優寧八味散對地塞米松誘導大鼠非酒精性脂肪肝的保護作用及機制研究＊

吳哈達，曹山虎，小 芳，包寶光，溫都蘇畢力格

（內蒙古自治區國際蒙醫醫院 呼和浩特 010065）

非酒精性脂肪肝（NAFLD）可分為非酒精性單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝硬化等[1]。NAFLD 是慢性肝損傷的主要原因，在中國，成人的NAFLD 現患率最高達45%，其中非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis，NASH）最高達30%，NASH 相關肝硬化發生率為15%-25%[2]。早期干預和個體化藥物治療是延緩和阻斷NAFLD 向肝纖維化、肝硬化、甚至肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）進展的關鍵。目前公認的NAFLD發病機制為二次打擊“學說”，相關研究認為NAFLD 病因與氧化應激、內質網應激、脂質代謝紊亂、線粒體功能失調等相關[3]。關于NAFLD 的治療，主要以抗炎、降低胰島素抵抗、降脂、提高抗氧化能力等為主，但患者預后效果較差[4]。蒙醫學上NAFLD 歸屬于通拉嘎（指食物之精華-脂肪）未消化病范疇[5-6]。治療原則以祛巴達干赫依、清糟歸精為主[7]，臨床上可分為巴達干赫依偏盛型、巴達干希拉偏盛型、血希拉偏盛型、巴達干血偏盛型4種。蒙醫認為脂肪性肝炎階段類似于血希拉偏盛型，屬于肝熱癥，治療原則為以清血希拉熱為主[8]，近幾年，臨床上治療肝膽疾病的蒙藥逐漸增多[9]。MMYBP（優寧八味散，奧優-8，郁寧-8 味，優寧-8 味丸）是蒙醫傳統驗方，記載于蒙醫經典著作《蒙醫金匱》[10]，具有清肝熱、解毒等功效，臨床上常用于肝熱癥，配方是綠松石（制）15 g、冰片9 g、丁香12 g、牛膽膏粉3 g、人工麝香0.24 g、葡萄干12 g、木鱉子仁（制）12 g、白檀香12 g 等八味配合組成。相關文獻表明MMYBP 有改善慢性乙型、丙型肝炎主要癥狀、體征及肝功能的作用[11-12]。前期基礎研究揭示了MMYBP 能改善四氯化碳（Carbon tetrachloride，CCl4）模型小鼠肝組織氧化應激及炎癥反應[13]。目前，MMYBP 治療NAFLD 及高脂血癥方面的研究還尚未報道，且用高脂飼料結合地塞米松注射的方法建造NAFLD模型研究蒙藥的文獻報道也沒有，本研究著眼于此，采用高脂飼料結合地塞米松注射的方法構建NAFLD大鼠模型，地塞米松腹腔注射可以誘導高脂血癥和急性脂肪肝模型，使肝指數、血脂、肝組織甘油三酯（TG）短期明顯增高，結合高脂飼料持續誘導可以延長脂肪肝模型時間。用MMYBP 干預，從大鼠肝指數、肝功能、血脂、脂質代謝指標以及細胞色素P4502E1（CYP2E1）表 達 等 方 面 探 討MMYBP 對NAFLD 的治療作用及機制，旨在探討MMYBP 是否可以通過調節CYP2E1 蛋白，改善NAFLD 大鼠脂質代謝紊亂，提高預后效果，延緩NAFLD 向肝纖維化及肝硬化進展。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及飼料

SPF級雄性SD大鼠44只，體質量140-200 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2019-0010，合格證號：1103242011004970，動物實驗倫理編號：AWE2021122801。飼養溫度：20-26℃，光照12 h，黑暗12 h，設定自由攝食、飲水。大鼠普通飼料和高脂飼料[14]由內蒙古西恩塞斯生物技術有限公司提供，普通飼料：碳水化合物53%，脂肪5%，蛋白質23%，其他營養成分19%；高脂飼料：普通飼料81%，豬油7.5%，蛋黃粉10%，膽固醇1%，膽酸鈉0.3%，丙基硫氧嘧啶0.2%。

1.2 實驗中使用的試劑、藥品及儀器

實驗中采用的試劑及藥品詳見表1和表2；使用的儀器詳見表3。

表1 實驗試劑

表2 實驗藥品

表3 實驗儀器

1.3 分組、造模及給藥

將44 只SD 大鼠隨機分為正常組（A 組），模型組（B 組），易善復組（C 組），MMYBP 高劑量組（D 組）、低劑量組（E 組）5 組。A 組和B 組大鼠各10 只，其余3 組各8 只。A 組喂普通飼料，其余4 組以高脂飼料喂養，自由攝食、飲水。采用高脂飼料結合地塞米松注射的方法建造NAFLD 模型[15-16]，除正常組外的其他4 組需要建模，前4天，腹腔注射地塞米松100 mg·kg-1·d-1，從第5-14 天，隔日腹腔注射地塞米松33 mg·kg-1·d-1，第15 天從A 組和B 組中各取2 只，觀察肝組織病理改變確定NAFLD 造模成功后，進行藥物干預，A 組和B 組用等量的蒸餾水灌胃，C 組、D 組和E 組按著易善復25.3 mg·mL-1、MMYBP 高劑量111 mg·mL-1和MMYBP低劑量66.7 mg·mL-1濃度的混懸液用灌胃法經口給藥每只大鼠1 天1 mL，均需投藥1 個月，投藥劑量根據《藥理實驗方法學》計算，其他組不給藥，1個月后取樣本做相關檢測，高脂飼料投喂到實驗結束，投藥開始到實驗結束不用地塞米松注射。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 取樣本

從大鼠腹主動脈采血，分離血清，冷凍保存；取出大鼠完整肝臟，取大鼠肝臟右葉一部分，用4%多聚甲醛溶液固定，用于HE 染色，其余肝組織凍存備檢，用于相關基因及蛋白檢測。

1.4.2 肝指數

稱取各組大鼠體質量和肝臟濕重，計算其肝指數。肝指數=肝臟質量（g）/體質量（g）×100%。

1.4.3 肝組織HE染色

取固定肝組織逐級進行脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片及常規染色等操作，觀察肝組織病理變化情況。肝細胞脂肪變性程度判斷標準參照Diehl法[17]，炎癥活動度計分標準參考1981 年Knodell 等[18]提出的慢性肝炎組織學活動指數（HAI），并結合王泰齡等[19]提出的慢性肝炎炎癥活動度計分方案。

1.4.4 ELISA檢測

按照ELISA 試劑盒說明書進行操作，檢測各組大鼠血清谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、甘油三酯（TG）含量和肝組織（TG）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、游離脂肪酸（FFA）含量。

1.4.5 肝組織CYP2E1mRNA表達水平的檢測

采用TRIzol 法提取大鼠肝組織總信使RNA（Messenger RNA，mRNA），取總核糖核酸（Ribonucleic acid，RNA）1μg 按照RT-reagent 逆轉錄試劑盒說明書將其逆轉錄成互補DNA（Complementary DNA，cDNA），用PCR 分析儀檢測熒光信號，熒光標記物為SYBR Green，內參對照為β-actin，進行PCR 擴增反應，擴增條件為95℃ 30 s、95℃ 5 s、62℃ 30 s，循環次數為40 次，引物序列見表4，用2-ΔΔCt法進行相對定量，計算各基因表達量（C：Cycle，t：threshold）。

表4 引物序列表（5’-3’）

1.4.6 肝組織CYP2E1蛋白表達水平的檢測

蛋白質印跡（Western Blot）法檢測各組大鼠肝組織CYP2E1 蛋白表達水平，取出100 mg 肝組織置于勻漿器內，使肝組織完全勻漿，離心，取上清液，用BCA法檢測蛋白濃度；每組各取40 μg行凝膠電泳，轉移到PVDF 膜，脫脂牛奶封閉2 h，一抗過夜封閉12 h，二抗孵育1 h 后暗室曝光洗片，內參為GAPDH，將化學發光試劑加于膜上，在成像系統下進行曝光。

1.5 數據統計方法

用SPSS22.0 軟件進行統計學分析，數據表示用均值±標準差（±s），組間比較采用t檢驗，P＜0.05 差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肝指數變化

與A 組比較，B 組肝指數顯著升高（P＜0.05）；與B組比較，C 組、D 組、E 組肝指數顯著減少（P＜0.05）；與C 組比較，D 組肝指數顯著減少（P＜0.05），E 組無顯著差異，見表5。

表5 各組大鼠肝指數變化（±s，n=8）

表5 各組大鼠肝指數變化（±s，n=8）

注：與A組比較，#P＜0.05；與B組比較，*P＜0.05；與C組比較，aP＜0.05。

肝指數（%）2.60±0.25 4.10±0.26#3.10±0.35*2.80±0.29*a 3.00±0.18*組別A組B組C組D組E組

2.2 各組大鼠肝組織病理學變化

HE 染色結果顯示，A 組大鼠肝小葉結構清晰，細胞索排列整齊，肝竇正常；B組大鼠肝細胞出現腫脹變性，排列無序，細胞內脂肪空泡增多，明顯炎癥細胞浸潤。C 組、D 組和E 組肝細胞形態逐漸恢復，腫脹程度減輕，脂滴空泡減少，炎癥細胞浸潤減輕，C 組比D 組、E組改善較佳，見圖1和表6。

表6 各組大鼠肝臟脂肪變性及炎癥變化（±s，n=8）

表6 各組大鼠肝臟脂肪變性及炎癥變化（±s，n=8）

注：與A組比較，#P＜0.05；與B組比較，*P＜0.05；與C組比較，aP＜0.05。

炎癥0.00±0.00 2.92±0.50#1.00±0.35*1.59±0.47a*2.04±0.38a*組別A組B組C組D組E組脂肪變性0.00±0.00 3.49±0.48#1.02±0.20*1.78±0.37a*2.46±0.14a*

2.3 各組大鼠血清和肝臟TG變化

與A 組比較，B 組大鼠血清及肝組織TG 含量均顯著增高（P＜0.05），與B 組比較，C 組、D 組、E 組大鼠血清及肝組織TG 含量均顯著降低（P＜0.05）；血清TG 含量方面，與C 組比較，D 組顯著增高，E 組無顯著差異；肝臟TG 含量方面，與C 組比較，D、E 組無顯著差異，見表7。

表7 各組大鼠血清和肝臟TG變化（±s，n=8）

表7 各組大鼠血清和肝臟TG變化（±s，n=8）

注：與A組比較，#P＜0.05；與B組比較，*P＜0.05；與C組比較，aP＜0.05。

組別A組B組C組D組血清TG（mmol·L-1）0.59±0.15 2.8±0.48#0.82±0.20*1.53±0.37a*肝臟TG（mmol·gprot-1）0.29±0.06 0.93±0.16#0.20±0.08*0.24±0.07*E組0.91±0.14*0.30±0.08*

2.4 各組大鼠血清AST和ALT變化

與A 組比較，B 組大鼠血清AST 和ALT 水平顯著升高（P＜0.05）；AST 水平方面，與B 組比較，C 組、D 組、E 組顯著降低（P＜0.05），與C 組比較，D 組、E 組無顯著差異；ALT 水平方面，與B 組比較，D 組、E 組顯著降低（P＜0.05），C 組無明顯差異，與C 組比較，D 組、E 組顯著降低（P＜0.05），見表8。

表8 各組大鼠血清AST和ALT變化（±s，n=8）

表8 各組大鼠血清AST和ALT變化（±s，n=8）

注：與A組比較，#P＜0.05；與B組比較，*P＜0.05；與C組比較，aP＜0.05。

血清AST（U·L-1）15.40±8.19 55.29±27.49#26.94±11.55*15.01±9.49*26.48±10.38*組別A組B組C組D組E組血清ALT（U·L-1）17.37±11.17 44.14±13.53#38.98±14.91 22.07±13.45a*25.36±12.19a*

2.5 各組大鼠肝組織SOD、MDA及FFA的變化

與A 組比較，B 組大鼠肝組織MDA 和FFA 含量顯著升高（P＜0.05），SOD 含量顯著降低；MDA 方面，與B組比較，C 組、D 組顯著降低（P＜0.05），E 組無顯著差異，與C 組比較，D 組、E 組無顯著差異；FFA 方面，與B組比較，C 組、D 組、E 組顯著降低（P＜0.05），與C 組比較，D 組、E 組無顯著差異；SOD 方面，與B 組比較，C組、D 組、E 組無顯著差異，與C 組比較，D 組、E 組無顯著差異，見表9。

表9 各組大鼠肝組織SOD、MDA及FFA的變化（±s，n=8）

表9 各組大鼠肝組織SOD、MDA及FFA的變化（±s，n=8）

注：與A組比較，#P＜0.05；與B組比較，*P＜0.05。

FFA（mmol·L-1）127.42±42.36 512.85±103.27#363.55±50.86*325.29±70.29*340.44±68.22*組別A組B組C組D組E組MDA含量（nmol·mgprot-1）10.02±2.71 17.15±4.47#13.71±2.74*11.52±1.83*14.34±2.44 SOD活性（U·mgprot-1）118.82±21.02 94.27±24.62#105.10±13.64 97.77±22.16 97.10±23.60

2.6 各組大鼠肝組織CYP2E1 蛋白表達及CYP2E1 mRNA表達水平

與A 組比較，B 組大鼠肝組織CYP2E1 蛋白及CYP2E1 mRNA 表達水平明顯增強（P＜0.05），與B組比較，C 組、D 組、E 組 大 鼠 肝 組 織CYP2E1 蛋 白 及CYP2E1 mRNA 表達水平明顯減弱（P＜0.05），與C組比較，D 組大鼠肝組織CYP2E1 蛋白及CYP2E1 mRNA 表達水平明顯減弱（P＜0.05），E 組無顯著差異，見圖2 和表10。

圖2 各組大鼠肝臟組織CYP2E1 蛋白表達情況

表10 各組大鼠肝組織中CYP2E1 mRNA表達水平比較（±s，n=8）

表10 各組大鼠肝組織中CYP2E1 mRNA表達水平比較（±s，n=8）

注：與A組比較，#P＜0.05；與B組比較，*P＜0.05。

CYP2E1 mRNA 1.27±0.92 7.18±3.83#3.29±1.27*1.15±0.56*a 2.14±0.97*組別A組B組C組D組E組

3 討論

肝臟是碳水化合物、蛋白質、脂肪合成與水解的重要場所，任何引起脂肪代謝紊亂的因素都有可能導致肝臟脂肪異位堆積，產生脂肪肝。其中，NAFLD 發展迅速，易從單純性脂肪肝演變成脂肪性肝炎、肝硬化等，甚至可能惡化成肝癌，對人類健康、生命安全有嚴重威脅。與此同時，近年來，NAFLD 在我國的發病率逐年上升，且有年輕化的趨勢，這就進一步凸顯了NAFLD研究的重要性。

目前，醫學界普遍公認的NAFLD 發病機制為Day等[20]提出的“二次打擊”學說。第一次打擊主要是肝細胞脂肪變；第二次打擊是發生脂質過氧化反應、氧化應激等改變，引起脂肪性肝炎，再進展為肝纖維化、肝硬化等[21-22]。第一次打擊中胰島素抗脂解作用受到障礙，肝細胞的甘油三酯合成增加、攝取FFA 增多，導致肝臟脂肪變性。第二次打擊是由于脂質代謝紊亂而引起氧化應激和脂質過氧化反應，造成肝細胞損傷和炎癥反應[23]。CYP2E1 是肝臟代謝過程的主要酶系之一，在NAFLD 發病過程中CYP2E1 是參與脂質代謝的重要代謝酶[24]。肝細胞內FFA 含量的增多導致CYP2E1 活性增加，引起肝臟脂肪變、炎癥、壞死及纖維化等[25-26]。NAFLD 的發病過程中CYP2E1 的表達增強使MDA 含量升高，CYP2E1 與肝組織脂質代謝紊亂、炎癥及纖維化進程密切相關[27]。

高脂飼料加地塞米松腹腔注射誘導大鼠NAFLD模型，特點是地塞米松誘導后模型形成快，加上高脂飼料可以防治模型自愈，有利于藥效觀察[15]。本實驗采用此方法制作大鼠NAFLD 模型，第15 天開始肝組織出現明顯的脂肪變性，與正常組比較，模型組大鼠血清AST 和ALT 水平顯著升高，提示動物模型制作成功。

在NAFLD的臨床治療方面，目前使用較多的藥物包括胰島素增敏劑、減肥藥物、調血脂藥、肝細胞保護劑、抗氧化劑等，這些藥物均具有一定的臨床療效，但往往會導致患者出現一定的不良反應，如下肢水腫、肝臟毒性、轉氨酶增高等，進一步尋求安全性更高的治療手段非常必要[28-29]。

蒙藥優寧八味散（MMYBP）是內蒙古自治區國際蒙醫醫院制劑室配制的蒙藥傳統藥方，包含綠松石（制）、冰片、丁香、牛膽膏粉、人工麝香、葡萄干、木鱉子仁（制）、白檀香八味蒙藥，其中綠松石可清熱解毒、消炎止血，冰片可去翳明目、消腫止痛，丁香可溫中降逆、補腎助陽，牛膽膏粉為蒙醫特色專用品種，可平息希拉、愈傷、解毒，麝香可活血通經、消腫止痛，葡萄干可滋腎益肝，木鱉子仁具有消腫散結、祛毒等功效，白檀香可暢膈寬胸，溫胃散寒。諸藥結合，具有清熱解毒、助消化等作用，臨床多用于血希拉型肝膽疾病的治療，有著非常廣泛的應用，是為蒙藥名方。

MMYBP 在臨床上治療肝熱癥療效顯著，前期研究發現MMYBP 能改善CCl4模型小鼠肝損傷，但沒有MMYBP 治療高脂飼料結合地塞米松注射構建的NAFLD 動物模型的相關文獻報道，本研究采用高脂飼料結合地塞米松誘導NAFLD 大鼠模型，觀察MMYBP對NAFLD 模型大鼠相關指標的影響，結果發現，MMYBP組與NAFLD模型組大鼠比較，MMYBP組能明顯降低肝指數，恢復肝細胞形態，減輕肝細胞腫脹程度，血清和肝組織TG、MDA、FFA、CYP2E1水平均顯著降低，肝功指標ALT、AST水平顯著下降，提示MMYBP可以明顯改善NAFLD 預后，MMYBP 對NAFLD 模型大鼠能調控脂質代謝紊亂，具有降脂保肝等治療作用，其作用機制可能與MMYBP 調節 CYP2E1 表達、抑制氧化應激反應有關，其他相關靶點及信號通路仍需進一步研究[30-31]。

綜上所述，結合本次研究結果，可以認為MMYBP能降低NAFLD 脂質代謝相關CYP2E1 蛋白及CYP2E1 mRNA 的表達水平，改善肝功能及脂質代謝紊亂，對NAFLD 有降脂保肝的作用，延緩NAFLD 向肝纖維化及肝硬化進展，但其具體相關機制及靶點還有待進一步研究。