納米材料固定化植酸酶的制備及其催化效率與影響因素綜述

楊曉莉，毛佳璇，馬露冉，徐其靜，劉雪*

1. 西南林業大學生態與環境學院，云南 昆明 650224；2. 西南林業大學環境修復與健康研究院，云南 昆明 650224

磷（P）是植物生長發育大量必需營養元素，而無機磷肥進入土壤后，極易被土壤固相吸附或與鈣（Ca）、鎂（Mg）、鐵（Fe）、鋁（Al）等金屬離子結合形成難溶性或不溶性化合物，導致生物有效性極低，僅有～10%可被植物吸收利用，導致大量磷在土壤中固定和積累（Xiao et al.，2005），且在物理、化學及生物等作用下活化和遷移，易引起潛在水體和面源污染風險（Withers et al.，2014）。此外，磷的生產原料—磷礦石為不可再生資源，磷被稱為“正在消失的營養”（Vance，2001）。由此，提高土壤內源磷的利用率具有重要的現實意義。有機磷是土壤磷的重要組成部分，占總磷的20%—80%（魯芳，2020），是植物生長所需磷素的巨大儲備庫（Liu et al.，2018）。土壤有機磷主要以植酸（肌醇六磷酸；myo-inositol hexakisphosphate）及其鹽類形式存在，占有機磷的50%—80%（劉雪，2017）。植酸可被專一性酶——植酸酶礦化水解，經脫磷酸化過程釋放無機磷（MacDonald et al.，2011），供植物吸收利用。微生物和植物根系分泌的植酸酶進入土壤后，易受土壤吸附、溫度、pH 值、金屬離子等影響，導致酶活性降低甚至失活。因此，提高植酸酶在土壤中的穩定性和活性是發揮其催化作用的重要前提。目前，可通過固定化、酶修飾和基因工程等提高酶的穩定性（Popat et al.，2011），其中固定化技術操作簡便、快速、經濟易得等優勢而被廣泛應用。

通過將酶固定于載體表面或孔內，可保持或提高酶的穩定性和催化活性（Hoarau et al.，2017）。固定化的負載率及固定后酶的穩定性和活性取決于載體特性（Wang et al.，2009），特別是納米基材的類型和性質（Ushasree et al.，2012）。殼聚糖、羥基磷灰石、氧化石墨烯和介孔二氧化硅等納米基材已廣泛應用于酶的固定化（Wahab et al.，2020）。酶的固定化技術主要包括物理和化學方法（Guo，2019），不同固定化方法對酶的酶學特性（活性、穩定性、選擇性、特異性和重復使用性）具有不同影響（Xu et al.，2016；Ziegler-Borowska et al.，2017），可通過吸附力、共價鍵、離子鍵、交聯和包封等提高酶的穩定性和活性，亦可通過改變酶的構型和構象調控酶的選擇性（Hanefeld et al.，2013；Wang et al.，2022）。

近年來，隨著對植酸酶研究的逐漸深入，關于其在農業領域的應用已引起關注。但由于植酸酶來源及酶學性質等差異性造成其實際應用的局限性，主要表現為熱穩定性差和活性低。如何提高植酸酶在土壤中的催化活性，本文基于前期研究，通過綜述植酸酶和納米材料的來源與特性，重點闡述納米材料固定化植酸酶的制備技術、負載率、穩定性、活性與表征方法，以及實際應用效率與影響因素等研究進展。綜述內容可為提高土壤有機磷的生物利用率、降低外源磷肥施用、降低土壤磷流失及水體污染風險提供理論依據和技術支撐，為植酸酶功能的深入挖掘并應用于農業生產實踐及保障生態環境安全提供參考。

1 植酸酶和納米載體的來源與特性

1.1 植酸酶的來源與特性

植酸酶來源于微生物和植物，其中，微生物植酸酶易于生產和分離提純、產量高、pH 值和溫度適應范圍廣（2.0—8.5、20—80 ℃）且活性高（811—1 800 U·mg-1），是植酸酶的主要來源（孫臨泉等，2011；Greiner，2017）。植酸酶通過脫磷酸化過程將植酸水解為無機磷和肌醇（圖1），提高磷的生物有效性（Rousseau et al.，2020）。植酸酶水解植酸產生的釋磷量占土壤可提取態磷的48%—55%（Liu et al.，2022），對土壤中磷素供應具有重要作用。植酸酶在土壤改良、植物營養、環境治理、動物飼料添加劑、食品工業等領域具有廣泛應用（Menezes-Blackburn et al.，2011）。植酸酶作為土壤改良劑，可提高土壤內源植酸磷的利用率（楊曉莉等，2023）。然而，實際應用過程中植酸酶活性極易受溫度、pH 值、金屬離子等的影響，導致其穩定性降低、活性降低甚至失活。因此，通過固定化或負載技術制備緩釋型植酸酶制劑，利于提高植酸酶的環境穩定性及推廣應用。

圖1 固定化植酸酶礦化水解植酸釋放無機磷供植物吸收利用Figure 1 Immobilized phytase hydrolyzes phytate to release inorganic P for plant utilization

1.2 納米載體的來源與特性

目前用于植酸酶固定化的納米基材主要包括無機（羥基磷灰石、氧化石墨烯、介孔二氧化硅、氧化鋁、活性炭和沸石）（Mohamad et al.，2015）、有機（殼聚糖、聚丙烯酰胺、環氧樹脂、纖維素、合成聚合物、藻酸鹽和淀粉瓊脂）（Elias et al.，2017；Ureta et al.，2021）和可溶性基質（聚乙烯醇）三類（Pragya et al.，2023）。其中，殼聚糖、羥基磷灰石、氧化石墨烯和介孔二氧化硅等納米基材應用最廣泛。

殼聚糖是從蝦蟹殼等海洋生物質廢物中，將生物質進行化學降解和酶水解提取得到的生物高分子吸附材料（宋俊穎等，2019；羅華麗等，2021），具有無毒、抑菌、生物相容性和生物降解性好等特點（Song et al.，2020）。亦是從幾丁質中通過堿性脫乙酰化獲得的陽離子多糖（Rahimi et al.，2019），殼聚糖陽離子可與陰離子或帶負電荷的蛋白質、脂質、DNA 結合形成聚合物，殼聚糖納米粒已用作活性成分蛋白質、DNA、siRNA、藥物等的固定化載體（Kamat et al.，2015）。此外，與游離酶相比，殼聚糖納米粒固定化酶表現出更廣泛的pH 值和溫度穩定性（Verma et al.，2016），故殼聚糖在酶固定化方面已得到廣泛應用（Wardhani et al.，2019）。羥基磷灰石是脊椎動物骨骼、牙齒及自然界礦物中廣泛存在的吸附能力強的無機礦物（Sun et al.，2017；Liao et al.，2020），具有結構穩定性好、成本低、無毒、無刺激性、表面積大、富含羥基、較好的生物活性和生物相容性等優勢（Sun et al.，2013；Xie et al.，2017；洪杰等，2021），亦是常用的酶固定化材料，其結構中的Ca2+易被二價金屬離子替換（張連科等，2018），因此吸附能力和離子交換能力較強（Cui et al.，2014），常用作化學反應催化劑載體（Wang et al.，2007）。

石墨烯是以一個碳原子與周邊3 個鄰近碳原子結合成的六邊蜂窩結構的單層碳原子，結構穩定具有較好的延展性和機械強度（Solís-Fernández et al.，2017；曾洪亮等，2021），應用于生物傳感器、藥物載體和納米復合材料等領域（Verma et al.，2018；Zhang et al.，2019）。氧化石墨烯作為石墨烯的重要含氧衍生物，其表面和內部含有大量羥基、羧基等含氧官能團（Zhang et al.，2020），具有較大的比表面積、較好的分散性、吸附性、環保性、生物相容性和緩釋功能等特性（Han et al.，2013；Che et al.，2013），是聚合物納米材料重要的基材，亦是酶固定化的納米級材料。介孔二氧化硅來源于天然無機化合物，存在于沙子、石英或燧石中，形狀各異，如凝膠、晶體和無定形（Sapawe et al.，2018）。目前，農業過程產生的原料（稻殼、麥草和玉米芯等）中二氧化硅含量高，生產成本低、快速、簡單，產出的介孔二氧化硅純度高、孔體積大、比表面積高、單分散且相對穩定（Patel et al.，2017），同時介孔二氧化硅基材納米材料具有無毒、硬度高、耐酸堿、穩定性好、透光性好、絕緣性好等特點，亦具有化學和生物惰性，根據酶分子的大小，介孔材料孔徑可調，因而成為一種優良的酶固定化載體（Maity et al.，2017），在生物催化劑、藥物載體及生物酶吸附中應用廣泛（Yang et al.，2015；陳康等，2022）。近年來，殼聚糖、羥基磷灰石、氧化石墨烯和介孔二氧化硅基材納米載體已廣泛用作生物催化劑和酶固定化的載體。

2 納米材料及固定化植酸酶的制備技術

2.1 不同納米材料載體的制備技術

納米載體具有較大的比表面積和體積比，且酶與納米載體的結合效率高，可實現對植酸酶的高效負載（Qamar et al.，2022）。以殼聚糖及其衍生物為基材的納米材料載體制備方法主要包括噴霧干燥法、離子交聯法和乳化交聯法等（Cota-Arriola et al.，2013）。羥基磷灰石納米材料的制備方法主要為水熱法（Jin et al.，2015）、沉淀法（Mobasherpour et al.，2007）和固相反應法（郭效軍等，2012）。氧化石墨烯納米復合材料的制備方法主要為原位聚合法、溶液共混法和熔融共混法（張雷等，2020）。納米介孔二氧化硅制備方法包括軟模板法、硬膜板法和自模板法等（李雨露等，2020）。通常根據粒子大小和形狀、熱穩定性、活性成分的釋放時間和最終產物的殘留毒性等選擇適宜的制備方法（Cota-Arriola et al.，2013）。不同納米材料的常用制備方法及其外觀特征與優缺點如表1 所示。

表1 不同納米材料制備方法Table 1 Preparation methods for different nanomaterials

2.2 不同納米材料固定化植酸酶的制備技術

通過負載、包埋等方式，固定化可提高酶的環境穩定性和活性，是商業植酸酶應用最為廣泛的酶保護技術，常用的植酸酶固定化技術包括吸附、共價結合、包埋、交聯、負載等（圖1）（Jain et al.，2016；Singh，2016；Verma et al.，2019）。固定化植酸酶的負載率及其活性和穩定性受固定化載體特性、植酸酶特性、制備方法、表征技術等的影響（Dwevedi et al.，2016），需根據酶的特性和生物催化反應（酶水解）選擇載體和固定化方法（表2）。

表2 不同納米材料固定化植酸酶的制備技術、負載率及機理Table 2 Synthesis techniques, loading ratio and mechanisms of different immobilized phytases

殼聚糖具有多種幾何構型（粉末、薄片、水凝膠、膜、纖維等）及豐富的活性官能團（–NH2、–COOH），通過與蛋白質或碳水化合物結合將植酸酶固定化（Cipolatti et al.，2014）。例如，采用離子凝膠法將商業植酸酶包埋到殼聚糖納米粒內部（圖1），負載率為69.2%，載藥量為18 mg·g-1（錢浩，2021）（表2）。采用共價結合法將地芽孢桿菌（Geobacillussp. TF16）植酸酶負載于殼聚糖內部，負載率為38%，酶活達3.4 U·g-1（Sirin et al.，2017）。殼聚糖微粒具有緩釋內部蛋白酶的能力，將植酸酶負載于內部，酶分子受外部環境的影響較小，對底物的作用時間增加，提高植酸水解效率，進而提高土壤磷的利用率、減少土壤中有機磷的殘留量。

羥基磷灰石作為酶的固定化材料，蛋白質吸附的基質，結構包括磷酸和鈣基團，與蛋白質的帶電基團發生靜電相互作用（吸附蛋白質的側基）（Ozhukil et al.，2015），其Ca2+也可以與酶氨基酸中的–COOH 發生螯合反應，產生高度穩定的固定化作用（Coutinho et al.，2018）。亦可以通過Cu2+、Zn2+、Ni2+或Co2+等金屬離子在固體載體上與蛋白質電子供體基團氨基酸（組氨酸、半胱氨酸、色氨酸和精氨酸）的選擇性相互作用（Coutinho et al.，2020a），提高酶的吸附能力。羥基磷灰石納米?？煽焖傥竭M而固定黑曲霉（A.niger）植酸酶，植酸酶通過與羥基磷灰石上存在的Ca2+與植酸酶表面的天冬氨酸和谷氨酸殘基的–COOH 側鏈螯合建立離子吸附，其植酸酶的吸附率達到100%，載藥量為5 mg·g-1（Coutinho，2020b）。黑曲霉（A.niger）植酸酶通過共沉淀法吸附在載體上的負載率為70%，最大蛋白量為4.5 mg·g-1，植酸酶固定在純羥基磷灰石上的吸附率更高（6 mg·g-1），酶活達118 U·g-1（Coutinho et al.，2020c）。由此，羥基磷灰石作為酶固定化載體其作用機理簡單、負載率和酶活高，且可以提供鈣源和磷源，在工業、醫藥及農業領域具有潛在應用價值。

氧化石墨烯表面富含含氧官能團，蛋白質通過物理吸附或化學鍵固定在氧化石墨烯上（Wang et al.，2011），酶分子與氧化石墨烯表面官能團（環氧化物、羥基和羧基）通過靜電相互作用快速固定，是納米結構材料酶固定化的理想載體（Zhang et al.，2010）。Dutta et al.（2017）采用吸附-交聯法將枯草芽孢桿菌（B.subtilis）植酸酶固定在氧化石墨烯納米載體上，其負載率為74.2%，酶活達3.3 U·g-1。介孔二氧化硅的通道較短、開放、暢通易于酶吸附，其開放孔道（100 nm）易裝載大量生物大分子物質，植酸酶（直徑4—10 nm）可快速吸附，進入內表面（Kao et al.，2014）。Xin et al.（2020）采用物理吸附法將商業植酸酶固定在單分散的介孔二氧化硅納米粒上，其植酸酶負載量為237 mg·g-1，酶活達9.53 U·g-1。因此，氧化石墨烯、介孔二氧化硅通過物理吸附將酶固定化于載體表面及微孔內，是經濟、簡便的酶保護技術，且負載率和活性較高，可開發其在酶載體行業的潛在價值。

2.3 納米材料固定化植酸酶的表征方法

植酸酶固定化的表征方法較多，不同的固定化技術對應不同的表征方法。目前，大量研究將酶的動力學研究與傅里葉紅外光譜（FTIR）、掃描電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）、原子力顯微鏡（AFM）、圓二色性光譜（CD）、熱重分析（TGA）、差示掃描量熱法（DSC）、拉曼光譜、紫外-可見光譜等技術相結合，用于研究納米材料附著酶的功能和結構等特性，以及表征植酸酶的固定化。不同納米材料固定化植酸酶負載率、酶活性的表征方法及結果如表2 所示。

3 納米材料固定化植酸酶的催化水解效率

3.1 納米材料固定化植酸酶的水解效率

殼聚糖納米粒具備一定緩釋內部蛋白酶的能力，可延長蛋白酶對底物的作用時間，從而提高水解效率。Onem et al.（2016）用磁鐵礦-殼聚糖固定辣乳菇（L.piperatus）植酸酶和游離植酸酶對谷物和豆類外殼的植酸進行水解效率分析，結果表明，固定化酶對作物中植酸的水解效率高于游離酶，表現為玉米（47.1%和53.3%）、小麥（65.7%和75.0%）、花生（67.5%和75.4%）、綠色小扁豆（36.5%和48.3%）、豌豆（56.8%和68.9%）（表3），該固定化酶可作為面包制作、植物蛋白水解產物制備和谷物麩皮分解的添加劑。將鱷梨（P.americanaMill）植酸酶固定于環氧樹脂，用于豆類中植酸的水解，60 ℃反應8 h 后，固定化酶與游離酶的水解效率分別為65%和56%（?elem et al.，2009a）。用藻酸鈣固定釀酒酵母（S.cerevisiae）植酸酶水解植酸，酶活達93.9 mU·g-1，反應1 h 后水解率為50%，固定化酶和游離酶對植酸鹽的降解量分別為653 g·g-1和378 g·g-1。固定化酶在植酸降解方面更有效，較游離酶而言植酸降解率提高了170%（In et al.，2017）。固定化酶具有更全面的應用，如用作生物傳感器、作為植物肥料，以及作為外源無機磷的來源（Belho et al.，2021）。

3.2 納米材料固定化植酸酶的水解效率和釋磷量

植酸酶與殼聚糖納米粒結合后，對催化反應溫度的敏感性下降，因此固定化植酸酶比游離植酸酶更加穩定，且磷的釋放量增強。例如，錢浩（2021）研究表明，在相同酶活前提下，殼聚糖固定化酶相較于游離酶更穩定，且釋磷量由1.03 mg提高至1.86 mg，干物質消化率由58.8%提高至60.4%。Coutinho et al.（2020a）用羥基磷灰石固定植酸酶，研究水解特定底物植酸（150 U·g-1）的性能，在37 ℃反應2 h 后，固定化酶和游離酶水解釋磷量為 168 μmol·mL-1和149 μmol·mL-1。以富含植酸的豆粕為底物，在55 ℃（pH=5）時研究游離植酸酶和固定化植酸酶的水解效率，游離酶與固定化酶水解豆粕釋磷量為7.35 μmol·mL-1和 7.92 μmol·mL-1（Coutinho et al.，2020d），固定化酶具有良好的活性，在動物飼料、農業以及降低豆粕中的植酸含量中具有較大應用潛力。

介孔二氧化硅顆粒固定化植酸酶能有效的水解土壤中植酸鹽，釋放植物可吸收利用的無機磷酸鹽。Trouillefou et al.（2015）報道了介孔二氧化硅固定黑曲霉（A.niger）植酸酶對植物磷營養的作用，負載植酸酶能有效地水解植酸鹽，并將無機磷酸鹽輸送到植物的生長中，從而在根和芽中積累新的有效磷。負載酶催化活性相較于游離酶提高，其正磷酸鹽的釋放量由0.18 μmol 提高至302 μmol；添加植株培養30 d 后，游離酶正磷酸鹽的釋放量由0.3 μmol 提高至4.7 μmol；負載酶正磷酸鹽的釋放量由15.7 μmol 提高至154 μmol。添加負載酶植物根系的干質量相較于游離酶由4.5 mg 提高至7.4 mg，添加負載酶植株磷積累量約為每株10 μmol，是對照（4.2 μmol）的約2.5 倍，可見負載酶提高了植物對土壤有機磷的利用，為植酸酶制劑的開發和土壤磷庫在集約化農業生產中的利用提供依據。

4 納米材料固定化植酸酶酶活性的影響因素

4.1 pH 值

pH 對植酸酶的催化活性有重要影響，殼聚糖納米粒在對植酸酶進行固定化時，殼聚糖納米粒與植酸酶蛋白之間形成的氫鍵使植酸酶蛋白的三維構象更加穩定，植酸酶蛋白對外界環境的敏感性降低，從而導致在堿性條件下固定化酶的穩定性強于游離酶，固定化酶隨環境pH 值升高活性下降的趨勢小于游離酶（錢浩，2021）（表3）。例如，Kamaci et al.（2020）用聚乙烯醇殼聚糖納米纖維固定豇豆（V.unguiculata）植酸酶，研究植酸酶pH 值（pH=2.0—9.0）的穩定性，固定化酶的最適pH 值較游離酶堿性更強（6.0 和5.0），在pH 值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 時，游離酶和固定化酶的酶活性分別為46.9%和65.8%、55.8%和71.3%、78.8%和72.1%、100.0%和77.5%、74.4%和100.0%、63.1%和76.6%、8.8%和71.3%、0.17%和61.7%，在pH=7.0 時游離酶的催化活性急劇降低，pH=9.0時幾乎已失活，而固定化酶活性變化較小，且酶活高于游離酶。因此，殼聚糖固定化植酸酶的pH 穩定性提高，酶的催化活性增強。植酸酶作為磷酸水解酶，通常在酸性條件下較為穩定，而固定化酶的pH 穩定性提高。Onem et al.（2016）用磁鐵礦-殼聚糖固定辣乳菇（L.piperatus）植酸酶，研究植酸酶pH 值（pH=3.0—9.0）的穩定性，固定化酶的最適pH 值較游離酶酸性更強（4.0 和5.0），在pH=3.0時，游離酶與固定化酶的剩余酶活分別為46%和82%；在pH=9.0 時，游離酶與固定化酶的剩余酶活分別為45%和70%，故殼聚糖固定化植酸酶的pH值穩定性提高。Awad et al.（2015）用藻酸鹽固定紫原青霉（PenicilliumpurpurogenuGE1）植酸酶，固定化酶的最適pH 值較游離酶酸性更強（4.0 和5.5），在pH=4.0 下反應45 min，固定化酶與游離酶的剩余酶活分別為100%和54%；2 h 時，固定化酶的活性降低到約60%，而游離酶已失活。植酸酶在藻酸鹽納米載體上固定化后，固定化酶酶活的pH值穩定性提高，酶催化活性增強，在工業、農業領域中具有很大的應用潛力。

4.2 溫度

植酸酶是一種熱不穩定生物活性酶，受溫度的顯著影響。酶的溫度穩定性取決于其三維結構及構象完整性，構象完整性越好，則穩定性越好。酶/納米纖維通過納米纖維表面–OH 與植酸酶中中的自由–C=O 和–NH 基團形成強氫鍵形成穩定交聯（Rathnayake et al.，2018）。Kamaci et al.（2020）利用聚乙烯醇殼聚糖納米纖維固定豇豆（V.unguiculata）植酸酶，研究植酸酶的溫度（25—95 ℃）穩定性，發現固定化酶的最適溫度較游離酶升高20 ℃（65 ℃和45 ℃），其游離酶在低溫（60 ℃）下的催化活性高于高溫（70—95 ℃），在60 ℃時游離酶的活性急劇降低至45%，95 ℃時酶幾乎失活剩余酶活為10%；而固定化酶催化活性在25—65 ℃的溫度范圍內增加，在65 ℃后逐漸降低，95 ℃時剩余酶活性為65%，固定化植酸酶的溫度穩定性提高，且固定化后植酸酶的催化活性增強。Coutinho et al.（2020d）用羥基磷灰石納米粒固定黑曲霉（A.niger）植酸酶，研究植酸酶的溫度（20—90 ℃）穩定性。固定化酶的最適溫度較游離酶升高10 ℃（60 ℃和50 ℃），將游離酶和固定化酶在60—90 ℃反應3 h，游離酶和固定化酶在60 ℃和70 ℃下都是穩定的。游離酶在反應3 h 后相對活性略有下降，在80 ℃和90 ℃反應20 min內完全失活，且降解過程是不可逆的；而固定化酶在80 ℃反應3 h 后剩余酶活為60%，在90 ℃反應20 min 后剩余活性為40%，隨著溫度的升高，固定化酶的酶活性升高，而游離酶的酶活性降低，且固定化后對溫度的穩定性增強。Dutta et al.（2017）用氧化石墨烯固定枯草芽孢桿菌（B.subtilis）植酸酶，與游離植酸酶相比，固定酶在42 ℃時酶活性增加了2.4 倍；在60 ℃時，酶活性提高3.76 倍；在70、80 和85 ℃時，酶活性分別提高5.79、8.04 和20.3倍。Naghshbandi et al.（2018）用羧化多壁碳納米管固定大腸桿菌（Escherichiacoli）植酸酶，在80 ℃和90 ℃反應2 min，游離酶剩余活性由27%降至3%，固定化酶剩余酶活由51%降至33%。因此，納米材料固定化植酸酶酶溫度穩定性提高，酶的催化活性增強，可提供可觀的經濟效益，在生物醫學、生物感應、生物成像、藥物/基因遞送及組織工程等領域廣泛應用（張峰，2019）。

4.3 金屬離子

植酸酶與大多數金屬離子具有很強的螯合能力，因此金屬離子在植酸酶催化活性、生物功能中起著重要作用。金屬通過不可逆地掩蔽催化活性基團、變性蛋白質構象可與金屬離子輔因子競爭，是著名的酶活性抑制劑（Bohn et al.，2008；Hamada，2016）。金屬離子的作用各不相同，二價陽離子（如Co2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+和Ni2+）通常比單價陽離子（如Na+）具有更強的抑制性（Li et al.，2021）。例如，Onem et al.（2016）用磁鐵礦-殼聚糖固定化辣乳菇（L.pipatus）植酸酶研究金屬離子對固定化酶催化活性的影響，固定化酶對金屬離子的抗性比游離酶更強，Fe2+（189%和16.2%）、Co2+（105%和37.8%）、Mg2+（127%和72.9%）、Zn2+（100%和37.8%）。金屬離子對游離酶活性均有較強的抑制作用，而固定化酶活性有明顯的促進作用。Kamaci et al.（2020）研究金屬離子對豇豆（V.unguiculata）植酸酶催化活性的影響，固定化酶對Ag+的抗性比游離酶更強（113%和78%），Mg2+（108%）、Li+（107%）和Ca2+（112%）對固定化酶催化活性也增加。Hidayatullah et al.（2020）用藻酸鹽包封克雷伯氏菌（Klebsiella）植酸酶，研究表明金屬離子對包封酶的酶活高于游離酶，Ca2+（0.23 U·mL-1和0.049 U·mL-1）、Mg2+（0.22 U·mL-1和0.03 U·mL-1）、Fe2+（0.23 U·mL-1和0.08 U·mL-1）、Zn2+（0.228 U·mL-1和0.052 U·mL-1）。因此，固定化植酸酶對金屬離子具有抗性，且酶的催化活性增強，在食品、動物飼料和肥料領域有很大的應用潛力。

植酸酶在正電荷離子方面具有很高的螯合能力，Sharma et al.（2023）用藻酸鈣固定米曲霉（A.oryzae）植酸酶，研究金屬離子對植酸酶催化作用的影響，結果表明固定化酶活性促進作用強于游離酶。例如，Mg2+（135%和105%）、Cu2+（132%和117%）、Fe2+（122%和80%）、Na+（142%和126%）、Fe3+（118%和115%）和Ca2+（128%和114%），固定化酶對金屬離子的催化活性高于游離酶。Duru et al.（2021）用藻酸鈉固定豇豆（V.unguiculata）植酸酶研究金屬離子抗性，結果表明Ni2+（90%和79%）、Ba2+（182%和151%）、Ag+（190%和84%）對固定化酶的催化活性高于游離酶。因此，納米材料固定化植酸酶在金屬離子存在環境中的穩定性更強，在工業領域具有很高的應用價值。

5 結論與展望

磷的生物利用率低、植酸酶穩定性差和易失活等問題已引起廣泛關注，尤其是農業過程中植酸酶活降低甚至失活影響植酸鹽水解和磷釋放，通過將植酸酶固定在納米載體上提高其環境穩定性和活性，改善植酸酶的催化特性，產生更多肌醇和無機磷酸鹽，可為植酸酶應用于農業生產、提高土壤難利用態植酸磷的利用效率提供有效途徑，對降低外源磷肥施用和環境磷污染具有重要的現實意義。

納米材料輔助固定化技術用于開發穩定性植酸酶，植酸酶活性的提高有利于植酸的分解，開發穩定性植酸酶可以防止磷酸鹽積累導致的環境污染。納米基材的適當選擇是其應用成功的關鍵，固定化植酸酶在實際應用中仍具有一定局限性，為此，可加強以下幾方面研究：1）了解植酸酶的來源與特性，致力于篩選出穩定性好、活性高的產植酸酶微生物；2）篩選穩定性好、高效負載的固定化載體，并利用經濟、工藝簡單的技術制備納米級材料；3）研發快速、經濟的納米材料固定化植酸酶方法，提高固定化率和載藥量，降低固定化成本，解決在植酸酶生產、運輸、使用和儲存中保持酶活性的問題；4）將固定化植酸酶應用于土壤中作為土壤改良劑，水解土壤中絡合的植酸，緩解植酸在土壤中的各種弊端，將植酸作為植物生長的磷供給源進行利用，減少磷源肥料的施用，促進磷元素的循環利用。