補腎固胎合劑通過調控PKA/CREB/AQP5通路改善流產模型大鼠子宮蛻膜組織及螺旋動脈血供的機制＊

甘雨娟，張迎春，2＊＊，蕭 閔，劉佳文，劉菏婧，潘 琴，徐瑤瑤

（1.湖北中醫藥大學第一臨床學院 武漢 430065；2.湖北省婦幼保健院 武漢 430064；3.湖北中醫藥大學中醫藥實驗中心 武漢 430065；4.湖北中醫藥大學中醫臨床學院 武漢 430065）

流產是指以妊娠不足28 周，胎兒體重不足1000 g而自然殞墮為臨床表現，與同一性伴侶連續發生至少2次以上的自然流產，包括連續發生的生化妊娠，稱為復發性流產（Recurrent spontaneous abortion，RSA），其中連續3次以上的流產患者再次妊娠流產率高達40%-80%[1-2]。RSA 病因復雜，在育齡婦女中的發病率已達到1%-5%，給患者生活和身心健康帶來了不同程度的危害，現代醫學認為其已知病因主要包括胚胎因素如染色體、卵泡發育、胎盤異常及母體因素如感染、血栓前狀態、免疫等[3]。臨床上多采用口服或肌注黃體酮等黃體支持法，低分子肝素抗凝或聯合潑尼松、羥氯喹抗炎等藥物治療RSA[4]，但是有一定的副作用，如肝素會影響母體肝功能。而中藥治療RSA 副作用小，臨床療效確切[5-7]。

補腎固胎合劑是由經典方“壽胎丸”（《醫學衷中參西錄》）及“膠艾湯”（《金匱要略》）加減化裁而成[8-9]。本課題組前期臨床研究結果示補腎固胎合劑保胎效果顯著提升，療效優于西藥治療[7]，但機制不清。目前研究已發現，水通道蛋白（Aquaporins，AQPs）功能異常可能是導致流產、羊水量異常、胎兒畸形和胎兒生長受限等潛在病理因素，而AQPs 也成為治療妊娠相關疾病的潛在靶點[10]。近期動物實驗研究顯示壽胎丸可上調部分AQPs 表達水平，使母胎界面水液轉運得以調節平衡，以維持妊娠[11]。同時AQPs的表達異常也會導致子宮螺旋動脈（Spiral artery，SpA）重組障礙。為此，本實驗通過觀察補腎固胎合劑對羥基脲片聯合米非司酮誘導的流產模型大鼠子宮蛻膜組織中磷酸化蛋白激A（Phosphorylated protein kinase A，p-PKA）/蛋白激酶A（Protein kinase A，PKA）、磷酸化cAMP 反應元件結合蛋白（cAMP response element binding protein，p-CREB）/cAMP 反應元件結合蛋白（Cyclic adenosine monophosphate response element binding protein，CREB）、水通道蛋白5（Aquaporin 5，AQP5）、血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）的蛋白表達情況以及螺旋動脈生理性重鑄變化，以進一步揭示補腎固胎合劑的保胎機制。

1 材料

1.1 實驗動物

將SPF 級SD 大鼠90 只（雌:雄=2:1），雌鼠體質量240-260 g，雄鼠體質量290-310 g，將同性別大鼠分籠適應性喂養7 天。在湖北中醫藥大學動物實驗中心SPF 級動物房飼養，維持室溫20-22℃、相對濕度維持在50%-70%左右，12 h 光暗交替，常規喂養。本實驗大鼠于三峽大學實驗動物中心購入，許可證號：SCXK（鄂）2020-0018，經湖北中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準后進行（HUCMS202107004）。

1.2 實驗主要藥物及試劑

中藥補腎固胎合劑由菟絲子、桑寄生、續斷、當歸、熟地黃、白芍（各15 g），川芎、黨參、黃芪、阿膠、艾葉、黃芩、砂仁、甘草（各10 g）組成，所有飲片均購于湖北省婦幼保健院中藥房，由湖北省婦幼保健院中醫科徐昕鑒定，在煎藥室煎煮，過程符合《醫療機構中藥煎藥室管理規范》，先加入自來水沒過草藥食指一橫指浸泡30 min 后煎煮第1 次，取出藥液；再加水煎煮，過濾藥渣提取藥液，與第1次藥液混勻，倒入蒸發器中得生藥含量為2.0 g·mL-1的湯劑，將溶液分別密封于無菌量瓶。

羥基脲片（批號：國藥準字H37021289,齊魯制藥有限公司），地屈孕酮片（批號:H20170221,公司:Abbott Biologicals B.V.），米非司酮（批號：H20033551，湖北葛店人福藥業有限公司），VEGF antibody（批號為19003-1-AP1:200，武漢三鷹生物技術有限公司），DNA斷裂的原位末端標記（TUNEL）法細胞凋亡檢測試劑盒（批號為11684817910，上海羅氏制藥有限公司），BCA蛋白定量分析試劑盒（批號為A53225，賽默飛世爾科技公司）；RIPA 裂解液、EDTA 抗原修復液(50X)（批號分別為P0013D、P0085，碧云天生物技術公司）；蛋白Marker（批號為26616，美國賽默飛世爾公司）、PKA 一抗（批號為12232-1-AP，三鷹生物技術有限公司）、p-PKA 一抗、CREB 一抗、AQP5 一抗（批號分別為AF8017、AF6188、AF5169，江蘇親科生物研究中心有限公司）、GAPDH一抗、p-CREB一抗（批號分別為ab8245、ab32096，艾博抗上海貿易有限公司）、HRP-山羊抗兔二抗、HRP-山羊抗鼠二抗（批號分別為E-AB-1003、E-AB-1001，伊萊瑞特生物）、山羊抗兔鼠通用二抗（HRP）（批號為K5007，上海睿鉑賽生物科技有限公司）。

1.3 實驗主要儀器

DYY-6C 型電泳儀、DYCZ-24 型電泳槽、DYCZ-40D 型轉膜槽（北京六一），Microfuge 26 型高速離心機（美國貝克曼庫爾特），RM2016 型病理切片機（上海徠卡），Enspire 酶標儀（珀金埃爾默），PANNORAMIC 型全景切片掃描儀（匈牙利3DHISTECH），NIKON ECLIPSE E100 型正置熒光顯微鏡、NIKON DS-U3 型成像系統（日本尼康）。

2 實驗方法

2.1 實驗動物造模、分組和給藥

參考梁程程等[11]的造模方法，具體如下：將大鼠以2:1 比例隨機合籠制備孕鼠60 只，合籠第2 天6∶00 顯微鏡下雌鼠陰道涂片可觀察到大量精子則作為妊娠第1 天，將孕鼠依其妊娠順序隨機分為6 組，每組10 只，分別為補腎固胎合劑組（低、中、高劑量），正常妊娠組、模型組及地屈孕酮組，除正常組，余下各每組孕鼠于妊娠1-9 天每天17∶00 予羥基脲片水溶液灌胃（450 mg·kg-1），妊娠第10 天10∶00 予米非司酮片水溶液灌胃（4.0 mg·kg-1）。妊娠第1-9 天每日9∶00，補腎固胎合劑低、中、高劑量組分別予補腎固胎合劑中藥液灌胃（0.5、1.0、2.0 g·kg-1）；地屈孕酮組予地屈孕酮水溶液灌胃（3.02 mg·kg-1），模型組和正常妊娠組予等量0.9%生理鹽水灌胃。補腎固胎合劑中劑量藥效等效于臨床用藥[7]。

2.2 取材與制備標本

各組孕鼠均于末次給藥24 h 后，以1%戊巴比妥鈉（50 mg·kg-1）腹腔注射麻醉大鼠，無菌條件下鈍性分離子宮壁，隨機選著床部位（5個），將胚胎及胎盤自著床部位剝脫，組織剪分離著床部位的蛻膜組織，PBS預冷后沖洗蛻膜組織，裝入無酶EP 管并置于-80℃冰箱凍存備用，剩余蛻膜組織洗凈后，迅速置于4%多聚甲醛中固定備用。

2.3 蘇木素-伊紅染色觀察各組孕鼠子宮蛻膜組織中螺旋動脈形態并測量管腔直徑及管壁厚度

取出多聚甲醛固定的蛻膜組織，脫水、包埋，放置石蠟切片機上制成4 μm 石蠟切片，切片脫蠟，蘇木素染色0.25 h，沖洗，分化，再沖洗，返藍，流水沖洗。切片依次入85% 和95% 乙醇脫水各5 min，再染色5 min，脫水后封片。切片用全景切片掃描儀全掃描，每組5 張，每張切片隨機測3 條螺旋動脈，用CaseViewer2.2RTM 進行觀察測量管腔直徑和管壁厚度，取平均值進行統計學分析。

2.4 TUNEL法檢測孕鼠子宮蛻膜組織蛻膜細胞凋亡

脫蠟前步驟同2.3 項，后蛋白酶K 覆蓋組織，37℃孵育15 min。PBS 洗3 次，后破膜液孵育10 min，PBS再洗3 次，取適量TdT 和dUTP（1∶9）混合后覆蓋組織，將切片于濕盒內平放，37℃恒溫孵育1 h，在避光環境下將玻片放置PBS 溶液中用脫色搖床晃洗3 次（每次5 min）。切片稍干后，滴入DAPI 染液，室內恒溫避光靜置10 min，最后再洗滌3 次，稍甩干后封片。紫外線下細胞核顯為藍色，使用FITC 標記，熒光顯微鏡下見到綠色熒光即為凋亡蛻膜細胞。

2.5 免疫組化學法（IHC）檢測蛻膜組織中血管內皮生長因子的表達

同2.3 項進行石蠟切片脫蠟，切片于抗原修復緩沖液中進行烤片30 min 抗原修復，3%雙氧水中孵育25 min，滴加3% BSA 封閉后，加入VEGF 抗體（稀釋比為1:200）4℃孵育過夜，脫色洗滌加入HRP 室溫孵育50 min 后，進行DAB 顯色；浸入蘇木素染液復染，沖洗，分化，再沖洗，返藍，流水沖洗，脫水，樹膠封片。利用圖像采集系統采集并分析結果。蘇木素染細胞核為藍色，DAB中陽性表達為棕黃色。

2.6 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測各組孕鼠子宮蛻膜組織中p-PKA、PKA、p-CREB、CREB、AQP5 的蛋白表達情況

取各組子宮蛻膜組織50 mg，剪成小塊置于無酶EP 管中，加入適量裂解液勻漿，冰浴30 min 后離心（4℃ 12 000 r·5 min-1），收集上清液。使用BCA檢測蛋白濃度，制膠、灌膠、點樣、電泳、轉膜，將條帶分別放入PKA、p-PKA、CREB（1∶1000）、p-CREB（1∶2500）一抗稀釋液中，4℃孵育過夜，用TBST 洗5 次后置于HRP-山羊抗兔二抗、HRP-山羊抗鼠二抗（1∶3000）稀釋液中，繼而孵育、TBST 用ECL 化學發光試劑盒進行發光檢測，系統顯影，Image J 分析條帶灰度值。AQP5與GAPDH 相 比 較，p-PKA 與PKA 比 較，p-CREB 與CREB比較相對灰度值即為相對表達量。

2.7 統計學方法

圖片采用CaseViewer2.2軟件，數據采用SPSS 26.0軟件分析。若數據正態分布、方差齊性，運用單因素方差分析（ANOVA）；若數據不符合正態分布或者方差不齊，用非參數檢驗；結果采用均值 ± 標準差（±s）表示，P＜0.05表示有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 對流產大鼠蛻膜組織中螺旋動脈的影響

HE染色后，CaseViewer 測量顯示，與正常組相比，模型組的螺旋動脈平均管腔直徑顯著降低（P＜0.01），管壁厚度顯著升高（P＜0.01），與模型組相比，地屈孕酮組和補腎固胎合劑高、中、低劑量組的螺旋動脈平均管腔直徑顯著上升（P＜0.01），管壁厚度顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），與地屈孕酮組相比，補腎固胎合劑低劑量組螺旋動脈平均管腔直徑較低（P＜0.01），高劑量組較高（P＜0.05），中劑量組無明顯差異（P＞0.05），補腎固胎合劑低劑量組螺旋動脈平均管壁厚度較低（P＜0.05），高、中劑量組螺旋動脈管壁厚度接近，無明顯差異（P＞0.05），見表1和圖1。

圖1 各組典型螺旋動脈HE染色圖（×400）

表1 各組大鼠蛻膜組織螺旋動脈的管腔直徑及管壁厚度（±s，n=10）

表1 各組大鼠蛻膜組織螺旋動脈的管腔直徑及管壁厚度（±s，n=10）

注：與正常組比較，aP＜0.05，aaP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01；與地屈孕酮組比較，cP＜0.05，ccP＜0.01。

管壁厚度（μm）6.44±1.82bbc 10.50±1.19aac 8.43±1.19ab 8.79±0.61aab 8.18±1.25abb 6.43±0.85bbc組別正常模型地屈孕酮補腎固胎合劑高劑量補腎固胎合劑中劑量補腎固胎合劑低劑量螺旋動脈數量（條）45 45 45 45 45 45管腔直徑（μm）58.97±6.96bbc 24.37±3.90aacc 50.61±4.55abb 57.61±8.19bbc 49.02±3.29aabb 32.82±2.84aabbcc

3.2 對流產大鼠子宮蛻膜組織蛻膜細胞凋亡及VEGF蛋白表達的影響

VEGF 主要表達在蛻膜細胞胞漿中，且在蛻膜中陽性染色強。與正常組相比較，模型組大鼠子宮蛻膜組織VEGF 表達量顯著降低（P＜0.01），與模型組比較，地屈孕酮組和補腎固胎合劑高、中、低劑量組VEGF表達量顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）。與地屈孕酮組相比較，補腎固胎合劑高、中劑量組VEGF表達量顯著升高（P＜0.01），低劑量組VEGF 表達量較低（P＜0.01）（見表2和圖2）。

圖2 補腎固胎合劑對各組孕鼠鼠子宮蛻膜組織VEGF蛋白表達的影響（IHC，×200）

表2 補腎固胎合劑對流產大鼠子宮蛻膜組織蛻膜細胞凋亡及VEGF蛋白表達的影響（±s，n=10）

注：與正常組比較，aP＜0.05，aaP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01；與地屈孕酮組比較，ccP＜0.01。

組別正常模型地屈孕酮補腎固胎合劑高劑量補腎固胎合劑中劑量補腎固胎合劑低劑量劑量（g·kg-1）--0.003 25 2 1 0.5陽性細胞率（%）1.72±0.19bbcc 15.80±0.25aacc 4.30±0.12aabbcc 4.20±0.28aabb 0.55±0.07aabbcc 9.09±0.51aabbcc VEGF/平均光密度值0.130±0.002bb 0.090±0.006abcc 0.120±0.004bbcc 0.190±0.018aabbcc 0.150±0.008aabbcc 0.100±0.001aabcc

TUNEL 法檢測細胞凋亡：熒光下細胞核顯藍色，凋亡細胞為綠色。與正常組比較，模型組大鼠子宮蛻膜組織 TUNEL 陽性細胞明顯增多（P＜0.01）；與模型組比較，補腎固胎合劑高、中、低劑量組及地屈孕酮組TUNEL 陽性細胞率顯著降低（P＜0.01）；與地屈孕酮組比較，補腎固胎合劑中劑量組陽性細胞數顯著減少（P＜0.01），低劑量組顯著增多（P＜0.01），高劑量組無明顯差異（P＞0.05），見表2和圖3。

圖3 補腎固胎合劑對各組流產大鼠子宮蛻膜組織蛻膜細胞的凋亡影響（IF，×200）

3.3 對流產大鼠子宮蛻膜組織p-PKA/PKA、p-CREB/CREB、AQP5的影響

與正常組比較，模型組流產大鼠子宮蛻膜組織p-PKA/PKA、p-CREB/CREB、AQP5 的相對表達量均顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，地屈孕酮組和補腎固胎合劑高、中、低劑量組流產大鼠子宮蛻膜組織p-PKA/PKA、p-CREB/CREB、AQP5 表達顯著升高（P＜0.01）。與地屈孕酮組比較，補腎固胎合劑量高、低劑量組p-PKA/PKA、p-CREB/CREB、AQP5 相對表達量降 低（P＜0.05，P＜0.01），中 劑 量 組p-PKA/PKA、p-CREB/CREB 表達水平無明顯差異（P＞0.05），AQP5 相對表達量較低（P＜0.01），見表3和圖4。

圖4 各組孕鼠子宮蛻膜組織PKA、p-PKA、CREB、p-CREB和AQP5蛋白表達電泳條帶

表3 補腎固胎合劑對流產大鼠子宮蛻膜組織p-PKA/PKA、p-CREB/CREB和AQP5蛋白表達的影響

4 討論

RSA 屬于祖國傳統醫學“滑胎”的范疇，其發病機制為沖任虛損、胎元不固，病因多責之于脾腎虧虛，氣血兩虛兼有血瘀、血熱、肝郁，治療當以補腎健脾為主，配以活血化瘀、清熱涼血、解郁理氣安胎[12]。補腎固胎合劑由“壽胎丸”及“膠艾湯”加減化裁而成，方中熟地黃滋陰，菟絲子、續斷、桑寄生補腎固沖，白芍、黨參、黃芪養血益氣，當歸、川芎活血化瘀，阿膠養血止血，艾葉溫經散寒、調經安胎，黃芩、砂仁安胎，甘草調和諸藥，與白芍相須緩急止痛。全方共奏補腎安胎、養血活血、益氣固沖之效。張迎春教授運用此方治療腎虛氣血兩虛之滑胎近30年，臨床療效確切[5-7]。現代藥理學研究發現壽胎丸及膠艾湯中藥效成分具有雌孕激素類似樣作用，并且可以抑制子宮平滑肌收縮，同時還具有抗炎、調節免疫的作用[13]。此外地屈孕酮作為孕激素的替代藥，也能夠抑制子宮平滑肌收縮及誘導淋巴細胞生成孕酮誘導組織因子調節母胎免疫來延長妊娠天數，是孕早期的常用藥[14]。白芍中的山奈酚、β-谷甾醇，當歸中的豆甾醇，川芎中的川芎哚和菟絲子中的檞皮素、異鼠李素這些藥理成分能雙向調節胎盤生長因子及炎癥因子水平，在調節滋養細胞功能、增強子宮內膜血管通透性、改善盆腔血供、子宮內膜容受性，調節母胎免疫微環境等多方面促進胚胎著床及妊娠維持[15]。

SpA 是母體向胎兒輸送營養物質的管道，研究發現RSA 患者早期螺旋動脈重組障礙，表現為SpA 管腔狹窄、管壁增厚、重鑄異常、胎盤形成受阻等，進而導致胚胎缺血、缺氧引起一系列病理妊娠，在臨床上，子宮螺旋動脈血流動力學參數值是反映孕期胚胎血供的重要指標[16]。本實驗結果顯示：地屈孕酮組和補腎固胎合劑組大鼠SpA 平均管腔直徑均大于模型組，管壁厚度均小于模型組，這與臨床上SpA 重組障礙表現一致，給予補腎固胎合劑及地屈孕酮干預后，SpA管腔直徑增大，管壁變薄，這提示補腎固胎合劑可以有效促進SpA重鑄,改善子宮血供。VEGF是一種多功能因子，在胚胎發育過程中參與胚胎血管生成及調節血管通透性，激活胚泡著床[17-18]。本實驗免疫組化結果顯示，補腎固胎合劑可上調孕鼠蛻膜組織中VEGF 的蛋白表達量，提高SpA 生理性重鑄率，達到改善子宮血供的目的。

AQPs 作為水和中性分子通過生物膜的孔道，廣泛分布于與液體分泌吸收密切相關的上皮及內皮細胞內。迄今在哺乳動物體內已發現共有13種AQP（0-12），有研究證實雌性大鼠懷孕期間，AQP5 的表達要高于其他AQP 亞型[19-21]。AQP5 是一個橫跨質膜的四聚體，其氨基酸序列含有PKA 潛在磷酸化位點，當PKA 被第二信使cAMP 激活后，活化的PKA 可促進CREB 絲氨酸133 號位點磷酸化，磷酸化的CREB 與細胞核內的環磷酸腺苷反應元件結合蛋白（CREB buliding protein，CBP）特異性結合后大幅度增加CREB轉錄活性并誘導AQP5基因的轉錄及蛋白的合成[22-25]。AQPs 表達異常導致細胞水平衡障礙，滋養細胞侵襲障礙及凋亡，影響正常胎盤的植入活動，導致胎盤形成障礙[10][26]。絨毛外滋養細胞在胚胎植入母體蛻膜后，侵襲到蛻膜取代SpA 血管內皮細胞完成胎盤血管的重建，以維持妊娠[27]。本研究結果顯示，模型組子宮蛻膜組織p-PKA/PKA、p-CREB/CREB 的表達水平明顯降低，地屈孕酮片與補腎固胎合劑分別干預后，結果逆轉且補腎固胎合劑中劑量組效果最佳。此外，在給予地屈孕酮后，p-PKA/PKA、p-CREB/CREB 蛋白表達與補腎固胎合劑中劑量組相比無顯著差異，這可能與地屈孕酮治療流產的藥理作用有關。與正常組相比，模型組的TUNEL 陽性細胞增多，表明流產大鼠子宮蛻膜組織的蛻膜細胞凋亡途徑激活。給予補腎固胎合劑干預后，TUNEL 陽性細胞顯著減少，提示補腎固胎合劑可更有效地通過AQP5 調節水液平衡來抑制蛻膜細胞的凋亡改善孕鼠子宮血供。

綜上所述，補腎固胎合劑可有效地改善流產模型大鼠子宮供血，降低病理性妊娠率，機制可能是通過調控子宮蛻膜組織中PKA-CREB 通路及AQP5，以達到調節水液平衡、促進螺旋動脈生理性重鑄，母胎界面血管新生改善微循環，抑制蛻膜細胞凋亡的作用。需要指出的是，補腎固胎合劑為中藥復方，有多成分、多靶點特性，本研究僅初步探索PKA-CREB 通路以及AQP5 其對流產大鼠子宮血供的影響，作用機制仍有待進一步闡明。因此，后續實驗將采用CREB 抑制劑繼續深入研究，進行反向證明補腎固胎合劑對流產大鼠子宮供血和安胎的作用機制，以期更嚴謹的結論。