥物，全方補腎健脾，解毒利咽。用于治療IgA 腎病，一方面補腎健脾以補益先天、后天之本，治本增強機體抗邪能力；另一方面解毒利咽，治標從而截斷致病之源。

本研究應用補腎利咽方治療IgA 腎病模型大鼠，與模型組比較，補腎利咽方組尿RBC、UTP 均明顯減少，隨給藥時間延長，尿RBC、UTP 減少更為明顯（P＜0.05），說明補腎利咽方可明顯減少IgA 腎病模型大鼠的血尿、蛋白尿。補腎利咽方對腎功能無明顯影響，可能原因為各組大鼠腎功能都基本正常，所有未見明顯統計學差異。與模型組比較，補腎利咽方組大鼠腎組織TLR4、MyD88、NF-κB、MCP-1 下降（P＜0.05），外周血C1GALT1、Cosmc mRNA 的表達降低（P＜0.05），血清TLR4、NF-κB、IL-6的表達明顯減少（P＜0.05），說明補腎利咽方可改善黏膜感染誘發的TLR4 信號轉導系統介導的免疫反應，調整IgA1糖基化過程中的關鍵酶C1GalT1 及分子伴侶Cosmc，減少異常糖基化的IgA1，從而減少其在腎小球系膜區沉積，減輕腎損傷，為IgA腎病的治療提供實驗研究證據。