基于Fas/Fas L通路探討象皮生肌膏對肛瘺術后模型大鼠創面細胞凋亡的影響＊

劉 穎，余 煉，尹園緣，詹 敏，鄒巍瑩，黃靜雯，程 揚，賓東華＊＊

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學 長沙 410208）

肛瘺是指肛管直腸在感染、損傷、異物、疾病等因素影響下所形成的與肛門周圍皮膚相互貫通的一種感染性管道，臨床表現為肛旁腫痛難忍、破潰流膿等，反復發作，經久不愈，可發于任何年齡，以20-40 歲青壯年相對高發[1]。有調查顯示[2]，我國城市居民肛腸疾病發病率已達51.14%，肛瘺的發病率為0.43%?；诟亻T部的特殊生理及解剖學特點，手術是目前肛瘺的首選治療方式[3]。瘺管手術后的糞便污染是不可避免的，易導致的傷口愈合延遲，不僅給患者帶來了沉重的身心、經濟負擔，更是給肛腸外科醫生帶來了巨大挑戰[4]。因此，如何快速且有效地促進肛瘺術后創面愈合具有重要的臨床意義。已有研究表明，凋亡機制見于創面修復的各個階段，且創面愈合的快慢、優良等均與修復過程中細胞凋亡與增殖之間的平衡關系密不可分[5-7]。

象皮生肌膏為湖南中醫藥大學第一附屬醫院院內制劑，以清末醫家張山雷《瘍科綱要》之經典膏方象皮膏為基礎方化裁而來，內含象皮、當歸、生地黃、血余炭、醋龜甲等成分，具有活血化瘀、祛腐生肌的功效，廣泛應用于我院多種創面修復，生肌效果顯著。課題組前期研究表明，象皮生肌膏能有效減輕肛瘺患者術后疼痛、水腫等癥狀，縮短創面愈合時間，具有良好的臨床效果[8-10]。而通過動物實驗研究發現該機制可能與提高創面組織中轉化生長因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）的表達水平，降低白介素-8（Interleukin-8，IL-8）、腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）表達水平相關[11-12]。細胞凋亡已被證實與創面修復關系密切，而Fas/Fas L 通路作為細胞凋亡的經典外源性信號途徑在針對肛瘺術后創面修復的相關研究中暫未見報道。為進一步探究象皮生肌膏促肛瘺術后創面愈合的作用機制，本研究擬從細胞凋亡相關通路及調控因子著手，通過構建肛瘺術后創面大鼠模型，觀察象皮生肌膏對肛瘺術后大鼠創面愈合及細胞凋亡相關調控因子的影響，以期為象皮生肌膏的臨床應用提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 動物

選取36 只雄性SPF 級健康 Sprague-Dawley 大鼠，體質量200-220 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2019-0004。所有動物均飼養于湖南中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物中心，溫度24-26℃，相對濕度50%-70%。本實驗操作經湖南中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物倫理委員會批準（倫理編號：ZYFY20211104-04）。

1.2 藥物

象皮生肌膏（湖南中醫藥大學第一附屬醫院制劑室制備，湘藥制字Z20070276，藥品批次20211212）。

1.3 主要試劑與儀器

Fas抗體、Fas L 抗體、Caspase-8抗體（湖南豐暉生物科技有限公司，貨號分別為 Fab5301、Fab5305、Fab1938）；Cytochrome c（136F3）抗 體（美 國Cell Signaling technology公司，貨號#4280T）；HRP標記山羊抗兔IgG、HRP 標記的山羊抗大鼠IgG、山羊抗小鼠二抗、DAB顯色試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號分別為GB23303、GB23302、G1214-100UL、G1212-200T）；TUNEL 試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，貨號C1090）；蘇木素-伊紅染色液（廣州維格斯生物科技有限公司，貨號3201121）；TRIpure（北京百泰克生物技術有限公司，貨號RP1001）；BeyoRT II MMLV 反轉錄酶（上海碧云天生物技術有限公司，貨號D7160L）；RNase Inhibitor（生工生物工程（上海）股份有限公司，貨號B600478）；2×Taq PCR MasterMix（北京索萊寶科技有限公司，貨號PC1150）；SYBR Green（北京索萊寶科技有限公司，貨號SY1020）。

生物組織攤烤片機（武漢俊杰電子有限公司，型號JK-6）；生化培養箱（上海一恒儀器公司，型號LRH）；石蠟切片機（德國萊卡公司，型號RM2235）；全自動病理切片掃描儀（匈牙利3DHIESTECH 公司，型號Pannoramic MIDI II）；CaseViewer 2.4 掃描瀏覽軟件（匈牙利3DHIESTECH 公司）；超速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，型號H-2050R）；真空干燥箱（上海SYSBERY 儀器有限公司，型號DZF-6050）；紫外分光光度計（美國Thermo 公司，型號NANO 2000）；熒光定量PCR 儀（韓國Bioneer 公司，型號Exicycler 96）。

2 方法

2.1 動物模型的建立

2.1.1 肛瘺模型的建立

適應性喂養1周后，36只SD大鼠予以構建肛瘺模型，實驗步驟參照本課題組前期相關研究[13]。SD 大鼠采用2%戊巴比妥鈉以40 mg·kg-1的劑量腹腔注射麻醉。待麻醉生效后，使用脫毛膏脫除大鼠肛周毛發，絡合碘清潔并消毒肛周手術區域。大鼠取俯臥位，取50 mL 注射器針頭，自大鼠肛門緩慢進入，穿過括約肌，針尖抵達據肛緣約1 cm 處，自9 點位肛緣皮膚穿出（時鐘定位法），退出注射器針頭，沿針頭所致的通道放置直徑約2 mm 的不銹鋼鋼絲，將鋼絲尾端扭轉固定，放置30天。

2.1.2 肛瘺術后創面模型的建立

鋼絲掛線留置30 天后，隨機選取27 只造模成功的肛瘺大鼠進一步構建肛瘺術后創面模型。麻醉生效后，使用0.1%絡合碘消毒大鼠肛周手術區域，隨后沿鋼絲進行“瘺管切除術”，術后無菌棉球壓迫止血，創面保持開放，將大鼠放回飼養盒，后續自由飲食，觀察大鼠存活情況。剩余9只肛瘺模型大鼠持續鋼絲掛線留置，不予以特殊處理。

2.2 分組及給藥

27 只肛瘺術后創面模型SD 大鼠被隨機分為以下3組：象皮生肌膏組、凡士林組、模型組，每組9只；剩余9 只肛瘺模型大鼠則納入假手術組。創面模型建立次日，各組進行創面給藥，給藥前各組均予以絡合碘消毒，生理鹽水沖洗。象皮生肌膏組采用象皮生肌膏紗條覆蓋創面；凡士林組采用凡士林紗條覆蓋創面，后各組均蓋上醫用無菌敷料加以固定。模型組絡合碘消毒，生理鹽水沖洗后蓋上醫用無菌敷料固定。假手術組無特殊處理。每日給藥干預1 次，連續給藥干預10天。

2.3 創面愈合率

使用數碼相機于干預后第3、5、7、10天，拍攝創面愈合情況，同時使用0.5 cm×0.5 cm 透明方格面積測量器測定創面面積，與造模的初始創面面積進行比較，獲得各組創面動態愈合率。創面愈合率（%）=（初始創面面積-干預后第n天的面積）/初始創面面積×100%。

2.4 動物取材

給藥干預10 天后，次日在2%戊巴比妥鈉麻醉下取各組創面肉芽組織，假手術組在行“瘺管切除術”后取瘺管下創面組織，取材后的部分標本置于4%多聚甲醛固定，部分標本液氮速凍后置于-80℃冰箱保存用于進一步檢測。所有大鼠取材后均遵循動物倫理福利處死。

2.5 指標檢測

2.5.1 蘇木素-伊紅（Hematoxylin eosin，HE）染色檢測創面組織病理變化

取創面組織標本石蠟切片，將切片脫蠟至水用于染色。隨后將切片經蘇木素染色、1%鹽酸乙醇分化、碳酸鋰返藍、伊紅染色。后經乙醇脫水，二甲苯透明，將切片用中性樹膠封固。使用Pannoramic MIDI II 全自動病理切片掃描儀掃描玻片，CaseViewer2.4 掃描瀏覽軟件查看玻片并采集病理圖片，觀察組織病理變化。

2.5.2 TUNEL染色法檢測創面組織中細胞凋亡數目

創面組織石蠟切片經充分脫蠟和水化后，滴加20 μg·mL-1不含DNase 的蛋白酶K，于37℃下處理20 min。PBS 充分漂洗，滴加制備的50 μL TUNEL 檢測液，37℃避光孵育60 min。PBS 洗滌3 次，滴加DAPI染核，室溫避光孵育5min，PBS 洗滌后抗熒光淬滅封片液封片。切片置于顯微鏡下進行觀察，可見凋亡細胞的細胞核呈綠色熒光，其他細胞核呈藍色熒光。使用病理切片掃描儀、CaseViewer軟件對玻片進行掃描、觀察并采集圖片，采用Image J軟件，計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=凋亡細胞數÷細胞總數×100%。

2.5.3 免疫組織化學（Immunohistochemistry，IHC）法檢測創面組織中Fas、Fas L、caspase-8、cyto-c 蛋白的表達

將石蠟切片經脫蠟及水化后，置于盛有檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）的修復盒中，微波爐中加熱進行修復抗原，8 min后拿出，冷卻至室溫，PBS 洗滌。將切片置于3% H2O2溶液室溫孵育10 min，PBS沖洗。在切片中滴加5%羊血清，室溫封閉20 min，PBS 洗滌。滴加稀釋的一抗，4℃孵育過夜。復溫洗滌后滴加100 μL 二抗，37℃孵育30 min，PBS 沖洗。滴加新鮮配制的DAB顯色液顯色，于顯微鏡下控制顯色時間，陽性染色為棕黃色。將切片用蘇木素復染，返藍液返藍，蒸餾水洗滌，經脫水、透明、封片后于顯微鏡下觀察。使用全自動切片掃描儀掃描，在CaseViewer2.4 軟件進行觀察及圖像采集，圖片采用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析、統計IOD值。

2.5.4 實時熒光定量PCR（Real time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）法檢測創面組織中Fas、Fas L、cyto-c mRNA的表達

取創面組織充分研磨后加入1 mL TRIpure裂解液，混勻后靜置5 min，加入200 μL 氯仿，充分混勻后靜置3 min，4℃ 12000 r·min-1離心10 min。取無色的水相于離心管，加入異丙醇，-20℃下過夜。4 ℃ 2000 r·min-1離心10 min，棄上清；加入1 mL 75%乙醇，4℃ 7000 r·min-1離心3 min，棄上清，靜置5-6 min。加30 μL RNase-free ddH2O，靜置2 min，使充分混勻溶解，由此得到樣本總RNA。使用紫外分光光度計測定樣本RNA 濃度。對得到的RNA 樣本進行反轉錄得到對應的cDNA，隨后進行實時熒光定量PCR 分析。反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，共40 個循環；72℃ 1.5 min，40℃ 1 min，60℃-94℃ 1℃·s-1，25℃ 1 min。以β-actin 為內參。利用2-△△CT方法分析數據。引物由通用生物股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列

2.6 統計學分析

數據分析采用SPSS 25.0軟件，作圖采用GraphPad Prism 9.3軟件，實驗數據以均值±標準差（±s）表示。多組間比較采用單因素ANOVA 分析。P＜0.05 為具有統計學意義。

3 結果

3.1 造模情況

肛瘺造模期間各組大鼠未見死亡，參加造模的大鼠于肛周觸及條索樣管道，并可見膿性樣分泌物，提示各組均造模成功。肛瘺術后創面模型造模期間各組大鼠未見死亡，各組造模成功。故實驗結束時每組9只大鼠均存活，均納入統計。

3.2 創面愈合情況比較

象皮生肌膏組、凡士林組和模型組大鼠藥物干預后3、5、7、10 天的創面情況見圖1，創面愈合率比較見表2。與模型組相比，象皮生肌膏組及凡士林組在干預后7、10天時顯著促進傷口愈合（P＜0.01），且象皮生肌膏組創面愈合率明顯高于凡士林組（P＜0.01）。

表2 象皮生肌膏對肛瘺術后大鼠創面愈合率的影響（±s，n=9，%）

表2 象皮生肌膏對肛瘺術后大鼠創面愈合率的影響（±s，n=9，%）

注：與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01；與凡士林組相比，&P＜0.05，&&P＜0.01。

干預后10 d 84.44±2.95##&&77.16±2.51##68.71±3.52組別象皮生肌膏組凡士林組模型組干預后3 d 17.14±1.16 16.53±1.19 16.32±1.14干預后5 d 29.08±2.25 28.25±1.45 27.86±1.69干預后7 d 50.26±2.08##&&47.21±1.89##44.02±2.35

圖1 象皮生肌膏對肛瘺術后大鼠創面愈合的影響

3.3 傷口組織病理學變化比較

HE 染色結果如圖2所示，象皮生肌膏組創面組織可見膠原纖維、成纖維細胞排列整齊，致密，組織中少量炎性細胞浸潤，可見較成熟血管形成，未見組織出血，創面修復良好。凡士林組大鼠創面組織病理切片中可見新生肉芽組織形成，周圍伴有較多炎性細胞浸潤，創面修復程度低于象皮生肌膏組。模型組大鼠創面可見細胞排列紊亂，有明顯組織出血及炎性細胞浸潤。

圖2 各組肛瘺術后大鼠創面組織病理學變化（HE，×200）

3.4 創面組織中細胞凋亡數目比較

細胞凋亡情況見圖3、圖4，與假手術組相比，象皮生肌膏組、凡士林組、模型組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，象皮生肌膏組、凡士林組細胞凋亡率顯著降低（P＜0.01）；與凡士林組相比，象皮生肌膏組細胞凋亡率顯著降低（P＜0.01）。

圖3 各組大鼠創面組織細胞凋亡情況（TUNEL染色，×200）

圖4 各組大鼠創面組織細胞凋亡情況（±s，n=3）

3.5 創面組織中Fas、Fas L、caspase-8、cyto-c 蛋白的表達

免疫組化結果如圖5、圖6所示，與假手術組相比，模型組、象皮生肌膏組、凡士林組創面組織中Fas、Fas L、caspase-8、cyto-c蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，象皮生肌膏組、凡士林組Fas、Fas L、caspase-8、cyto-c 蛋白表達水平顯著下降（P＜0.01）；與凡士林組相比，象皮生肌膏組Fas、Fas L、caspase-8、cyto-c蛋白表達水平顯著下降（P＜0.01）。

圖6 各組大鼠創面組織Fas、Fas L、caspase-8、cyto-c蛋白的表達情況（±s，n=3）

3.6 創面組織中Fas、Fas L、cyto-c mRNA 的相對表達量

RT-PCR 結果如圖7 所示，與假手術組相比，模型組、象皮生肌膏組、凡士林組創面組織中Fas、Fas L、cyto-c mRNA 表達水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組相比，象皮生肌膏組、凡士林組Fas、Fas L、cytoc mRNA 表達水平顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）；與凡士林組相比，象皮生肌膏組Fas、Fas L、cyto-c mRNA 表達水平下降（P＜0.05）。

圖7 各組大鼠創面組織Fas、Fas L、cyto-c mRNA相對表達量（±s，n=3）

4 討論

中醫對肛瘺有“肛漏”“痔漏”“穿腸漏”等稱謂，認為其因濕熱下注，局部氣血淤滯所致，早于《五十二病方》中便載以“牽引切除法”，為外科手術治療肛瘺的雛形[14]。至今肛瘺無法通過藥物根治，國內外醫生仍將手術作為肛瘺的根治手段[15]。而因部位的特殊性，肛瘺術后創面不予以縫合，呈開放性，在排便污染、局部感染等因素的影響下，術后創面多愈合緩慢，使得患者飽受痛苦，因此，尋求有效的方法以促進術后創面快速愈合始終是研究的熱點。近年來諸多文獻報道，中藥外用具簡、便、廉、驗等優勢，并通過發揮多環節、多靶點、多層次的綜合作用，可有效促進術后創面愈合[16-19]。

中醫學理論認為肛瘺術后局部經絡血肉受損，氣血運行受阻，加之濕熱未盡，導致創面肌膚筋肉氣血虧虛，無以為養，新肉難生，創面難愈，故肛瘺術后應注意補氣活血，化瘀止痛，祛腐生肌[20]。本實驗所采用的象皮生肌膏屬祛腐生肌之代表性方藥，由象皮、當歸、生地黃、血余炭、醋龜甲、生石膏、爐甘石等藥物組成，方中象皮止血止痛、斂瘡生肌，爐甘石、生石膏清熱解毒，當歸補血活血、生肌止痛，血余炭化瘀止血，生地清熱養陰、涼血止血，龜甲益腎養血，諸藥配伍合用以達清熱解毒、活血化瘀、祛腐生肌之效。本研究顯示：與模型組相比，象皮生肌膏組及凡士林組在干預后7、10天時顯著促進傷口愈合，且象皮生肌膏組創面愈合率明顯高于凡士林組，病理學結果顯示象皮生肌膏組創面組織炎性細胞少，膠原纖維和成纖維細胞排列較整齊，致密，創面修復情況優于模型組及凡士林組，表明象皮生肌膏可有效促進肛瘺術后創面愈合。

細胞凋亡作為機體重要的細胞死亡形式之一，存在于創面修復的全過程，通過平衡細胞生長并消除已經完成特定任務的細胞群，而不會引起組織損傷或炎癥反應，推動創面愈合的進展[21]。創面愈合通常分為四大重疊且有序的階段：止血期、炎癥期、增殖期和重塑期[22]，其中增殖期是創面愈合的關鍵時期，通過細胞的快速增殖、遷移，新生肉芽組織逐漸去除炎癥，填補創口缺損，繼而老化形成瘢痕組織，使創面得以愈合。若增殖期肉芽組織中的細胞過度凋亡，則會導致愈合延遲，甚至不愈合，因此，通過調控肉芽組織中的細胞凋亡，或可達到促進術后創面快速愈合的目的[23-25]。本研究結果顯示：與假手術組相比，象皮生肌膏組、凡士林組、模型組細胞凋亡率顯著升高；與模型組相比，象皮生肌膏組、凡士林組細胞凋亡率顯著降低；與凡士林組相比，象皮生肌膏組細胞凋亡率顯著降低，表明象皮生肌膏可通過抑制創面組織細胞的凋亡，從而促進創面愈合。

凋亡信號的傳遞涉及到一連串的復雜級聯反應，其中典型的死亡受體Fas 介導的凋亡通路及線粒體/細胞色素C（Cytochrome C，cyto c）介導的凋亡通路為調控細胞凋亡的重要內外途徑[26]。當Fas與配體Fas L結合，Fas 通過三聚化激活并與Fas 相關死亡域蛋白（Fas-associatingviadeath domain，FADD）結合，使得Caspase-8/10 被 募 集，從 而 形 成 由Fas、FADD 和caspase-8/10 組成的死亡誘導信號復合物（Deathinducing signaling complex，DISC），從而導致Procaspase-8激活，進而引發Caspase 級聯反應，最終導致細胞凋亡。而cyto c 是凋亡內部信號傳導通路的關鍵調控因子，當細胞凋亡信號的刺激使cyto c 從線粒體內釋放到細胞質，cyto c 與細胞凋亡激活因子1（Apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1）結合募集并激活caspase-9，進而活化下游的效應子Caspase，引起細胞凋亡。此外，激活的Caspase-8 可以切割促凋亡蛋白Bid 為tBid，tBid 移位至線粒體，進而導致cyto c 介導的凋亡通路激活，使得內在及外在凋亡途徑有效串聯，擴大了凋亡信號[27-31]。本研究結果顯示：與假手術組相比，模型組、象皮生肌膏組、凡士林組創面組織中Fas、Fas L、cyto-c mRNA 相對 表 達量及Fas、Fas L、Caspase-8、cyto-c 的蛋白表達水平顯著升高；與模型組相比，象皮生肌膏組及凡士林組Fas、Fas L、cyto-c mRNA相對表達量及Fas、Fas L、caspase-8、cyto-c蛋白表達水平顯著下降；與凡士林組相比，象皮生肌膏組Fas、Fas L、cyto-c mRNA 相對 表達量及Fas、Fas L、caspase-8、cyto-c蛋白表達水平顯著下降，表明象皮生肌膏可通過抑制Fas/Fas L 通路的激活，抑制細胞凋亡，利于創面愈合。

綜上所述，本研究證實象皮生肌膏能抑制肛瘺術后創面細胞凋亡，促進創面愈合，其作用機制可能與抑制Fas/Fas L通路的激活有關。